Fermentación por adhesión a superficies: una nueva categoría fermentativa

Se resume el conocimiento básico sobre la fermentación en estado sólido y la formación de biopelículas y se relaciona con los procesos de adhesión celular, cubriendo puntos de vista de ingeniería y de biología molecular. Contrariamente a la creencia común, la ventaja de la fermentación en estado sólido está relacionada a la adhesión de los hongos a partículas sólidas y no al bajo contenido de agua. Por lo tanto, la fermentación en estado sólido y la fermentación en biopelículas (erradamente conocida como inmovilización por adsorción) son variantes técnicas del mismo proceso biológico y deben ser referidas como Fermentación por Adhesión a Superficies

In Memoriam Doctor Marcel Gutiérrez-Correa (1952-2017)

El Doctor Marcel Gutiérrez-Correa, gran Maestro, reconocido científico, y Padre de la Biotecnología en el País, fue Profesor Principal del Departamento de Biología en la Facultad de Ciencias de la UNALM. Se graduó de Biólogo en la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM) y obtuvo el grado de Doctor of Philosophy (Ph.D.) en Ciencias Agrícolas-Biotecnología por la Gifu University, Japón. Fue Fundador y Director hasta su partida, del Laboratorio de Micología y Biotecnología de la UNALM, dedicando su vida a la investigación científica durante 41 años ininterrumpidos. Fue Académico de Número en la Academia Nacional de Ciencias. Su excelencia académica y científica es equiparable a su calidad humana y grandeza de espíritu. Valoró su condición de Profesor Universitario, como un Título Nobiliario, al que honró hasta el final de sus días. Este artículo está dedicado a la memoria del Profesor Marcel, con eterno agradecimiento, a quién fue mi Maestro y mi referente académico, y quién seguirá siendo a través de mi testimonio y el de sus alumnos, modelo de inspiración para las generaciones futuras.El Doctor Marcel Gutiérrez-Correa, gran Maestro, reconocido científico, y Padre de la Biotecnología en el País, fue Profesor Principal del Departamento de Biología en la Facultad de Ciencias de la UNALM. Se graduó de Biólogo en la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM) y obtuvo el grado de Doctor of Philosophy (Ph.D.) en Ciencias Agrícolas-Biotecnología por la Gifu University, Japón. Fue Fundador y Director hasta su partida, del Laboratorio de Micología y Biotecnología de la UNALM, dedicando su vida a la investigación científica durante 41 años ininterrumpidos. Fue Académico de Número en la Academia Nacional de Ciencias. Su excelencia académica y científica es equiparable a su calidad humana y grandeza de espíritu. Valoró su condición de Profesor Universitario, como un Título Nobiliario, al que honró hasta el final de sus días. Este artículo está dedicado a la memoria del Profesor Marcel, con eterno agradecimiento, a quién fue mi Maestro y mi referente académico, y quién seguirá siendo a través de mi testimonio y el de sus alumnos, modelo de inspiración para las generaciones futuras

Biopelículas de Aspergillus niger para la producción de celulasas: algunos aspectos estructurales y fisiológicos

Aspergillus niger biofilms developed on polyester cloth were evaluated considering two aspects related to the growth on surfaces: structure and physiological behavior focused on cellulase production. The biofilm structure was assessed by using electron scanning microphotographs from inoculation and adsorption to 120 h growth. The microphotographs show that biofilm formation can be divided into three phases: 1) Adhesion, which is strongly increased by Aspergillus spore hydrophobicity; 2) Initial growth and development phase from spore germination, that begins 4 to 10 h after inoculation and continues up to 24 h when almost all available surface has been colonized; 3) Maturation phase in which biomass density is highly increased from 48 h after inoculation until 120 h growth when an internal channel organization that assures medium flow through biofilm is clearly evident as it is frequently reported for bacterial biofilms.Biofilm cellulolytic enzyme activity and productivity were also evaluated, being up to 40% and 55%, respectively, higher than that attained by freely suspended cultures. These results are in agreement with the behavior of most surface living microorganisms, which generally show a higher metabolic activity because of a differential gene expression. This work is a first attempt to understand the structure and physiology of industrial filamentous fungal biofilms as a response to the scarce available information in comparison with the vast and detailed information related to bacterial and pathogenic yeast biofilms.Se evaluaron biopelículas de Aspergillus niger desarrolladas sobre tela de poliéster en dos aspectos fundamentales inherentes al crecimiento sobre superficies: la estructura y el comportamiento fisiológico específicamente relacionado con la producción de celulasas. La estructura de la biopelícula fue evaluada usando microfotografías de microscopía electrónica de barrido (SEM) desde el momento de la inoculación y adsorción de esporas hasta las 120 horas de crecimiento. Nuestros resultados demuestran que la formacion de la biopelícula ocurre en tres fases: la adhesión, la cual es fuertemente favorecida por la hidrofobicidad de las esporas de Aspergillus; la fase de crecimiento inicial y desarrollo, que se inicia con la germinación de la espora entre las 4 y 10 horas y continúa hasta las 24 horas cuando ya se percibe la colonización casi total de la superficie; y finalmente la fase de maduración, en la cual la densidad de biomasa se incrementa notablemente desde las 48 horas hasta las 120 horas; se observa, además en este momento una organización interna de canales, también reportada para biopelículas bacterianas, que aseguran el flujo interno de la biopelícula. Además, la actividad celulolítica de las biopelículas fue evaluada, siendo hasta 40% mayor que en los cultivos sin soporte de crecimiento (durante el transcurso de la fermentación), lográndose un incremento del 55% en la productividad. Estos resultados son concordantes con el comportamiento de la gran mayoría de microorganismos que crecen sobre superficies, los cuales muestran por lo general una mayor actividad metabólica resultante de una expresión genética diferencial. Este trabajo es un primer intento por establecer la estructura y fisiología de las biopelículas de hongos filamentosos de interés industrial en respuesta a la escasa información existente, en comparación con el minucioso y vasto estudio de biopelículas bacterianas y de levaduras patógenas

Differential gene expression of some lignocellulolytic enzymes in Aspergillus niger biofilms

Se realizó una evaluación génica preliminar a nivel transcripcional de biopelículas de Aspergillus niger ATCC 10864 desarrolladas sobre poliéster respecto a algunas enzimas lignocelulolíticas. El análisis de expresión de genes de enzimas lignocelulolíticas y genes reguladores mediante RT-PCR mostró que los genes eng1, eglC, exo y eglA, eglB y xynB son diferencialmente expresados ya sea temporalmente o mediante más de un transcripto en comparación con cultivos sumergidos. Asimismo, los genes reguladores xlnR y creA mostraron patrones temporales de expresión distintos en ambos sistemas. Los resultados obtenidos aportan la evidencia molecular inicial de expresión diferencial de genes en biopelículas así como patrones de regulación diferencial muy probablemente ligada a la adhesión celular.A preliminary evaluation of transcriptional gene expression in Aspergillus niger ATCC 10864 biofilms developed on polyester cloth was carried out. The expression analysis of genes encoding some lignocellulolytic enzymes and some regulatory genes by means of RT-PCR showed that eng1, eglC, exo, eglA, eglB and xynB genes are differentially expressed in biofilm fermentation either time-related or through the production of more than a transcript as compared to A. niger grown in submerged fermentation. Likewise, the regulatory genes xlnR and creA showed time-related expression patterns that were different in both fermentation systems. Results attained in this work contribute with an initial molecular evidence of differential gene expression as well as differential gene regulation patterns in fungal biofilms that may be related to cell adhesion

Aislamiento de Bacillus subtilis DCH4 termotolerante de la fuente termal Chancos (Carhuaz, Perú) con potencial para degradar residuos lignocelulósicos agrícolas

It was isolated bacteria strains from three different types of samples: fresh water, in situ baits and ex situ enrichment. Serial dilutions were prepared and culture was carried at 50 °C using a Basal-Saline medium. Isolated strains were screened for endoglucanase and xylanase activities with qualitative (Congo Red) and quantitative (DNS) methods. Molecular 16S rDNA sequencing analysis was performed for taxonomic identification. It was isolated 31 strains of which 14 showed hydrolytic activities and belonged to Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis species. Moreover, the strain B. subtilis DCH4 showed the highest endoglucanase activity at 45°C and pH 5, and xylanase activity at 55°C and pH 6. Then, DCH4 was cultivated by submerged fermentation with two different media supplemented with sugar cane bagasse, wheat straw, or quinoa stalk to evaluate its saccharification capability. Likewise, it was screening its xylanase and cellulase genes employing specific primers; the amplicons obtained were sequenced, and analyzed. It was found that, enzymatic extracts of DCH4 prepared with cane bagasse or quinoa stalk media achieved the highest endoglucanase and xylanase activities. According to molecular analysis of genes involved in the hydrolytic process, the endoglucanase and xylanase activities exhibited by DCH4 could be attributed to a bifunctional cellulase conformed by endo-beta-1,4-glucanase (GH5) joined to cellulose binding domain 3 (CBM3), and an endo-1,4-beta-xylanase (GH11), respectively. Further transcriptomic experiments would be considered to accomplish optimization strategies for biofuel production from lignocellulosic biomass.Se aislaron cepas de bacterias provenientes de tres tipos de muestras: agua fresca, cebos enriquecidos in situ y ex situ. Se prepararon diluciones seriadas y el cultivo fue a 50 °C usando un medio Salino-Basal. Las cepas aisladas fueron tamizadas para las actividades endoglucanasa y xilanasa con métodos cualitativos (Rojo Congo) y cuantitativos (DNS). Se usó el análisis molecular 16S rDNA para la identificación taxonómica. Se aislaron 31 cepas, de las cuales 14 mostraron actividades hidrolíticas y pertenecían a Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis. Además, B. subtilis DCH4 mostró la mayor actividad endoglucanasa a 45 °C y pH 5, y xilanasa a 55 °C y pH 6. Entonces, DCH4 se cultivó por fermentación sumergida con dos medios diferentes suplementado con bagazo de caña de azúcar, paja de trigo o tallo de quinua para evaluar su capacidad de sacarificación. También, se exploraron los genes de xilanasa y celulasa mediante cebadores específicos; los amplicones obtenidos fueron secuenciados y analizados. Se encontró que los extractos enzimáticos de DCH4 preparados con bagazo de caña o tallos de quinua mostraron las actividades endoglucanasa y xilanasa más elevadas. De acuerdo a los análisis moleculares de los genes involucrados en el proceso hidrolítico, las actividades de endoglunacasa y xilanasa exhibidas por DCH4 podrían atribuirse a una celulasa bifuncional conformada por una endo-beta-1,4-glucanasa (GH5) unida al dominio celulosa 3 (CBM3), y una endo-1,4-beta-xilanasa (GH11), respectivamente. Posteriores experimentos transcriptómicos podrían ser considerados para lograr estrategias de optimización para la producción de biocombustibles a partir de biomasa lignocelulósica

Efecto de diámetro de esfera y densidad celular en la producción de etanol con levadura inmovilizada en alginato

Effect of pellet diameter and cell density on ethanol production with alginate immobilized yeast Título corto: Producción de etanol con levadura inmovilizada ResumenLas células inmovilizadas tienen aplicación potencial en la producción de biocombustibles posibilitando la reutilización de biomasa, el empleo de diversas configuraciones de reactores y sistemas de cultivo, el manejo de altas densidades celulares alcanzando altas productividades volumétricas, y la simplificación de operaciones de procesamiento de salida. El objetivo del presente estudio fue evaluar la influencia del diámetro de las perlas y la densidad celular en la producción de etanol con Saccharomyces uvarum inmovilizada en alginato al 2% (p/v). Para ello se evaluaron tres diámetros de perlas de 2, 2,5 y 3 mm. Las células inmovilizadas fueron cultivadas en medio con 12% (p/v) de glucosa en biorreactores de columna sin agitación a 28 ºC, y se operaron cuatro lotes consecutivos de 48 horas cada uno. En cada lote se cuantificó el consumo de glucosa y se determinó la cantidad de etanol producido. Los rendimientos máximos de etanol para las esferas de 2, 2,5 y 3 mm de diámetro fueron 81, 83 y 97% del rendimiento teórico. La máxima productividad volumétrica de etanol fue 1,2 g/L-1/h-1 con un consumo de glucosa de 99,8% al término del lote, correspondiente a las columnas con perlas de 3 mm y con una producción de 0,017 g de etanol por esfera. La producción de etanol acumulada en cada sistema fue 178, 189 y 200 g/L-1 para 2, 2,5 y 3 mm respectivamente, encontrándose una relación directa con el diámetro de perla e inversa respecto a la densidad celular. Los rendimientos de etanol obtenidos son superiores a los reportados para la misma especie. Palabras clave: inmovilización, alginato, Saccharomyces uvarum, etanol, lote repetido.AbstractImmobilized cells have a potential use in biofuel production. They also allow re-using biomass, using diverse reactor configurations and culture systems, handling high cell densities to obtain high volumetric productivities and to simplify the downstream processing. The purpose of this work was to evaluate the influence of bead diameter and cell density on ethanol production using immobilized Saccharomyces uvarum in 2% (w/v) alginate. For that, three bead diameters (2, 2.5 and 3 mm) were evaluated. Immobilized cells were cultured on a 12% (w/v) glucose medium in column bioreactors without agitation at 28 °C for four 48 h–repeated batches. For each batch, both glucose consumption and ethanol produced were measured. Maximum yields for 2, 2.5 and 3 mm bead diameters were 81, 83 and 97% of theoretical yield. Maximum volumetric productivity of ethanol was 1.2 g/L-1/h-1 with 99.8% glucose consumption at the end of the batch, corresponding to the 3 mm bead diameter and the ethanol production per bead was 0.017 g. Accumulated ethanol production for each system was 178, 189 and 200 g/L-1 for 2, 2.5 y 3 mm bead diameter, respectively, being this directly related to bead diameter and inversely related to cell density. Ethanol yields were higher than those reported for the same species.Key words: Immobilization, alginate, Saccharomyces uvarum, ethanol, repeated batch

Un método simple y preciso para la cuantificación específica de biomasa en cultivos mixtos de hongos filamentosos por PCR cuantitativa

Production of lignocellulolytic enzymes by filamentous fungi have a great potential at industrial level due to their widespread applications. Mixed fungal cultures and particularly mixed fungal biofilms constitute a promising fermentation system for an enhanced enzyme production. However, it has not been addressed how much of this enhancement depends on the mixed biomass proportion. In this sense, the aim of this study was to develop a method to specifically and accurately quantify mixed fungal biomass. For this purpose, mixed biofilm cultures composed of Aspergillus niger and Trichoderma reesei, two filamentous fungi used industrially for cellulase production, were collected from 48 to 120 h of growth; mycelia were pulverized, and DNA was extracted for qPCR assays with specific primers for each fungus. Primers were designed from non-conserved regions of sequences of actin and β-tubulin genes of both A. niger and T. reesei. Specificity of these primers was tested in silico and experimentally. A statistically significant correlation was obtained between qPCR-calculated biomass and dry weight biomass data. By this method, it was possible to detect changes on mycelia proportions in biofilms over time, suggesting a competitive interaction between these two fungi. In conclusion, this method allows a specific and accurate quantification of mixed fungal biomass and could be also applied to different mixed culture systems for studying microbial interactions.La producción de enzimas lignocelulolíticas por hongos filamentosos tiene un gran potencial a nivel industrial debido a sus diversas aplicaciones. Los cultivos fúngicos mixtos y particularmente las biopelículas fúngicas mixtas constituyen un sistema de fermentación prometedor para una mayor producción enzimática. Sin embargo, no se ha abordado cuánto de esta mejora depende de la proporción de biomasa mixta. En este sentido, el objetivo de este estudio fue desarrollar un método para cuantificar de forma específica y precisa la biomasa fúngica mixta. Para este propósito, se recolectaron cultivos mixtos de biopelículas de 48 a 120 h de crecimiento compuestos por Aspergillus niger y Trichoderma reesei, dos hongos filamentosos utilizados industrialmente para la producción de celulasas; el micelio se pulverizó y el ADN se extrajo para ensayos de qPCR con cebadores específicos para cada hongo. Los cebadores se diseñaron a partir de regiones no conservadas de las secuencias de los genes de actina y β-tubulina de A. niger y T. reesei. La especificidad de estos cebadores se probó in silico y experimentalmente. Se obtuvo una correlación estadísticamente significativa entre la biomasa calculada mediante qPCR y los datos de biomasa en peso seco. Mediante este método, fue posible detectar cambios en las proporciones de los micelios en las biopelículas a lo largo del tiempo, lo que sugiere una interacción competitiva entre estos dos hongos. En conclusión, este método permite una cuantificación específica y precisa de la biomasa fúngica mixta y también podría aplicarse a diferentes sistemas de cultivo mixto para estudiar interacciones microbianas