Cd2+- or Hg2+-binding proteins can replace the Cu+-chaperone Atx1 in delivering Cu+ to the secretory pathway in yeast

AbstractCopper delivery to Ccc2 – the Golgi Cu+-ATPase – was investigated in vivo, replacing the Cu+-chaperone Atx1 by various structural homologues in an atx1-Δ yeast strain. Various proteins, displaying the same ferredoxin-like fold and (M/L)(T/S)CXXC metal-binding motif as Atx1 and known as Cu+-, Cd2+- or Hg2+-binding proteins were able to replace Atx1. Therefore, regardless of their original function, these proteins could all bind copper and transfer it to Ccc2, suggesting that Ccc2 is opportunistic and can interact with many different proteins to gain Cu+. The possible role of electrostatic potential surfaces in the docking of Ccc2 with these Atx1-homologues is discussed

Repliement des protéines et formation de fibres amyloïdes. Le cas de l'alpha-lactalbumine

Le repliement des protéines est un des problèmes centraux de la biologie. Il s'agit de comprendre comment la chaîne polypeptidique d'une protéine se replie pour acquérir sa structure tridimensionnelle biologiquement active. Il a été démontré dans les années 60 que la forme repliée de la protéine est le plus stable d'un point de vue thermodynamique et qu'il est défini par la structure primaire. La réaction de repliement correspond ainsi à la dernière étape de l'utilisation de l'information contenue dans l'ADN. Cependant, Il est possible que les protéines se replient mal et interagissent entre elles pour former des fibres amyloïdes. Ce sont des agrégats structurés impliqués dans plusieurs maladies comme la maladie d'Alzheimer, de Parkinson... Ces phénomènes sont étudiés ici dans le cas de l'alpha-lactalbumine, une protéine du lait qui possède un site de liaison pour le calcium. Le repliement est tout d'abord étudié en présence de métaux se liant au site du calcium. Ces expériences sont couplées à des expériences de dénaturation thermiques pour caractériser le rôle de la fixation des métaux sur les différents états de la protéine et son influence sur la cinétique de repliement.La réaction est ensuite caractérisée en absence d'ion métallique. Elle est alors beaucoup plus lente et complexe. Différentes techniques spectroscopiques sont utilisées. Les résultats obtenus permettent de proposer un schéma réactionnel selon lequel un état précurseur de fibres amyloïdes est transitoirement peuplé. Enfin, pour compléter cette étude, les effets des interactions entre protéines sur la formation de fibres amyloïdes ont été étudiés pour différentes concentrations en sel.Protein folding is one of the central questions of Biology. How does polypeptidic chain fold to its three-dimensional, biologically active, structure? Experiments done in the 60?s have shown that the folded form is the most stable one on a thermodynamic point of view. This form being defined by the primary structure of the protein, the folding reaction corresponds to the last step of the use of the information encoded in DNA. Proteins can sometimes misfold and form amyloid fibrils through intermolecular interactions. These structured aggregates are involved in several diseases such as Alzheimer?s disease, Parkinson diseases...These phenomenon's are studied here in the case of alpha-lactalbumin, a milk protein which possesses a calcium binding site. At first, the folding is monitored in presence of various metal ions that bind to the calcium site. These experiments are coupled with thermal unfolding experiments. They permit to precise the effect of metal ion binding on the different states of the protein and on the folding kinetics.The reaction is also monitored in the absence of metal ions with several biophysical methods. Then, the folding is much slower and intricate. A reaction scheme is drawn from the results. This scheme indicates that a state precursor of amyloid fibril is transiently populated during the reaction. Finally, the effect of intermolecular interactions on the formation of amyloid fibrils is characterized for different salt concentrations.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Approche biophysique de l'étude de l'insertion du domaine de translocation de la toxine botulique dans les membranes

Les neurotoxines botuliques (BoNTs), toxines les plus efficaces connues, sont responsables du botulisme. Elles inhibent la libération d acétylcholine aux jonctions neuromusculaires causant des paralysies flasques. Lors de l intoxication, la BoNT se lie à ses récepteurs à la surface des neurones, puis est internalisée par endocytose. L interaction de son domaine de translocation avec la membrane à l'intérieur de compartiments cellulaires acides permet le passage du domaine catalytique dans le cytosol. Le domaine de translocation de BoNT/A (Tm) a été exprimé à partir d un gène de synthèse. L insertion de Tm dans la membrane et son activité sont dépendantes du pH et apparaissent dès pH 5,5. Aucun changement de structure n'est détecté par spectroscopie. Cependant, la formation d'une structure quaternaire n'est pas exclue. L'activité de Tm est aussi sensible à la courbure de la membrane, ce qui pourrait permettre une régulation supplémentaire de sa fonction. L apomyoglobine appartient à la famille des protéines à repliement de type globine, comme certaines toxines bactériennes. Son interaction avec la membrane présente de fortes homologies avec celle du domaine de translocation de la toxine diphtérique. Ce processus à deux étapes (liaison puis insertion) est dépendant du pH et requiert le passage par un état partiellement replié. Pour chaque étape, les régions impliquées ont été localisées par des expériences d échanges Hydrogène/Deuterium analysées par spectrométrie de masse. La liaison à la bicouche se fait par une hélice amphiphile, puis une hélice hydrophobe intervient pour l insertion. Cette dernière n est accessible qu après formation de l état partiellement replié.Botulinum neurotoxins (BoNTs), the most potent known toxins, are responsible for botulism. They inhibit acetylcholine release at the neuromuscular junction, inducing a flaccid paralysis. Upon intoxication, BoNT binds to its receptor at the plasma membrane of neurons and is then internalized by endocytosis. Inside acidic compartments, the interaction of its translocation domain with the membrane drives the translocation of the catalytic domain into the cytosol. The translocation domain of BoNT/A (Tm) was expressed and produced using a synthetic gene. Its insertion and activity have been shown to be pH dependent and to occur below pH 5.5. No structural change could be detected by spectroscopy. However, the formation of a quaternary structure is still possible. The sensitivity of Tm activity to membrane curvature has been observed. This could be an additional control to its function. Apomyoglobin belongs to the globin fold family which counts several bacterial toxin domains as members. Its interaction with membranes shares some characteristics with that of the translocation domain of diphtheria toxin. It is a pH-dependent two-step process (binding and insertion) which requires the accumulation of a partially unfolded state. The protein parts involved in each step have been identified using Hydrogen/Deuterium exchanges analyzed by mass spectrometry. An amphipathic helix allows the membrane binding, and a hydrophobic helix is involved in the insertion step. The last helix becomes available upon formation of the partially folded state.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

L' étude du mécanisme du repliement des protéines par les méthodes biophysiques sur deux protéines modèles : l'a-lactalbumine et l'anhydrase carbonique B

Le repliement des protéines est un des problèmes centraux de la biologie. la dénaturation et le repliement des protéines de plus de cent acides aminés ne sont pas coopératifs et passent par l'accumulation d'états intermédiaires. La caractérisation structurale de ces intermédiaires est essentielle pour une meilleure compréhension de la réaction de repliement et des possibles déviations qui peuvent mener au développement de maladies graves. Les mécanismes de repliement et de dénaturation ont été étudiés pour deux protéines modèles: l'a-lactalbumine et l'anhydrase carbonique. Dans le cas de l'anhydrase carbonique, plusieurs intermédiaires ont été détectés pendant la dénaturation à l'équilibre dans différentes conditions. Ces intermédiaires diffèrent notamment par leur tendance à former des agrégats. Dans le cas de l'a-lactalbumine bovine, les effets des métaux sur les cinétiques de repliement ont été caractérisés en détail. les aspects thermodynamiques de la liaisor des métaux sur différents états intermédiaires de l'a-lactalbumine sont discutés. Ensuite, la résonance magnétique nucléaire et la spectroscopie infrarouge ont été associées pour étudier les changements de structures secondaires et tertiaires qui interviennent penda la réaction de repliement de l'a-lactalbumine. Une méthode de spectroscopie de corrélation a été utilisée pour permettre la comparaison des observations faites par les deux types de spectroscopie et pour une description très détaillée de tous les changements de structure impliqués dans la réaction.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

A possible regulatory role for the metal-binding domain of CadA, the Listeria monocytogenes Cd2+-ATPase

AbstractUsing the baculovirus/Sf9 expression system, we produced CadA and ΔMBD, a metal-binding domain, truncated CadA. Both proteins had the expected properties of P-type ATPases: ATP-induced Cd2+ accumulation, Cd2+-sensitive ATP and Pi phosphorylation and ATPase activity. ΔMBD displayed lower initial transport velocity as well as lower maximal ATPase activity than CadA. MBD truncation flattened the Cd2+ dependence of the ATPase activity and increased apparent Cd2+ affinity, suggesting a positive cooperativity between MBD and membranous transport sites. We propose that occupancy of MBD by Cd2+ modulates CadA activity

Structure, dynamique moléculaire et sélectivité de métallochaperones à cuivre et à mercure

Les métallochaperones à cuivre assurent l'acheminement des ions cu(i) dans la cellule. Ainsi, les protéines de la famille d'Atx1 et de merP, une chaperone à mercure, présentent une forte homologie de séquence et le même repliement. Cette thèse vise à mettre en évidence des propriétés dynamiques et structurales responsables de la sélectivite des métallochaperones pour le cu(I) ou le hg(II). Des simulations de dynamique moléculaire des métallochaperones à cuivre, Atx1 et Har1, et de merP, dans les formes apo, et liees au cu(I) ou au hg(II), ont révélé des caractéristiques dynamiques et énergétiques communes aux trois holoprotéines natives. Des interactions entre la boucle du site de chelation et deux autres boucles, ont été identifiées et varient d'un état lié à l'autre. Il pourrait définir une éventuelle sélectivite pour les métaux. La boucle du site de chelation montre une grande structuration en présence de métal, accompagnée d'une rigidification si ce métal est le métal natif. Les expériences d'absorption x du cu(I) chélaté par atx1 ont montré que le cu(I) possède toujours une géométrie trigonale dont les ligands sont les deux cystéines du site de chélation, et un ligand endogène ou exogène. Atx1 présente donc au cu(I) une géométrie qui lui est préférentielle. Cette propriété est un déterminant de la sélectivité au cu(I) par rapport à d'autres métaux. En présence de glutathion, le complexe atx1-cu(I) forme un homodimère binucléaire associé à deux molécules de glutathion. L'implication de ce ligand exogène est proposée comme un facteur de sélectivité in vivo d'atx1 pour le cu(I), et pourrait favoriser la reconnaissance par atx1 de sa protéine cible.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

CadA, the Cd2+-ATPase from Listeria monocytogenes, can use Cd2+ as co-substrate.

International audienceCadA is a membrane protein of the P-type ATPase family which is the major determinant of the resistance to Cd2+ in Listeria monocytogenes. During its catalytic cycle, CadA undergoes auto-phosphorylation from ATP at Asp398, which allows Cd2+ translocation across the membrane. In the reverse mode, Asp398 is phosphorylated from Pi. From the data obtained so far, the CadA catalytic mechanism is similar to that proposed for the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, the model of the P-type ATPase family. We show here that CadA is sensitive to two different ranges of Cd2+ concentration. The 0.1-10 microM range of added CdCl2 corresponds to Cd2+ binding at the transport site of unphosphorylated CadA which induces the reaction of the enzyme with ATP and impairs its reaction with Pi. The 0.1-1 mM range of added CdCl2 could correspond to Cd2+ binding to the transport site accessible from the extracellular medium. In addition, although it is widely accepted that the actual substrate of P-type ATPases is the MgATP complex, we show here that CadA can also perform its cycle in the absence of Mg2+, using CdATP in the place of MgATP at the catalytic site