Étude in vitro de l’effet antifalcémiant des globules rouges et de l’activité antioxydante d’extraits de la poudre de racines de Maytenus senegalensis Lam (Celestraceae)

La drépanocytose est une hémoglobinopathie largement répandue chez les populations africaines noires. Actuellement, très peu de traitements conventionnels existent sur le marché, d’où le recours à la médecine traditionnelle. Maytenus senegalensis est une plante prescrite par les tradipraticiens dans la prise en charge de la drépanocytose. L’activité antifalcémiante des extraits de la poudre de racines de Maytenus senegalensis a été étudiée dans ce travail. Après obtention de l’extrait hexanique par extraction à l’aide d’un Soxhlet, le marc est macéré dans de l’acétate d’éthyle puis dans du méthanol pour donner les extraits correspondants. L’activité des fractions a été évaluée sur des drépanocytes de type SS. Les activités antifalcémiantes les plus importantes ont été observées pour les fractions polaires du méthanol et de l’acétate d’éthyle avec des taux d’inversion de la falciformation respectivement de 77% et de 65% à 10 mg/mL. Les activités antioxydantes de M. senegalensis (CI50 = 0,195 ± 0,004 mg/mL) et de l’acide ascorbique (CI50 = 0,078 ± 0,002 mg/mL) ont été déterminées. Les pouvoirs antioxydants (PA) montrent que l’activité antiradicalaire de l’acide ascorbique (PA = 12,85) est 2,5 fois meilleure que celle de M. senegalensis (PA = 5,14). Les résultats de l’étude justifient l’utilisation traditionnelle des racines de Maytenus senegalensis dans la prise en charge de la drépanocytose.Mots clés : Hémoglobine, drépanocytose, Maytenus senegalensis, activité antifalcémiante, stress oxydant, radicaux libres, activité antioxydante

Détermination du débit de filtration glomérulaire au cours de la drépanocytose au Sénégal: Schwartz, Cockcroft et Gault, MDRD, CKD-EPI ou JSCCS ?

La détermination du Débit de Filtration Glomérulaire (DFG) est importante chez les drépanocytaires du fait qu’ils constituent un groupe de patients chez lesquels des atteintes rénales sont fréquemment décrites notamment l’hyperfiltration glomérulaire. Dès lors, à une époque où les calculateurs en ligne proposent simultanément différentes formules de détermination du DFG, il serait important d’évaluer au sein d’une population noire africaine drépanocytaire l’équivalence entre ces formules qui ont été développées et validées sur des populations caucasiennes et afro-américaines à DFG normal ou diminué. Ainsi cette étude avait pour but d’évaluer l’interchangeabilité des différentes formules de détermination du DFG en les appliquant à des drépanocytaires. Des enfants et adultes sénégalais drépanocytaires homozygotes ont été alors recrutés et leur DFG calculé. La fréquence de l’hyperfiltration glomérulaire et celle de l’insuffisance rénale ont été calculées à partir des résultats obtenus avec les formules de Schwartz et du CKD-EPI. La concordance des différentes formules a été évaluée avec la méthode Bland-Altman. Au total 56 adultes et 62 enfants ont été inclus dans l’étude. L’insuffisance rénale a été notée chez 1,78% des adultes et 9,68% des enfants ; l’hyperfiltration glomérulaire chez 66,10% des adultes et 25,8% des enfants. Par rapport aux formules de référence (CKD-EPI, Schwartz), tous les biais relevés étaient significativement différents de zéro à l’exception de celui de Cockcroftet Gault qui était statistiquement nul. Les limites de concordance étaient toutes inacceptablement larges par rapport aux limites attendues à l’exception de celles du CKD-EPI sans ajustement sur la race. Ainsi, la formule de Schwartz n’était pas interchangeable avec celle du JSCCS chez les enfants, tout comme celle du CKD-EPI ne l’était pas non plus avec celles du JSCCS, de Cockcroft, du MDRD ou du CKD-EPI sans ajustement sur la race chez les adultes drépanocytaires.   English title: Determination of glomerular filtration rate in sickle cell disease in Senegal: Schwartz, Cockcroft and Gault, MDRD, CKD-EPI or JSCCS? Determination of Glomerular Filtration Rate (GFR) is important in patients living with sickle cell disease (SCD) because they constitute a group of patients where kidney dysfunction is frequently described, in particular glomerular hyperfiltration. Therefore, at a time when online calculators simultaneously propose different formulas to estimate GFR, it would be important to evaluate in a black African population living with SCD the equivalence between these formulas which have been developed and validated on Caucasian and African American populations with normal or decreased GFR. Thus, the aim of this study was to evaluate interchangeability of different GFR formulas in a group of patients living with SCD. Homozygous Senegalese sickle cell children and adults were then recruited and their GFR computed using Schwartz and JSCCS in children, Cockcroft and Gault, CKD-EPI with and without adjustment for ethnicity, MDRD and JSCCS formulas in adults. The frequency of glomerular hyperfiltration and renal failure was computed based on the results generated using Schwartz and CKD-EPI formulas. The agreement between formulas was assessed with BlandAltman method. A total of 56 adults and 62 children were included in this study. Renal failure was observed in 1.78% of adults and 9.68% of children; glomerular hyperfiltration in 66.10% of adults and 25.8% of children. Compared with reference formulas (CKD-EPI, Schwartz), all biases found were significantly different from zero except for Cockcroft and Gault formula bias, which was statistically zero. The limits of agreement were all unacceptably wide compared with the expected limits with the exception of CKD-EPI without adjustment for ethnicity. Thus, Schwartz formula would not be interchangeable with JSCCS formula in children, nor was the CKD-EPI formula interchangeable with the JSCCS, Cockcroft and Gault, MDRD or CKD-EPI without adjustment for ethnicity formulas in adults living with sickle cell anemia

Major phenotypes of haptoglobin and oxidative stress induced by extracellular hemoglobin on red blood cells

Les travaux menés au cours de cette thèse se sont articulés autour de l'étude des phénotypes de l'haptoglobine (Hp) humaine, de leur purification, de leurs interactions avec l'hémoglobine (Hb) et des implications in vitro dans le stress oxydant induit par l'Hb extra-érythrocytaire. Les résultats ont été appliqués à l'autotransfusion utilisant la récupération sanguine péri-opératoire. Nous avons mis au point un protocole de phénotypage de l'Hp humaine par électrophorèse en gel de polyacrylamide, que nous avons appliqué à l'étude de la répartition des trois phénotypes dans une population de patients hospitalisés. Par la suite, nous avons purifié par FPLC l'Hp à partir de plasmas humains phénotypés (échange d'ions et exclusion-diffusion). L'interaction de chacun des trois phénotypes purifiés d'Hp avec l'Hb humaine a été étudiée en spectrophotométrie, à travers le pouvoir peroxydasique du complexe Hp-Hb. Les résultats obtenus ont montré que l'affinité de Hp 1-1 pour l'Hb était supérieure à celle de Hp 1-2, qui était elle-même supérieure à celle de Hp 2-2. La constatation du fait que l'interaction de l'Hp avec l'Hb était exothermique nous a conduit à réaliser des études complémentaires en microcalorimétrie. Dans une étude clinique, nous avons démontré que l'affinité de l'Hp pour l'Hb pouvait avoir pour conséquence une sous-estimation de la concentration réelle d'Hp présente dans des spécimens de patients. Cette interférence, non dépendante du phénotype, a été observée lorsque l'Hp était déterminée en immuno-néphélémétrie. Par la suite, nous avons étudié les effets délétères de l'Hb extra-érythrocytaire sur le globule rouge in vitro sur deux modèles. Le premier a utilisé des préparations de membranes de globules rouges, avec suivi de la peroxydation lipidique par la formation de diènes conjugués et des substances réagissant avec l'acide thiobarbiturique (TBARS). Le deuxième modèle a utilisé des globules rouges intacts, maintenus dans un milieu de conservation (SAGM), avec suivi du potassium et de l'activité lactate déshydrogénase libérés, comme marqueurs d'atteinte de l'intégrité membranaire. L'effet protecteur de chacun des trois phénotypes de l'Hp vis-à-vis du stress oxydant induit par l'Hb extra-érythrocytaire a été étudié sur ces deux modèles. Les résultats ont mis en évidence le rôle anti-oxydant de l'Hp et ont démontré qu il existait des différences significatives selon le phénotype, l'effet protecteur de Hp 1-1 étant supérieur à celui de Hp 1-2, qui était lui-même supérieur à celui de Hp 2-2. Enfin, nous avons évalué la qualité des poches de sang destinées à être re-transfusées lors de la récupération sanguine péri-opératoire et les conséquences de l'hémolyse en terme de stress oxydant sur le globule rouge. Nos résultats ont montré que les poches destinées à être re-transfusées contenaient des concentrations élevées d'Hb libre. Un stress oxydant a été mis en évidence au niveau des globules rouges des poches, mais également dans la circulation générale des patients après transfusion. Ce stress oxydant s'accompagnait d'une baisse des concentrations plasmatiques en thiols non protéiques et en Hp, ainsi que d'une altération des propriétés mécaniques des membranes de globules rouges. L'ensemble de ces résultats souligne l'importance de maîtriser l'hémolyse lors de la récupération sanguine péri-opératoire, pour limiter ses effets délétères.This thesis focuses on the study of human haptoglobin phenotypes (Hp), their purification, their interactions with hemoglobin (Hb), and on in vitro implications in oxidative stress induced by fre Hb. The results were applied to the autologous transfusion using perioperative blood salvage. We developed a protocol of human Hp phenotyping using polyacrylamide gel electrophoresis, which was applied to the study of the distribution of the three phenotypes in patients in hospital. Then, we purified the phenotyped human plasmas by FPLC (ion exchange chromatography and gel filtration). The interaction of the three purified Hp phenotypes with human Hb was studied in spectrophotometry, through the peroxidase activity of Hp-Hb complex. The results obtained showed that the affinity of Hp 1-1 for Hb was higher than that of Hp 1-2, which was itself higher than that of Hp 2-2. The interaction of Hp with Hb was proved to be exothermic, which allowed us to conduct complementary studies in microcalorimetry. In a clinical study, we found that the affinity of Hp for Hb could lead to underevaluating the real Hp concentrations in specimens of patients. This interference, which was independent of the phenotype, was observed when Hp was determined by immuno-nephelemetry. Then, we studied the deleterious effects of extracellular Hb on red blood cells in vitro on two models. The first one used preparations of red blood cells membranes, in which we followed the lipid peroxidation by combined dienes formation and substances reacting with thiobarbituric acid (TBARS). The second model used intact red blood cells, maintained in a conservation medium (SAGM), with follow-up of released potassium and lactate dehydrogenase activity, as markers of attack on membrane integrity. The protective effect of each of the three phenotypes of Hp with respect to oxidative stress induced by extracellular Hb was studied on these two models. The results confirmed the antioxidant role of Hp and showed that there were significant differences according to the phenotype, the protective effect of Hp 1-1 being higher than that of Hp 1-2, which was itself higher than that of Hp 2-2. Finally, we evaluated the quality of the blood-pack units during perioperative autologous transfusion and the consequences of hemolysis in terms of oxidative stress on red blood cells. Our results indicated that the blood units intended to be transfused contained high concentrations of fre Hb. An oxidative stress was found on the red blood cells contained in the blood bags and in the general circulation of patients after transfusion. This oxidative stress was accompanied by a decrease in plasmatic non-protein thiols and Hp concentrations, as well as a deterioration of the mechanical properties of red blood cells membranes. All the results showed the importance of hemolysis control during perioperative blood salvage, in order to limit its deleterious effects

Major phenotypes of haptoglobin and oxidative stress induced by extracellular hemoglobin on red blood cells

Les travaux menés au cours de cette thèse se sont articulés autour de l'étude des phénotypes de l'haptoglobine (Hp) humaine, de leur purification, de leurs interactions avec l'hémoglobine (Hb) et des implications in vitro dans le stress oxydant induit parThis thesis focuses on the study of human haptoglobin phenotypes (Hp), their purification, their interactions with hemoglobin (Hb), and on in vitro implications in oxidative stress induced by fre Hb. The results were applied to the autologous transfusio

Phénotypes majeurs de l’haptoglobine humaine et stress oxydant induit par l’hémoglobine extra-érythrocytaire sur le globule rouge

Les travaux menés au cours de cette thèse se sont articulés autour de l’étude des phénotypes de l’haptoglobine (Hp) humaine, de leur purification, de leurs interactions avec l’hémoglobine (Hb) et des implications in vitro dans le stress oxydant induit par l’Hb extra-érythrocytaire. Les résultats ont été appliqués à l'autotransfusion utilisant la récupération sanguine péri-opératoire. Nous avons mis au point un protocole de phénotypage de l’Hp humaine par électrophorèse en gel de polyacrylamide, que nous avons appliqué à l’étude de la répartition des trois phénotypes dans une population de patients hospitalisés. Par la suite, nous avons purifié par FPLC l’Hp à partir de plasmas humains phénotypés (échange d’ions et exclusion-diffusion). L’interaction de chacun des trois phénotypes purifiés d’Hp avec l’Hb humaine a été étudiée en spectrophotométrie, à travers le pouvoir peroxydasique du complexe Hp-Hb. Les résultats obtenus ont montré que l’affinité de Hp 1-1 pour l’Hb était supérieure à celle de Hp 1-2, qui était elle-même supérieure à celle de Hp 2-2. La constatation du fait que l’interaction de l’Hp avec l’Hb était exothermique nous a conduit à réaliser des études complémentaires en microcalorimétrie. Dans une étude clinique, nous avons démontré que l’affinité de l’Hp pour l’Hb pouvait avoir pour conséquence une sous-estimation de la concentration réelle d’Hp présente dans des spécimens de patients. Cette interférence, non dépendante du phénotype, a été observée lorsque l’Hp était déterminée en immuno-néphélémétrie. Par la suite, nous avons étudié les effets délétères de l’Hb extra-érythrocytaire sur le globule rouge in vitro sur deux modèles. Le premier a utilisé des préparations de membranes de globules rouges, avec suivi de la peroxydation lipidique par la formation de diènes conjugués et des substances réagissant avec l’acide thiobarbiturique (TBARS). Le deuxième modèle a utilisé des globules rouges intacts, maintenus dans un milieu de conservation (SAGM), avec suivi du potassium et de l’activité lactate déshydrogénase libérés, comme marqueurs d’atteinte de l’intégrité membranaire. L’effet protecteur de chacun des trois phénotypes de l’Hp vis-à-vis du stress oxydant induit par l’Hb extra-érythrocytaire a été étudié sur ces deux modèles. Les résultats ont mis en évidence le rôle anti-oxydant de l’Hp et ont démontré qu’il existait des différences significatives selon le phénotype, l’effet protecteur de Hp 1-1 étant supérieur à celui de Hp 1-2, qui était lui-même supérieur à celui de Hp 2-2. Enfin, nous avons évalué la qualité des poches de sang destinées à être re-transfusées lors de la récupération sanguine péri-opératoire et les conséquences de l’hémolyse en terme de stress oxydant sur le globule rouge. Nos résultats ont montré que les poches destinées à être re-transfusées contenaient des concentrations élevées d’Hb libre. Un stress oxydant a été mis en évidence au niveau des globules rouges des poches, mais également dans la circulation générale des patients après transfusion. Ce stress oxydant s’accompagnait d’une baisse des concentrations plasmatiques en thiols non protéiques et en Hp, ainsi que d’une altération des propriétés mécaniques des membranes de globules rouges. L’ensemble de ces résultats souligne l’importance de maîtriser l’hémolyse lors de la récupération sanguine péri-opératoire, pour limiter ses effets délétères.This thesis focuses on the study of human haptoglobin phenotypes (Hp), their purification, their interactions with hemoglobin (Hb), and on in vitro implications in oxidative stress induced by free Hb. The results were applied to the autologous transfusion using perioperative blood salvage. We developed a protocol of human Hp phenotyping using polyacrylamide gel electrophoresis, which was applied to the study of the distribution of the three phenotypes in patients in hospital. Then, we purified the phenotyped human plasmas by FPLC (ion exchange chromatography and gel filtration). The interaction of the three purified Hp phenotypes with human Hb was studied in spectrophotometry, through the peroxidase activity of Hp-Hb complex. The results obtained showed that the affinity of Hp 1-1 for Hb was higher than that of Hp 1-2, which was itself higher than that of Hp 2-2. The interaction of Hp with Hb was proved to be exothermic, which allowed us to conduct complementary studies in microcalorimetry. In a clinical study, we found that the affinity of Hp for Hb could lead to underevaluating the real Hp concentrations in specimens of patients. This interference, which was independent of the phenotype, was observed when Hp was determined by immuno-nephelemetry. Then, we studied the deleterious effects of extracellular Hb on red blood cells in vitro on two models. The first one used preparations of red blood cells membranes, in which we followed the lipid peroxidation by combined dienes formation and substances reacting with thiobarbituric acid (TBARS). The second model used intact red blood cells, maintained in a conservation medium (SAGM), with follow-up of released potassium and lactate dehydrogenase activity, as markers of attack on membrane integrity. The protective effect of each of the three phenotypes of Hp with respect to oxidative stress induced by extracellular Hb was studied on these two models. The results confirmed the antioxidant role of Hp and showed that there were significant differences according to the phenotype, the protective effect of Hp 1-1 being higher than that of Hp 1-2, which was itself higher than that of Hp 2-2. Finally, we evaluated the quality of the blood-pack units during perioperative autologous transfusion and the consequences of hemolysis in terms of oxidative stress on red blood cells. Our results indicated that the blood units intended to be transfused contained high concentrations of free Hb. An oxidative stress was found on the red blood cells contained in the blood bags and in the general circulation of patients after transfusion. This oxidative stress was accompanied by a decrease in plasmatic non-protein thiols and Hp concentrations, as well as a deterioration of the mechanical properties of red blood cells membranes. All the results showed the importance of hemolysis control during perioperative blood salvage, in order to limit its deleterious effects

Phénotypes majeurs de l'haptoglobine humaine et stress oxydant induit par l'hémoglobine extra-érythrocytaire sur le globule rouge

Les travaux menés au cours de cette thèse se sont articulés autour de l étude des phénotypes de l haptoglobine (Hp) humaine, de leur purification, de leurs interactions avec l hémoglobine (Hb) et des implications in vitro dans le stress oxydant induit par l Hb extra-érythrocytaire. Les résultats ont été appliqués à l'autotransfusion utilisant la récupération sanguine péri-opératoire. Nous avons mis au point un protocole de phénotypage de l Hp humaine par électrophorèse en gel de polyacrylamide, que nous avons appliqué à l étude de la répartition des trois phénotypes dans une population de patients hospitalisés. Par la suite, nous avons purifié par FPLC l Hp à partir de plasmas humains phénotypés (échange d ions et exclusion-diffusion). L interaction de chacun des trois phénotypes purifiés d Hp avec l Hb humaine a été étudiée en spectrophotométrie, à travers le pouvoir peroxydasique du complexe Hp-Hb. Les résultats obtenus ont montré que l affinité de Hp 1-1 pour l Hb était supérieure à celle de Hp 1-2, qui était elle-même supérieure à celle de Hp 2-2. La constatation du fait que l interaction de l Hp avec l Hb était exothermique nous a conduit à réaliser des études complémentaires en microcalorimétrie. Dans une étude clinique, nous avons démontré que l affinité de l Hp pour l Hb pouvait avoir pour conséquence une sous-estimation de la concentration réelle d Hp présente dans des spécimens de patients. Cette interférence, non dépendante du phénotype, a été observée lorsque l Hp était déterminée en immuno-néphélémétrie. Par la suite, nous avons étudié les effets délétères de l Hb extra-érythrocytaire sur le globule rouge in vitro sur deux modèles. Le premier a utilisé des préparations de membranes de globules rouges, avec suivi de la peroxydation lipidique par la formation de diènes conjugués et des substances réagissant avec l acide thiobarbiturique (TBARS). Le deuxième modèle a utilisé des globules rouges intacts, maintenus dans un milieu de conservation (SAGM), avec suivi du potassium et de l activité lactate déshydrogénase libérés, comme marqueurs d atteinte de l intégrité membranaire. L effet protecteur de chacun des trois phénotypes de l Hp vis-à-vis du stress oxydant induit par l Hb extra-érythrocytaire a été étudié sur ces deux modèles. Les résultats ont mis en évidence le rôle anti-oxydant de l Hp et ont démontré qu il existait des différences significatives selon le phénotype, l effet protecteur de Hp 1-1 étant supérieur à celui de Hp 1-2, qui était lui-même supérieur à celui de Hp 2-2. Enfin, nous avons évalué la qualité des poches de sang destinées à être re-transfusées lors de la récupération sanguine péri-opératoire et les conséquences de l hémolyse en terme de stress oxydant sur le globule rouge. Nos résultats ont montré que les poches destinées à être re-transfusées contenaient des concentrations élevées d Hb libre. Un stress oxydant a été mis en évidence au niveau des globules rouges des poches, mais également dans la circulation générale des patients après transfusion. Ce stress oxydant s accompagnait d une baisse des concentrations plasmatiques en thiols non protéiques et en Hp, ainsi que d une altération des propriétés mécaniques des membranes de globules rouges. L ensemble de ces résultats souligne l importance de maîtriser l hémolyse lors de la récupération sanguine péri-opératoire, pour limiter ses effets délétères.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF