Desarrollo de un método de PCR en tiempo real para cuantificar bacterias portadoras de los genes tet(A) y tet(B). Aplicación a alimentos convencionales y ecológicos

A lo largo de las últimas décadas se ha hecho un uso abusivo de los agentes antimicrobianos tanto en medicina humana como veterinaria y esto ha llevado a un aumento considerable de bacterias resistentes a estos agentes. Las bacterias, portadoras de los genes de resistencia, contaminan de forma natural el medio ambiente y, por lo tanto, es fácil que lleguen al consumidor a través de la cadena alimentaria. En el caso de que las bacterias resistentes sean patógenas, estas se vuelven más peligrosas ya que pueden reducir o incluso anular las opciones terapéuticas lo que, en casos extremos, puede desencadenar incluso la muerte del paciente. Pero en los alimentos también puede haber bacterias resistentes que, no carentes de importancia, son inocuas para el consumidor y pueden transmitir la resistencia a las bacterias comensales del organismo. Pese a las consecuencias que la resistencia bacteriana pueda tener en la salud, no existen límites en la legislación vigente ni protocolos oficiales para detectar, controlar o cuantificar microorganismos resistentes a agentes antimicrobianos. Sin embargo, ya hay numerosos estudios que demandan una mayor investigación para el desarrollo de herramientas de control, no solo de patógenos, sino también de poblaciones bacterianas resistentes a estos fármacos debido al problema de salud pública que supone su propagación. Esta tesis doctoral pretende contribuir a esa demanda presentando un nuevo método de análisis por PCR en tiempo real capaz de detectar y cuantificar, de forma directa en alimentos, dos de los genes de resistencia a tetraciclina más frecuentes en bacterias gram negativas, tet(A) y tet(B)

Detección cuantitativa de microorganismos resistentes a la tetraciclina en carne convencional y ecológica de ternera, cerdo y pollo

The use of antimicrobials has increased the number of resistant bacteria to these drugs; however, the organic production has restricted the use of these compounds. The objectives of this work were to assess counts of tetracycline-resistant bacteria using conventional microbiology, to compare these results with those obtained for tet(A) and tet(B) genes by qPCR and to investigate both genes in conventional and organic meat. Counts of mesophilic aerobic bacteria were higher in organic beef, while chicken meat obtained higher counts for Enterobacteriaceae. Only tet(B) was higher in conventional pork and chicken meat than in their organic counterparts. The tet(A) gene was found in almost 100% of samples and tet(B) gene changed according to the type of meat. The presence of tet genes suggests that they are widely distributed, especially tet(A), in food of animal origin, even in organic meat samples obtained from animals in which the use of antimicrobials is restrictedEl uso de los antimicrobianos ha incrementado sustancialmente el número de bacterias resistentes a estos fármacos sin embargo, la producción ecológica, ha limitado el uso de estos medicamentos. Los objetivos del trabajo fueron evaluar los recuentos obtenidos de bacterias resistentes a tetraciclina mediante microbiología convencional, obtener recuentos de bacterias con los genes tet(A) y tet(B)mediante qPCR e investigar la distribución de ambos genes en carne convencional y ecológica. Los recuentos de bacterias aerobias mesófilas fueron significativamente mayores en carne ecológica de ternera, mientras que los recuentos de Enterobacteriaceae fueron superiores en carne convencional de pollo. Sólo el gen tet(B) fue significativamente mayor en carne convencional de cerdo y de pollo que en sus homólogas ecológicas. El gen tet(A) se encontró en casi todas las muestras mientras que el tet(B) varió según la especie. La presencia de los genes tet sugiere que están ampliamente distribuidos, especialmente tet(A), en alimentos de origen animal, incluso en aquellos derivados de animales en los que el uso de antimicrobianos está seriamente restringidoThe authors are grateful to the Institute Pasteur for providing the E. coli BM13 (C600 RifR)/RP4 strain (tet(A)) and to the Health Protection Agency for providing the E. coli NCTC 50365 strain (tet(B)). Xunta de Galicia (project 09MRU010261PR) supported this work. We also thank Carmen Carreira and Rodrigo García for their technical supportS

Presencia y resistencia a antimicrobianos de Escherichia coli aislados a partir de alimentos en el estado de Hidalgo (México)

The presence of Escherichia coli in foods taken from the grocery stores and the supermarkets in Hidalgo State (Mexico) was determined for 73 samples of poultry meat, 60 samples of pork, 86 samples of beef, and 66 samples of vegetables. A total of 352 E. coli strains were isolated, identified, and analyzed by an agar disk diffusion assay for their resistance to 10 antimicrobials. Poultry meat and vegetables taken from groceries showed significantly higher counts (P = 0.0002 and P = 0.0461, respectively) when compared with the samples taken from supermarkets. Compared with the isolates recovered from other foods, E. coli isolated from chicken meat had higher levels of antimicrobial resistance against all antimicrobials tested, with the exceptions of nitrofurantoin resistance of isolates from pork and streptomycin resistance in isolates from pork and beef. In addition, the E. coli isolates from samples taken from the groceries showed higher resistance rates than the isolates from samples taken from the supermarkets for the cases of pork isolates resistance to ampicillin (P = 0.0497), chloramphenicol (P = 0.0075), doxycycline (P = 0.002), and streptomycin (P = 0.0094) and beef isolates resistance against ampicillin (P = 0.0048), streptomycin (P = 0.002), and sulfisoxazole (P = 0.003). The present study revealed that the observed resistance rates correlated well with those reported in the national surveillance programmes of developed countries, with the exception of isolates from chicken meat, which have higher resistance rates. Also, from a microbiological safety point of view, samples taken from supermarkets were in a much better conditions than those obtained from the groceriesLa presencia de Escherichia coli fue investigada en 73 muestras de carne de pollo, 60 muestras de carne de cerdo, 86 muestras de carne de vacuno y 66 muestras de alimentos vegetales muestreados en pequeños ultramarinos y supermercados en el estado de Hidalgo (México). Un total de 352 aislamientos de E. coli fueron seleccionados, identificados y analizados mediante el método de difusión en disco para determinar su resistencia a 10 antimicrobianos. Las muestras de pollo y vegetales obtenidas en tiendas de alimentación mostraron recuentos de E. coli significativamente mayores (P = 0,0002 y P = 0,0461 respectivamente) que las obtenidas en supermercados. Comparados con los procedentes de los restantes alimentos, los E. coli obtenidos a partir de carne de pollo mostraron un mayor grado de resistencia a todos los antimicrobianos estudiados, excepto en lo referente a la nitrofurantoína en el caso de los aislados a partir de carne de cerdo y la estreptomicina respecto de los aislamientos de carne de cerdo y vacuno. Adicionalmente, en algunos casos, los E. coli obtenidos a partir de alimentos muestreados en pequeños ultramarinos mostraron mayores tasas de resistencia que los procedentes de alimentos muestreados en supermercados. Esto ocurrió en los aislamientos procedentes de carne de cerdo para la ampicilina (P = 0,0497), cloranfenicol (P = 0,0075), doxiciclina (P = 0,002) y estreptomicina (P = 0,0094), y en el caso de la carne de vacuno para la ampicilina (P = 0,0048), estreptomicina (P = 0,002) y sulfizoxazol (P = 0,003). El presente estudio demuestra que las tasas de resistencia observadas son compatibles con las publicadas en los programas nacionales de vigilancia de los países desarrollados, con la excepción de los aislamientos procedentes de carne de pollo, en los cuales las tasas de resistencia tienden a ser mayores. Además, desde el punto de vista de la seguridad microbiológica, las muestras obtenidas en supermercados mostraron condiciones significativamente mejores que las obtenidas en tiendas de alimentaciónThe authors are thankful for financial support from Dirección Xeral de Investigación, Desenvolvemento e Innovación (Xunta de Galicia) (grant IN843A2007/42), and CONACYT (Project CB-2006–61310)S

Caracterización molecular de bacterias ácido-lácticas aisladas a partir de carne de ternera envasada al vacío de modo tradicional y mediante un sistema avanzado

A total of 91 lactic acid bacteria (LAB) were isolated from 50 beef samples, 25 packaged by traditional vacuum packaging and 25 packaged using advanced vacuum skin packaging. The isolated LAB were identified using 16S rRNA sequencing, whereas randomly amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR) and cluster analysis were used for typing the LABs. Ten different species of LAB were identified and assigned to the following species: Enterococcus gilvus (22 isolates), Enterococcus faecium (9 isolates), Enterococcus casseliflavus (8 isolates), Enterococcus faecalis (4 isolates), Enterococcus malodoratus (3 isolates), Enterococcus devriessei (3 isolates), Lactobacillus sakei (15 isolates), Carnobacterium divergens (12 isolates), Carnobacterium maltaromaticum (5 isolates), and Leuconostoc mesenteroides (8 isolates). The RAPD profile bands observed were not significantly discriminatory, with exceptions of E. casseliflavus, E. faecalis, and E. faecium, which suggests that the type of packaging system used had no specific effect on the selection of most microbiota in the meat after packagingUn total de 91 bacterias ácido-lácticas (LAB) fueron aisladas a partir de 50 muestras de carne de ternera, de las cuales 25 fueron envasadas al vacío de modo tradicional y 25 fueron envasadas mediante un sistema de vacío avanzado. Los aislamientos fueron identificados a través de la secuenciación del ADN ribosomal 16S, mientras que la caracterización de las LAB se realizó mediante la amplificación al azar del ADN polimórfico (RAPD-PCR) y su posterior análisis cluster. Fueron identificadas cepas pertenecientes a diez especies bacterianas diferentes, en concreto: Enterococcus gilvus (22 aislamientos), E. faecium (9 aislamientos), E. casseliflavus (8 aislamientos), E. faecalis (4 aislamientos), E. malodoratus (3 aislamientos), E. devriessei (3 aislamientos), Lactobacillus sakei (15 aislamientos), Carnobacterium divergens (12 aislamientos), C. maltaromaticum (5 aislamientos) y Leuconostoc mesenteroides (8 aislamientos). Los perfiles de bandas de ADN obtenidas no revelaron diferencias significativas, con las excepciones de E. casseliflavus, E. faecalis y E. faecium, sugiriendo que el tipo de envasado no tiene un efecto específico en la selección de la mayor parte de la microbiota presente en la carne envasadaS