Molecular biological analysis of cell adhesion in Ashbya gossypii

Ashbya gossypii is a filamentous fungus of the family Saccharomycetaceae, and about 95% of its genes have a homologue in the yeast Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae can turn into a filamentous growth form for which the expression of adhesion molecules is necessary. Some of these so called FLO genes have homologues in A. gossypii, which are AgFLO5-1 and AgFLO5-2, AgFLO11 and AgFIG2. Genes encoding the transcriptional regulators AgFlo8, AgSfl1 as well as AgTec1 and AgSte12 are present as well. Unlike in S. cerevisiae, flocculation gene products in A. gossypii do not bind to mannose. Deletion of A. gossypii adhesins and most of their transcriptional regulators did not alter the colony phenotype. However, Agflo8, Agsfl1 and Agtec1 showed a growth delay. Formation of aerial hyphal aggregations and the attachment to the growth substrate was not impaired. The mentioned mutants sporulated in an abundant manner compared to the precursor strain but spore phenotypes were normal. Reporter gene assays and promoter analysis revealed that AgFlo8 induces the expression of AgSFL1 which in turn represses AgFLO5-2, AgFLO8 and AgFIG2. The AgFLO8 and AgSFL1 deletion mutants seemed to possess certain insensitivity to elevated sugar levels, indicating non sufficient stress response in the absence of AgSfl1. Overexpression of AgSFL1 resulted in a wild-type-like phenotype. A C-terminal GFP fusion to AgSfl1 shows that the protein is localized in nuclei. In S. cerevisiae, pheromone stimulation leads to expression of ScFIG2 via Ste12. AgFIG2 seems to be permanently expressed at high levels via Tec1 without involvement of Ste12. Reporter gene assays and promoter analysis revealed conserved Tec1 and Ste12 binding sites between A. gossypii and S. cerevisiae. Out of 4726 protein coding genes in the genome of A. gossypii at least 16.6% show Tec1 binding sites in their promoter.Ashbya gossypii ist ein filamentöser Pilz der Familie Saccharomycetaceae, und für etwa 95% seiner Gene ist ein homologes Gen in Saccharomyces cerevisiae zu finden. S. cerevisiae kann eine filamentöse Wachstumsform ausbilden, wofür die Expression von Adhäsionsmolekülen notwendig ist. Einige dieser sogenannten FLO-Gene besitzen Homologe in A. gossypii, welche von AgFLO5-1 und AgFLO5-2, AgFLO11 und AgFIG2 kodiert werden. Sowohl die Transkriptionsregulatoren AgFlo8, AgSfl1 als auch AgTec1 und AgSte12 sind vorhanden. Anders als in S. cerevisiae binden die Flockulierungsmoleküle in A. gossypii nicht an Mannose. Deletion sowohl der Adhäsine als auch deren Transkriptionsregulatoren in A. gossypii führte nicht zu einer Änderung des Koloniephänotyps. Hingegen wiesen Agflo8, Agsfl1 und Agtec1 Wachstumsverzögerungen auf. Lufthyphenaggregationen und das Anhaftungsverhalten blieb jedoch unverändert. Die genannten Deletionsmutanten zeigten vermehrte Sporenbildung, jedoch waren Sporenphänotypen unverändert. Reportergen-Experimente und Promotoranalysen deuten auf AgFlo8-induzierte AgSFL1 Expression hin. AgSfl1 wiederum reprimiert die Expression von AgFLO5-2, AgFLO8 und AgFIG2. Die Deletionsmutanten Agflo8 und Agsfl1 schienen eine gewisse Insensitivität gegenüber erhöhten Zuckermengen aufzuweisen, was auf unzureichende Stressabwehr in Abwesenheit von AgSfl1 deutet. Überexpression von AgSFL1 resultierte in wildtypartigem Phänotyp. C-terminale GFP Markierung von AgSfl1 zeigt die Lokalisierung des Proteins im Zellkern. In S. cerevisiae wird ScFIG2 nach Pheromon-Induktion mit Hilfe von Ste12 exprimiert. AgFIG2 scheint permanent in hohem Maße mit Hilfe von Tec1 jedoch ohne Ste12 exprimiert zu werden. Mit Hilfe von Reportergen-Experimenten und Promotoranalysen wurde die Konservierung von Tec1 und Ste12 Bindestellen zwischen A. gossypii und S. cerevisiae nachgewiesen. Das Genom von A. gossypii enthält 4726 protein-kodierende Gene. Von diesen weisen mindestens 16,6% Tec1-Regulierung auf

Präzision und Reproduzierbarkeit von Bissnahmen mit einem Intraoralscanner im Vergleich zur konventionellen und konventionell-digitalen Bissnahme

Summary Aims and Scope In the current literature, it is assumed that during the conventional bite registration with an irreversibly elastic registration material, which is placed on the dental arch in the plastic state, changes in the relations predominantly occur in the vertical plane between the upper and lower jaw. This has so far mostly been illustrated by means of quantitative evaluation of the occlusal contact points. In this case, only the result of the deviation from the original situation can be detected, but not the extent and direction of this deviation. During the digital bite taking with an intraoral scanner, a registration material can be dispensed with and obsoletes discussions about the dimensional-changing disadvantages of the registration material and the registration itself. The aim of this thesis is to compare the three-dimensional deviation of the relation between maxilla and mandible in maximum intercuspation with digital and conventional bite acquisition and to measure it metrically using an industrial optical scanner in all three spatial planes. Methods In this study, 15 mushbites respectively bite registrations were prepared using the Trios 3 (3shape, Copenhagen), Futar D and Futar Scan (Kettenbach, Eschenburg) on a master model. The digitalization of the master model and the conventional jaw-relation determination (Futar D) was carried out with an industrial scanner (Atos So4 II, GOM mbH, Braunschweig). A dental laboratory occurs the digital transmission of the jaw relationship with the lab scanner D700 (3shape, Copenhagen) through the scan of the gypsum models and a bite scan with Futar D and Futar Scan registrations as well by the scan of the registration (Futar Scan) itself. The scans of the bite registration with the Trios 3 and the digitized registrations of the remaining groups were imported into the evaluation software GOM Inspect Professional. Using a best fit registration with a maximum distance of 0.500 mm, the upper jaw models were combined with the upper jaw master model. The discrepancy between the mandibular models to the mandibular master model was then determined in the X, Y, and Z axis as well as in the rotation about the X, Y, and Z axes. The deviations were graphically displayed in boxplot diagrams. The statistical comparison between the registration procedures and the spatial dimensions was carried out using the Kruskal-Wallis test and the Mann-Whitney U-test. Results The statistics showed a significant deviation in the comparison of the bite registrations with the Trios 3 (3Shape, Copenhagen) compared to the other experimental groups. The results obtained in the three-dimensional analysis of the Z-axis reveal the accuracy of the vertical dimension in intermaxillary jaw-relation determination. The lowest average deviation in the Z-axis was -0.044 mm in the Trios 3. The assignment with the FutarScan bite registration recorded the maximum average deviation at 0.438 mm. It is shown that the bite taken with the Trios bite scan has up to ten times higher accuracy compared to the other registration methods (Futar D 0,355 mm, Futar D lab scanner 0,406 mm, Futar Scan bite 0,145 mm, Futar Scan 0,438 mm) and contains with a standard deviation of 0.07 a comparable precision as the silicones for bite registrations (FutarD SD = 0.079 mm; FutarScan SD = 0.322 mm). Conclusion The accuracy and precision of the intraoral scanner for impression taking of an arch or single jaw sections compared to the conventional impression with irreversible elastic impression materials has been investigated several times. For the occlusal shaping of the later prosthetic restoration, a precise measurement of the intermaxillary relation is also indispensable. The investigations to date have mostly been made by analyzing the contact points arising from the assignment of the upper and lower jaw. For the first time in this study, a three-dimensional deviation of the intermaxillary relation could be recorded for different relation determinations. The measurement results show that the Trios 3 can be used to perform a much more exact and at least precise registration as with the conventional methods. In some cases, this results in an intermeshing of the models, which results in partly negative signs. In conclusion, it can be said that in prosthetic restorations made on the basis of an intraoral digital impression with the Trios 3, less complicated occlusal measures occur, because a bite elevation in the bite registration is less likely.Zusammenfassung Hintergrund und Ziele In der aktuellen Literatur wird davon ausgegangen, dass es während der konventionellen Bissregistrierung mit einem irreversibel elastischen Registriermaterial, welches im plastischen Zustand auf die Zahnreihe gegeben wird, zu Relationsveränderungen vorrangig in der Vertikalebene zwischen Ober- und Unterkiefer kommt. Dies wurde bisher meist mit Hilfe quantitativer Auswertung der okklusalen Kontaktpunkte dargestellt. Hierbei kann nur das Resultat der Abweichung von der Ursprungssituation erfasst werden, aber nicht das Ausmaß und die Richtung dieser Deviation. Bei der digitalen Bissnahme mit einem Intraoralscanner kann auf ein Registriermaterial verzichtet werden und macht Diskussionen über die dimensionsverändernden Nachteile des Registriermaterials und der Registratnahme hinfällig. Ziel dieser Arbeit ist es, die dreidimensionale Abweichung der Relation von Oberkiefer zu Unterkiefer in maximaler Interkuspidation bei digitaler und konventioneller Bissnahme miteinander zu vergleichen und mit Hilfe eines industriellen optischen Scanners in allen drei Raumebenen metrisch zu erfassen. Methoden In dieser Studie wurden jeweils 15 Durchbissregistrate bzw. Bissregistrierungen mit dem Trios 3 (3shape, Kopenhagen), Futar D und Futar Scan (Kettenbach, Eschenburg) an einem Mastermodell angefertigt. Die Digitalisierung des Mastermodells und der konventionellen Kieferrelationsbestimmung (Futar D) erfolgte mit einem industriellen Scanner (Atos So4 II, GOM mbH, Braunschweig). Im Labor fand die digitale Übertragung der Kieferrelation mit dem Laborscanner D700 (3shape, Kopenhagen) über den Scan der Gipsmodelle und einem Bissscan mit Futar D- bzw. Futar Scan-Registrat als auch über den Scan des Registrats (Futar Scan) selber statt. Die Scans der Bissregistrierung mit dem Trios 3 (3Shape, Kopenhagen) und die digitalisierten Registrierungen der übrigen Gruppen wurden in die Auswertungssoftware „GOM Inspect Professional“ importiert. Über eine „Best-Fit“- Registrierung mit einem maximalen Abstand von 0,500 mm wurden die Oberkiefermodelle mit dem Oberkiefermastermodell zusammengefügt. Die Diskrepanz zwischen den Unterkiefermodellen zum Unterkiefermastermodell wurde anschließend in der X-, Y-, Z-Achse als auch in der Rotation um die X-, Y-, und Z-Achse ermittelt. Die Abweichungen wurden graphisch in Boxplot-Diagrammen dargestellt. Der statistische Vergleich zwischen den Registrierverfahren und den Raumdimensionen erfolgte mit Hilfe des Kruskal-Wallis Test und dem Mann-Whitney U-Test. Ergebnisse und Beobachtungen Die Statistik zeigte im Vergleich der Bissregistrierungen mit dem Trios 3 (3Shape, Kopenhagen) gegenüber den weiteren Versuchsgruppen eine signifikante Abweichung. Dabei stechen in erster Linie die Ergebnisse hervor, die sich bei der dreidimensionalen Analyse der Z-Achse ergeben haben, die die Genauigkeit der vertikalen Dimension bei intermaxillären Kieferrelationsbestimmung wiedergibt. Die geringste durchschnittliche Abweichung in der Z-Achse betrug -0,044 mm beim Trios 3 (3Shape, Kopenhagen). Mit der Zuordnung mittels des Futar-Scan-Bissregistrates konnte die maximale durchschnittliche Abweichung mit 0,438 mm erfasst werden. Es zeigt sich, dass die Bissnahme mit der Trios Bissregistrierung (Bukkalscan) gegenüber den anderen Registriermethoden eine höhere Genauigkeit aufweist (Futar D 0,355 mm, Futar D Laborscanner 0,406 mm, Futar Scan Biss 0,145 mm, Futar Scan 0,438 mm) und bei einer Standardabweichung von 0,07 mm eine vergleichbare Präzision wie mit den Registriersilikonen (Futar D SD = 0,079 mm; Futar Scan SD = 0,322 mm) zu erwarten ist. Schlussfolgerung Die Genauigkeit und Präzision der Intraoralscanner bei der Abformung eines Kieferbogens bzw. einzelner Kieferabschnitte gegenüber der konventionellen Abformung mit irreversiblen elastischen Abformmaterialien wurde bislang schon mehrfach untersucht. Für die okklusale Gestaltung der späteren prothetischen Restauration ist ebenso eine präzise Erfassung der intermaxilläre Relation unabdingbar. Die bisherigen Untersuchungen erfolgten hierzu meist über die Analyse der aus der Zuordnung von Ober- und Unterkiefer entstehenden Kontaktpunkte. Erstmals konnte in dieser Studie eine dreidimensionale Abweichung der intermaxillären Relation bei unterschiedlichen Relationsbestimmungen erfasst werden. Die Messergebnisse zeigen, dass mit dem Trios 3 eine genauere und mindestens so präzise Registrierung möglich ist, wie mit den konventionellen Methoden. Es kommt dabei in manchen Fällen sogar zu einem „ineinander“ matchen der Modelle, was die Ergebnisse mit teils negativen Vorzeichen belegen. Schlussfolgernd kann man sagen, dass es bei prothetischen Restaurationen, welche auf Grundlage einer intraoralen digitalen Abformung mit dem Trios 3 hergestellt wurden, es weniger zu aufwendigen Einschleifmaßnahmen der Okklusion kommt, da Bisserhöhungen bei der Bissregistrierung unwahrscheinlicher sind.

Untersuchungen zur Rolle der Glutathion-Peroxidase 4 als möglicher Redox-Sensor in Säugetierzellen

GPx4 besitzt vielfältige Funktionen im Redox-Metabolismus von Zellen. Ursprünglich wurde sie als ein Enzym beschrieben, das hoch effizient Phospholipidhydroperoxide zu den entsprechenden Alkoholen unter GSH-Verbrauch reduzieren kann. Weiterhin hatte sich in den letzten 10 bis 15 Jahren gezeigt, dass sie eine essenzielle Rolle als Thiolperoxidase in der Spermienreifung ausübt. Eine weitere Funktion stellt möglicherweise die eines Redox-Sensors dar, der auf die Änderung des zellulären Redox-Milieus mit der Aktivierung von antioxidativen Zellsignalwegen reagiert. Diese Funktion konnte bislang nur für das GPx4-Homolog in der Hefe nachgewiesen werden und kann aufgrund der Rolle, die die GPx4 bei der Spermienreifung in Mäusen spielt, auch für Säugetiere postuliert werden. Es handelt sich dabei um die Fähigkeit der GPx4 in ihrer Funktion als Thiolperoxidase Disulfid- oder auch Selenylsulfidbindungen zwischen anderen Proteinen zu bilden. Dabei ist die GPx4 vermutlich auch in der Lage, ihre eigenen Cysteine als Substrat zu akzeptieren, was allerdings im Falle der Spermienreifung zu einer Inaktivierung der peroxidativen Funktion führt. Diese Thiolperoxidasefunktion ist abhängig von der Menge an freiem GSH. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war es, mögliche Interaktionspartner in somatischen Zellen zu identifizieren, wobei die Thiolperoxidasefunktion der GPx4 bei Änderung des zellulären Redox-Milieus in Form von oxidativem Stress ausgenutzt werden sollte. Als Methode wählten wir ein modifiziertes Tandem-Affinity-Purification-enhanced-Verfahren (TAPe). Mit Hilfe dessen wurde eine mit einem Strep/Flag-Tag versehene GPx4 oder verschiedene Mutanten stabil in induzierbaren GPx4 Knockout murinen embryonalen Fibroblasten exprimiert, sodass die getaggte GPx4 mittels des TAPe Verfahren aus den Zellen aufgereinigt werden konnte. Um intrazelluläre GSH-Konzentrationen zu reduzieren und die GPx4 zu oxidieren, wurden die Zellen vor der Lyse mit BSO und tBOOH vorbehandelt. Die Eluate aus diesen Aufreinigungen wurden anschließend anhand der Massenspektrometrie, Silberfärbung und Western Blots analysiert. Es ließen sich eine ganze Reihe von Proteinen identifizieren, die ebenfalls eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung des intrazellulären Redox-Milieus spielen und an der Regulierung von Zellsignalwegen beteiligt sind. Nach den bisherigen Analysen bedarf es aber noch einer Bestätigung mittels co-Immunpräzipitation und Immunoblot-Analysen. Besonders aktuelle Erkenntnisse, die neue Zelltodsignalwege, wie zum Beispiel die Ferroptose, analysieren, stellen eine interessante und äußerst relevante Richtung für zukünftige Projekte in der Erforschung der GPx4 und ihrer Rolle als Redox-Sensor und Regulator von Zelltodsignalwegen dar