Aspectos morfológicos dos órgãos genitais femininos do gambá (Didelphis sp.)

Eight reproductive systems of opossum females of had been collected (Didelphis sp). Five, had been destined to macrocospic study and three to the microscopical study. These animals were died and fixeded in the Department of Anatomy of the UNIfeob, with formaldehyde 10% from Araçatuba scientific creator - IBAMA. For macrocospic analysis, the reproductive systems had been removed, keeping to its positions "in situ" and were carried through the photographic documentation for macrocospic results. For the microscopical study, the reproductive system was processed routinely by the technique of inclusion in similar of paraffin and cut with 5µm thickness, and the cuts had been stained in HE, Toluidin blue, Picrosirius, PAS (periodic acid Shiff reaction) and tricromo de Masson16, 17. The feminine reproductive system of the opossum was compose for two ovaries, double uterus, two lateral vagins and between these a pseudovaginal canal, these three structures if they join forming the urogenital sinus locking up in a "pubic mount" or genital tubercle, forming an internal common opening to the anus and vulva, call of pseudocloaca or urogenital sinus. Microscopically the ovarios were functional with mono and poliovulares follicles. The uterine tube was characteristic, coated for ciliad prismatic epithelium. The uterine horns had presented epithelium of ciliad prismatic covering. The urogenital sinus presented three tubular structures. Vulva presented the same characteristics of the skin.Foram coletados oito sistemas reprodutores de fêmeas de gambás (Didelphis sp). Destes cinco, foram destinados ao estudo macroscópico e três ao estudo microscópico. Estes animais encontravam-se fixados no Departamento de Anatomia da UNIfeob, em formaldeído a 10%, provenientes do Criatório Científico de Araçatuba (IBAMA). Para análise macroscópica, os sistemas reprodutores foram retirados, guardando-se as devidas posições "in situ" e foi realizada a documentação fotográfica para resultados macroscópicos. Para o estudo microscópico, o sistema reprodutor foi processado rotineiramente pela técnica de inclusão em Paraplast e cortadas em micrótomo, com espessura média de 5 mm, e os cortes foram corados em HE, Azul de Toluidina, Picrosírius, PAS e tricromo de Masson16,17 . O sistema reprodutor feminino do gambá era composto por dois ovários, útero duplo, duas vaginas laterais e entre estas um canal pseudovaginal, estas três estruturas se unem formando o seio urogenital encerrando em um "monte" púbico ou tubérculo genital, formando uma abertura comum interna ao ânus e a vulva, chamada de pseudocloaca ou seio urogenital. Microscopicamente os ovários eram funcionais com folículos mono e poliovulares. A tuba uterina era característica, revestida por epitélio prismático ciliado. Os cornos uterinos apresentaram epitélio de revestimento prismático ciliado. O seio urogenital apresentou três estruturas tubulares. A vulva apresentou as mesmas características da pele

Generation of canine pluripotent stem cells: factors involved in the establishment of reprogramming by gene induction

A produção de células-tronco induzidas (iPSC) a partir de fibroblasto fetal canino abre caminhos para a obtenção de células pluripotentes e o estudo de sua aplicabilidade para terapias alternativas na medicina veterinária. Neste contexto, este trabalho investigou metodologias adequadas avaliando a eficiência destas, para a produção de células-tronco pluripotentes no modelo canino in vitro (CTE-like), uma vez que a produção de células-tronco embrionárias verdadeiras, cultivadas a partir da MCI de blastocistos, ainda não foi completamente caracterizada em animais domésticos. Os experimentos visaram o aumento do conhecimento de fatores envolvidos no processo de reprogramação em cães, bem como a produção de tais linhagens e sua completa caracterização. No primeiro experimento, foi comparada a infecção retroviral, já padronizada por diversos grupos, com a reprogramação epissomal, inédita para a espécie, na tentativa de induzir células à pluripotência sem a integração viral, e ainda, estratégias para o aumento da eficiência de reprogramação, onde o plasmídeo epissomal foi somado a fatores de transcrição. A reprogramação epissomal gerou colônias quando acrescida do fator c-MYC, que provavelmente, aumentou a proliferação destas células produzindo colônias iPS com morfologia típica e positivas para o teste da fosfatase alcalina. Tais resultados, ainda preliminares pra conclusões, são essenciais para o processo de obtenção de linhagens sem a integração viral, aumentando a aplicabilidade na terapia celular. No segundo experimento objetivou-se avaliar os fatores OCT4 e SOX2 associados a proteínas repórteres. Os fibroblastos que receberam estes fatores, foram analisados por citometria de fluxo, permitindo a avaliação da influência de cada fator no processo de reprogramação, além de permitir a separação (sorting) das células que integraram o gene, aumentando a eficiência de reprogramação e o conhecimento biológico dos mecanismos de integração rastreados por uma proteína repórter. A análise por microscopia de fluorescência revelou que a distribuição de proteínas repórteres foi semelhante entre as duas diferentes construções proteicas e que não se restringe a uma região da célula em particular. OCT4 e SOX2 mostraram uma elevada expressão exógena de cada gene alvo, bem como células dupla positivas. No entanto, nenhuma interação foi observada pelo menos 6 dias após a transdução. O último capítulo experimental descreveu o mecanismo de reprogramação por integração lentiviral para indução da pluripotência em fibroblastos fetais de cão. As linhagens obtidas e completamente caracterizadas neste estudo foram independentes de LIF ou qualquer outra suplementação com inibidores, resistentes ao repique enzimático (Tryple Express), sendo apenas bFGF dependentes. Foram obtidas 66 linhagens clonais, das quais 10 (7 h+mOSKM e 3hOSKM) se mantiveram por 15 ou mais passagens e foram utilizadas para todos os testes de caracterização in vitro, com eficiência máxima de reprogramação de 0,001%. Todas as colônias foram positivas para o teste da fosfatase alcalina, bem como formaram corpos embrióides e se diferenciaram de forma espontânea, além de expressarem altos níveis dos fatores endógenos OCT4 e SOX2. In vivo, as colônias foram capazes de desenvolver tumor 120 dias após a inoculação (confirmado por análise histopatológica) comprovando sua origem predominantemente mesodérmica. A integridade cromossomal das linhagens foi avaliada por hidridização FISH, que não evidenciou qualquer tipo de anomalia. A completa caracterização de tais linhagens, bem como os experimentos não integrativos e com fatores associados a proteínas repórteres, aumentam o conhecimento da tecnologia de reprogramação, estabelecendo novas estratégias para indução da pluripotência de forma mais eficaz e segura para seu uso em testes clínicos e terapia celularThe production of induced pluripotent stem cells (iPSC) from canine fetal fibroblast opens new ways for obtaining pluripotent cells and study its applicability for alternative therapies in veterinary medicine. In this context, this study investigated appropriate methods for producing pluripotent stem cells using a in vitro canine model (ESC-like), so far the production of true embryonic stem cells from ICM cultured blastocysts has not been fully characterized in domestic animals. The experiments aimed at increasing knowledge of the factors involved in reprogramming process in dogs, as well as the production of such strains and complete characterization. In the first experiment, a retroviral infection was compared to episomal reprogramming (never done for this specie) in an attempt to induce cells to pluripotency state without viral integration, also to observe the development of cells receiving separately the episomal plasmid plus transcription factors. The generation of colonies was possible only in the episomal plus c-MYC factor group, leading to increased cell proliferation producing iPS colonies with typical morphology and positive for the alkaline phosphatase detection. These results, so far as preliminary conclusions, are essential to obtaining strains without viral integration, increasing its applicability for clinical cell therapy. In the second experiment, we aimed to evaluate the OCT4 and SOX2 factors associated with fluorescent reporter proteins. These were analyzed by flow cytometry allowing the performance evaluation of each factor on the reprogramming process the fluorescence activated separation of cells containing the integrated gene, increasing the enriching the efficiency of reprogramming. Fluorescence microscopy analysis showed that the distribution of reporter protein was similar between the two different protein structures and not restricted to a particular cell region. OCT4 and SOX2 showed a high exogenous expression of each target gene, and double positive cells. However, no colony formation was observed at least 6 days after transduction. The last experimental chapter aimed to described the reprogramming mechanism of lentiviral integration to induce pluripotency in dog fetal fibroblasts. The lines obtained were fully characterized in this study, showing independency of LIF or any other supplemental inhibitors, resistance to enzymatic process (Tryple Express) and bFGF dependency only. A total of 66 clonal strains were obtained (hOSKM and h+mOSKM) while 10 (7 h+m and 3h) were maintained for 15 or more passages and used for in vitro characterization tests, with maximum efficiency of reprogramming 0.001% . All colonies were positive for the alkaline phosphatase detection, embryoid bodies formation, spontaneously differentiated and expressed high levels of endogenous OCT4 and SOX2. In vivo, the colonies were able to developed tumors 120 days after inoculation (confirmed via histopathology analysis), with predominantly mesodermal tissues. Chromosomal evaluations were made by FISH hybridization showing no chromosomal abnormality in iPSCs canine lines. The fully characterization of such lines as well as non-integrated experiments and factors associated via reporter proteins increases the knowledge of the iPSCs technology, establishing new strategies for more efficient and safe induction of pluripotency for potential use in cell therapy and clinical trial

Cyanobacterial diversity in the phyllosphere of the Atlantic Forest of São Paulo state

A Mata Atlântica brasileira, atualmente, está reduzida a pequenos fragmentos florestais protegidos em unidades de conservação, que representam apenas 7,6% de sua área original. O Parque Estadual da Serra do Mar (PESM), localizado no estado de São Paulo é a maior área de proteção integral deste bioma do litoral brasileiro. A superfície da folha de árvore (filosfera) oferece uma grande área de habitat para os micro-organismos, mas constitui um ambiente extremo. O desenvolvimento de comunidades microbianas é dependente de fonte de carbono e de nutrientes essenciais inorgânicos comumente liberados pela planta para a sua superfície. No entanto, um grupo especial de bactérias, Cyanobacteria, é menos dependente da planta para sua nutrição, pois estes organismos são autotróficos para carbono e nitrogênio. Portanto, Cyanobacteria é particularmente interessante para se avaliar neste ambiente. Neste estudo, a comunidade de cianobactérias colonizadoras das filosferas de uma área de conservação (PESM) da floresta ombrófila densa foi avaliada usando abordagens moleculares independente de cultivo. O DNA genômico de cianobactérias foi extraído da superfície de folhas das árvores Euterpe edulis e Guapira opposita de dois locais dentro do Parque, ou seja, núcleo de Picinguaba próximo ao nível do mar e núcleo Santa Virgínia a 800 metros de altitude. Além disso, as superfícies de folhas de Garcinia gardneriana encontrada apenas no núcleo de Picinguaba e de Merostachys neesii encontrada somente no núcleo de Santa Virgínia foram avaliadas. As análises da estrutura da comunidade de cianobactérias por PCR-DGGE mostraram que a colonização é dependente das espécies de plantas e independente das localizações das plantas. A análise da composição da comunidade de cianobactérias na superfície das folhas baseada nas bibliotecas de clones de RNAr 16S revelou que dentre um total de 980 clones obtidos, 22% deles pertenciam a 10 gêneros conhecidos. Cerca de 78% dos clones restantes foram filotipos de cianobactérias não cultivadas. As coberturas das bibliotecas de clones de RNAr 16S variaram de 70 a 85%, e as curvas de rarefação (a 5% distância evolutiva) indicaram um bom suporte para esses dados. Após o alinhamento das seqüências, 384 UTOs foram geradas, sendo 257 UTOs de sequências únicas, sugerindo que as filosferas avaliadas têm alta riqueza e diversidade. A comparação da comunidade de cianobactérias entre as filosferas (b-diversidade), utilizando a ferramenta estatística -libshuff, mostrou que estes ambientes abrigam táxons distintos em seu filoplano, em concordância com os dados de PCR-DGGE. A predominância de sequências de RNAr 16S das ordens Nostocales e Synechococcales foi observada dentre as cianobactérias descritas. Entre essas, um número elevado de sequências relacionadas com gêneros capazes de fixar N2 foram encontradas. As espécies G. opposita e E. edulis em Santa Virgínia e E. edulis em Picinguaba apresentaram níveis elevados de índice de diversidade de Simpson (0,01), enquanto M. neesii teve o maior índice de riqueza ACE (405,1 ± 139,24). A quantificação de cianobactérias utilizando PCR em tempo real também mostrou que M. neesii é a espécie de planta com maior número de cópias de RNAr 16S por cm2 de folha. Os resultados deste estudo mostraram que as cianobactérias da filosfera desse ecossistema de floresta tropical são influenciadas pelas espécies de plantas e um número elevado de táxons permanecem por ser descritos.The Brazilian Atlantic rainforest currently is reduced to small forest fragments protected in conservation units, representing only 7.6% of its original area. The Serra do Mar State Park (SMSP) located in São Paulo state is the largest fully protected area of this biome in the Brazilian coast. The plant leaf surface (phyllosphere) offer a large habitat area for microorganisms but constitute rather an extreme environment. The development of microbial communities is dependent of carbon source and certain essential inorganic nutrients commonly released from the plant to its surface. However, a special group of bacteria, Cyanobacteria, is less dependent of the plant for their nutrition since these organisms are autotrophic for carbon and nitrogen. Therefore, cyanobacteria are particularly interesting to be evaluated in this environment. In this study, the cyanobacteria community colonizing phyllospheres in a protected conservation area of the ombrophilous dense rainforest of SMSP was assessed using cultivation-independent molecular approaches. Cyanobacteria genomic DNA were extracted from surface leaves of the Euterpe edulis and Guapira opposita trees of two locations inside of the Park, i.e., Picinguaba nucleus close to the sea level and Santa Virginia nucleus at 800 meters of altitude. Also, surface leaves of Garcinia gardneriana found only in the Picinguaba nucleus and Merostachys neesii found only in Santa Virginia nucleus were evaluated. The analyses of cyanobacterial community structure by PCR-DGGE showed that colonization is dependent of the plant species and independent of plants locations. The analysis of composition of cyanobacterial community in the surface leaves based on16S rRNA clones libraries revealed that among a total of 980 clones obtained, 22% of them belonged to 10 known genera. About 78% of the remaining clones were uncultured cyanobacteria phylotypes. The 16S rRNA clone libraries coverage ranged from 70 to 85%, and the rarefaction curves (at 5% evolutionary distance) indicated a good support for these data. After sequences alignment, 384 OTUs were generated, with 257 OTUs of them being unique sequences, suggesting that the phyllospheres evaluated have high richness and diversity. Comparison of cyanobacterial community among the phyllospheres (b-diversity) using statistical -libshuff tool, showed that these environments harbor distinct taxa in their phylloplane, in agreement to PCRDGGE data. A predominance of 16S rRNA sequences of the orders Nostocales and Synechococcales was observed within the known cyanobacteria. Among those, a high number of sequences related with genera capable to fix N2 were found. The species G. opposita and E. edulis located in Santa Virginia and E. edulis in Picinguaba showed high levels of Simpson diversity index (0.01), while M. neesii had the highest ACE richness index (405.1 ± 139.24). The cyanobacterial quantification using real time PCR also showed that M. neesii is the plant species with the highest number of copies of 16S rRNA per cm2 of leaf. The results of this study showed that phyllosphere cyanobacteria in this rainforest ecosystem are influenced by plant species and a high number of taxa remaining to be described

Morphological aspects of genital female of the opossum (Didelphis sp.)

Foram coletados oito sistemas reprodutores de fêmeas de gambás (Didelphis sp). Destes cinco, foram destinados ao estudo macroscópico e três ao estudo microscópico. Estes animais encontravam-se fixados no Departamento de Anatomia da UNIfeob, em formaldeído a 10%, provenientes do Criatório Científico de Araçatuba (IBAMA). Para análise macroscópica, os sistemas reprodutores foram retirados, guardando-se as devidas posições "in situ" e foi realizada a documentação fotográfica para resultados macroscópicos. Para o estudo microscópico, o sistema reprodutor foi processado rotineiramente pela técnica de inclusão em Paraplast e cortadas em micrótomo, com espessura média de 5 mm, e os cortes foram corados em HE, Azul de Toluidina, Picrosírius, PAS e tricromo de Masson16, 17. O sistema reprodutor feminino do gambá era composto por dois ovários, útero duplo, duas vaginas laterais e entre estas um canal pseudovaginal, estas três estruturas se unem formando o seio urogenital encerrando em um "monte" púbico ou tubérculo genital, formando uma abertura comum interna ao ânus e a vulva, chamada de pseudocloaca ou seio urogenital. Microscopicamente os ovários eram funcionais com folículos mono e poliovulares. A tuba uterina era característica, revestida por epitélio prismático ciliado. Os cornos uterinos apresentaram epitélio de revestimento prismático ciliado. O seio urogenital apresentou três estruturas tubulares. A vulva apresentou as mesmas características da peleEight reproductive systems of opossum females of had been collected (Didelphis sp). Five, had been destined to macrocospic study and three to the microscopical study. These animals were died and fixeded in the Department of Anatomy of the UNIfeob, with formaldehyde 10% from Araçatuba scientific creator - IBAMA. For macrocospic analysis, the reproductive systems had been removed, keeping to its positions "in situ" and were carried through the photographic documentation for macrocospic results. For the microscopical study, the reproductive system was processed routinely by the technique of inclusion in similar of paraffin and cut with 5µm thickness, and the cuts had been stained in HE, Toluidin blue, Picrosirius, PAS (periodic acid Shiff reaction) and tricromo de Masson16, 17. The feminine reproductive system of the opossum was compose for two ovaries, double uterus, two lateral vagins and between these a pseudovaginal canal, these three structures if they join forming the urogenital sinus locking up in a "pubic mount" or genital tubercle, forming an internal common opening to the anus and vulva, call of pseudocloaca or urogenital sinus. Microscopically the ovarios were functional with mono and poliovulares follicles. The uterine tube was characteristic, coated for ciliad prismatic epithelium. The uterine horns had presented epithelium of ciliad prismatic covering. The urogenital sinus presented three tubular structures. Vulva presented the same characteristics of the ski