Complexos naturais altamente diluídos alteram parâmetros de malignidade em melanoma murino

Orientador : Profª. Drª. Carolina Camargo de OliveiraCoorientador : Prof. Dr. Edvaldo da Silva TrindadeDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 24/03/2016Inclui referências : f. 74-83Resumo: O melanoma compreende a maior causa de morte por cancer de pele, pois e altamente refratario as terapias existentes. Celulas tumorais apresentam mutacoes somaticas responsaveis pela ativacao constitutiva de vias de sinalizacao que normalmente seriam ativadas pela interacao de fatores de crescimento com seus receptores. Uma vez ativas em celulas de melanoma, essas vias levam a proliferacao continua das celulas e, consequentemente, a progressao da doenca ao promover escape da morte celular, expressao de oncogenes, invasividade, angiogenese e metastase. Alem disso, essas celulas apresentam alteracoes em diversas moleculas de adesao a outras celulas e a matriz extracelular, o que contribui para seu fenotipo agressivo e invasivo. As celulas cancerosas, apesar de suas caracteristicas fenotipicas adquiridas por alteracoes geneticas e epigeneticas, nao agem sozinhas no desenvolvimento da doenca. Os fibroblastos associados ao cancer estao envolvidos em todos os processos que levam as transformacoes fisiologicas que permitem as celulas cancerosas tornarem-se malignas, como a producao de moleculas de matriz extracelular e de proteinas de remodelacao dessa matriz, fornecendo sinais para a sobrevivencia, invasao e proliferacao das celulas cancerosas. Terapias para pacientes portadores de cancer, que utilizam altas diluicoes de compostos naturais, apresentam evidencias de eficacia, levando a melhoria do bem-estar. Nosso grupo de pesquisa tem obtido resultados interessantes com complexos naturais altamente diluidos, denominados M1 ou M8, em especial em melanoma, com estudos in vitro e in vivo. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo entender de que forma M1 ou M8 atuam sobre os mecanismos moleculares de celulas de melanoma murino in vitro, resultando na reducao de suas caracteristicas metastaticas, bem como avaliar se induzem algum tipo de alteracao no processo de comunicacao entre essas celulas cancerosas e fibroblastos. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com M1 foi capaz de reduzir a marcacao das celulas B16-F10 para N-caderina e aumentar para CD54, enquanto M8 reduziu as marcacoes para N-caderina e tambem CD44. Ambos tratamentos nao alteraram a marcacao para NG2, LAMP-1 e ƒÀ-catenina, bem como a ativacao de AKT. Ambos tratamentos com M1 ou M8 reduziram a capacidade das celulas B16-F10 de formar colonias a partir de si. Quando as celulas B16-F10 foram cocultivadas com fibroblastos Balb/3T3 nao houve alteracao na marcacao para CD44 e ƒ¿-SMA apos ambos os tratamentos. M8 foi capaz de inibir a sintese/liberacao de acido hialuronico no sobrenadante da cocultura, bem como a marcacao para N-caderina no extrato celular. Tanto M1 quanto M8 nao causam alteracoes nos padroes de proliferacao e viabilidade quando aplicados sobre os fibroblastos isolados. A atividade da MMP-2 secretada no sobrenadante das culturas nao foi alterada para B16-F10, porem mostrou-se reduzida na cocultura. Com esse trabalho foi possivel demonstrar que os tratamentos com M1 e com M8, alem de seguros possuem atividade seletiva modulando as caracteristicas tumorais, levando-as a um fenotipo de menor malignidade. Palavras-chave: B16-F10. Altas diluicoes. Moleculas de adesao. Comunicacao celular. Microambiente tumoral.Abstract: Melanoma comprises the leading cause of death from skin cancer, especially because it is highly refractory to existing therapies. Tumor cells exhibit somatic mutations responsible for constitutive activation of signaling pathways that would normally be activated by the interaction of growth factors with their receptors. Once active in melanoma cells, these pathways lead to continued cells proliferation and, therefore, the disease progression by promoting cell death scape, oncogene expression, cell survival, invasiveness, angiogenesis and metastasis. Moreover, these cells present changes in several adhesion molecules to other cells and to the extracellular matrix that contributes to their aggressive and invasive phenotype. Cancer cells, despite their phenotypic characteristics acquired by genetic and epigenetic alterations, do not act alone in the development of the disease. Cancer-associated fibroblasts are involved in all the processes leading to physiological changes that allow cancer cells to become malignant, such as the production of extracellular matrix molecules, and its remodeling, providing survival signals, and promoting cancer cells invasion and proliferation. Therapies for cancer patients using high dilutions of natural compounds present evidence of efficacy leading to improved welfare. Our research group has obtained interesting in vitro and in vivo results with highly diluted natural complexes, called M1 and M8, particularly in melanoma studies. Thus, this study aimed to understand how M1 and M8 act on the molecular mechanisms of murine melanoma cells in vitro, resulting in reduced metastatic characteristics and also assess whether they induce changes in the communication process between these cancerous cells and fibroblasts. The results showed that treatment with M1 was able to reduce B16-F10 cells labeling for N-cadherin and increase to CD54, while M8 reduced N-cadherin and CD44 labeling. No alterations were observed on NG2, LAMP-1, ?-catenin, and AKT activation; on the other hand, B16-F10 colony formation capacity was decreased by both treatments. When B16-F10 cells were co-cultured with Balb/3T3 fibroblasts there were no changes in CD44 and ?-SMA labeling after both treatments. M8 was able to inhibit hyaluronic acid synthesis/release by cells to coculture supernatant, as well as N-cadherin cell expression. Fibroblasts proliferation and viability were not altered by any treatment. The activity of MMP-2 secreted into the cultures supernatant was not changed for B16-F10 alone but was reduced in coculture with fibroblasts. The current work demonstrated that treatments with M1 and M8 are safe and have selective activity modulating tumor characteristics, leading to a less malignant phenotype. Keywords: B16-F10. High dilutions. Adhesion molecules. Cell communication. Tumor microenvironment

Ação de complexo natural altamente diluído no processo de cicatrização da pele em camundongos utilizando os modelos de incisão suturada e excisão da pele

Orientadora: Carolina Camargo de OliveiraCoorientador: Dorly de Freitas BuchiMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasResumo : A pele é o maior órgão do nosso corpo e serve como uma barreira contra agressões externas. Ela é estruturalmente organizada em duas camadas: epiderme e derme, respectivamente de fora para dentro. Cicatrização é um processo fisiológico dinâmico e complexo que representa a resposta do organismo frente a lesões. Esse processo é dividido em quatro fases que se complementam e se sobrepõem espacial e temporalmente: hemostase, inflamatória, proliferativa e de remodelação. Os complexos naturais altamente diluídos compreendem uma combinação de vários compostos diferentes tidos como úteis para determinados sintomas ou doença. A utilização de altas diluições de compostos naturais vem crescendo, fazendo necessários estudos que comprovem sua eficácia e segurança. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo verificar os efeitos do complexo natural altamente diluído denominado M1, administrado topicamente em forma de gel, sobre o processo de cicatrização da pele em camundongos utilizando dois modelos, o de incisão suturada com fio absorvível ou não absorvível e o de excisão da pele. No primeiro modelo, foi feita uma incisão longitudinal no dorso de camundongos, a qual foi suturada com fio absorvível ou não absorvível. Os animais foram tratados topicamente com gel de carbopol contendo 10% de M1 ou não (controle), por 3 dias consecutivos. A pele do local da incisão foi coletada e processada para histologia com coloração tricrômico de Gomori a fim de verificar a reepitelialização e migração do tecido conjuntivo. No modelo de excisão, foram induzidas duas feridas circulares no dorso dos camundongos, as quais foram tratadas topicamente com gel contendo M1 ou não, por 10 dias consecutivos e medidas nos dias 0, 3, 7 e 10 a fim de obter a curva de fechamento das feridas. No modelo de incisão, os animais suturados com fio absorvível e tratados por 3 dias com M1 não mostraram diferenças no número de cortes histológicos que apresentaram epiderme fechada, nem nas áreas de epiderme e tecido conjuntivo. Já os animais suturados com fio não absorvível e tratados com M1 mostraram maior número de cortes com epiderme fechada quando comparados aos controles, porém não apresentaram diferenças estatisticamente significativas na quantificação das áreas de epiderme e tecido conjuntivo. O fechamento da ferida e a qualidade da cicatrização variaram consideravelmente de acordo com a forma que os pontos eram feitos, dificultando as análises desse modelo. Quando utilizamos o modelo de excisão da pele não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos controle e M1 ao longo de 10 dias no que diz respeito à velocidade de fechamento da ferida. Concluímos, portanto, que o tratamento tópico com M1 na forma de gel não alterou significativamente o fechamento da epiderme e do tecido conjuntivo subjacente no modelo de incisão e sutura da pele, sendo que a metodologia empregada nesse modelo não foi a ideal para o estudo do processo de cicatrização da pele em camundongos. E também o tratamento com M1 não alterou significativamente a velocidade de fechamento da ferida no modelo de excisão da pele

Confining the Sol-Gel Reaction at the Water/Oil Interface:Creating Compartmentalized Enzymatic Nano-Organelles for Artificial Cells

Living organisms compartmentalize their catalytic reactions in membranes for increased efficiency and selectivity. To mimic the organelles of eukaryotic cells, we develop a mild approach for in situ encapsulating enzymes in aqueous-core silica nanocapsules. In order to confine the sol-gel reaction at the water/oil interface of miniemulsion, we introduce an aminosilane to the silica precursors, which serves as both catalyst and an amphiphilic anchor that electrostatically assembles with negatively charged hydrolyzed alkoxysilanes at the interface. The semi-permeable shell protects enzymes from proteolytic attack, and allows the transport of reactants and products. The enzyme-carrying nanocapsules, as synthetic nano-organelles, are able to perform cascade reactions when enveloped in a polymer vesicle, mimicking the hierarchically compartmentalized reactions in eukaryotic cells. This in situ encapsulation approach provides a versatile platform for the delivery of biomacromolecules.</p

Ouro e sílica na nanomedicina : materiais promissores para o desenvolvimento de novos tratamentos contra o câncer

Orientadora: Profa. Dra. Carolina Camargo de OliveiraCoorientadora: Profa. Dra. Izabel Cristina Riegel Vidotti MiyataTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 30/03/2020Inclui referências: p. 106-129Resumo: Nanotecnologia e nanociência compõem a base da inovação biomédica. Porém, um bom nanomaterial para esse fim deve, dentre outros, ser manipulável físico-quimicamente, ser biocompatível e liberar de forma controlada princípios ativos. Nesse sentido, ouro e silício apresentam grande destaque, uma vez que cumprem tais requisitos e apresentam ainda inúmeras outras vantagens. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar nanomateriais com potencial nanomédico. Primeiramente, buscou-se validar a utilização de nanopartículas de ouro estabilizadas pelo polissacarídeo natural goma arábica (GAAuNPs) como ferramenta para tratamento de melanoma. Inicialmente, sua estabilidade em ambiente biológico foi determinada utilizando técnicas de espectroscopia. Resultados obtidos mostram que os perfis de absorbância de luz e espalhamento de raios-X das GA-AuNPs foram mantidos após incubação por 4 dias em condições de cultivo celular, confirmando sua estabilidade em ambiente biológico. Na sequência, ensaios in vitro foram utilizados para determinar a capacidade de GA-AuNPs de alterar parâmetros celulares, assim como sua internalização por células tumorais. A exposição de células tumorais e não tumorais às GA-AuNPs mostrou ampla faixa de concentrações não citotóxicas, corroborando sua biocompatibilidade. Três concentrações não citotóxicas escolhidas foram internalizadas pelas células tumorais, de forma concentração-dependente, e majoritariamente através de endocitose. Em seguida, foi verificado o efeito de concentrações não citotóxicas sobre características de malignidade de células de melanoma metastático murino. Como resultado, as GA-AuNPs internalizadas interferiram com processos celulares fundamentais para a malignidade das células de melanoma, reduzindo suas capacidades invasiva e de formação de colônias. Por fim, ensaios in vivo de crescimento tumoral e metástase foram realizados a fim de confirmar os efeitos antitumoral e antimetastático, respectivamente. Pôde-se constatar que parte das GA-AuNPs foi capaz de reduzir o crescimento de tumores sólidos de melanoma de forma semelhante ao quimioterápico Dacarbazina. O tratamento induziu ainda alterações estruturais no tecido tumoral relacionadas à melhora do prognóstico: redução das áreas de morte celular e vascularização. Além disso, foi observada redução do tamanho dos nódulos metastáticos formados no pulmão. Nenhuma evidência de toxicidade foi observada in vivo após vasta análise sistêmica. Em resumo, GA-AuNPs apresentam alta estabilidade e biocompatibilidade, e ainda possuem atividade antitumoral e antimetastática intrínseca, que ocorre de forma independente de toxicidade. Segundo, buscou-se desenvolver nanocápsulas de sílica (SiNCs) com núcleo hidrofílico que comportassem o encapsulamento de proteínas. Para tal, foi utilizado o método de miniemulsão inversa. Alterações sistemáticas nas condições de síntese (pH, tipo e proporção entre os reagentes) foram realizadas para compreender o mecanismo de síntese das nanoestruturas. Resultados de microscopia eletrônica mostraram a obtenção de SiNCs com morfologia e tamanho homogêneos quando utilizadas apenas solução tampão ou água como fase aquosa. O mecanismo de síntese ocorreu através da polimerização dos precursores por atração eletrostática na interface óleo/água. Sendo assim, foi possível produzir SiNCs com núcleo hidrofílico em condições amenas de pH e sem adição de catalizadores químicos. Dessa forma, através dos resultados obtidos foi possível confirmar o potencial de utilização GAAuNPs como ferramenta ativa contra melanoma, assim como desenvolver SiNCs com potencial para abrigar biomoléculas capazes de atuar no tratamento de câncer, por exemplo. Palavras-chave: Nanopartículas. Nanocápsulas. Ouro. Sílica. Câncer.Abstract: Nanotechnology and nanoscience constitute the basis of biomedical innovation. However, a good nanomaterial for this purpose must be physicochemically manipulable and biocompatible; show controllable release of active ingredients; among others. In this sense, gold and silicon have a great prominence, since they fulfill these requirements and have many other advantages. Therefore, this study aimed to develop and validate nanomaterials with nanomedical potential. First, we sought to validate the use of gold nanoparticles stabilized by the natural polysaccharide gum arabic (GA-AuNPs) as tools for treating melanoma. Initially, its stability in a biological environment was determined using spectroscopy techniques. Results obtained show that the light absorbance and X-ray scattering profiles of GAAuNPs were maintained after incubation for 4 days in cell culture conditions, confirming their stability in a biological environment. Next, in vitro assays were used to determine the ability of GA-AuNPs to alter cellular parameters, as well as their internalization by tumor cells. The exposure of tumor and non-tumor cells to GAAuNPs showed a wide range of non-cytotoxic concentrations, corroborating their biocompatibility. Three chosen non-cytotoxic concentrations were internalized by tumor cells in a concentration-dependent manner, mostly through endocytosis. Then, the effect of non-cytotoxic concentrations on murine metastatic melanoma cells's malignant characteristics was verified. As result, internalized GA-AuNPs interfered with cellular processes fundamental to melanoma cells malignancy, reducing their invasive and colony-forming capabilities. Finally, in vivo tests of tumor growth and metastasis were performed in order to confirm the antitumor and antimetastatic effects, respectively. It was found that part of the GA-AuNPs was able to reduce the growth of solid melanoma tumors in a similar way to the chemotherapy drug Dacarbazine. The treatment also induced structural changes in tumor tissue related to improved prognosis: reduction of cell death and vascularization areas. In addition, a reduction in the lung metastatic nodules size was observed. No evidence of toxicity was observed in vivo after extensive systemic analysis. In summary, GA-AuNPs have high stability and biocompatibility, and show intrinsic antitumor and antimetastatic activity, which occur independently of toxicity. Second, we sought to develop silica nanocapsules (SiNCs) with a hydrophilic core that could allow protein encapsulation. Therefore, the inverse miniemulsion method was used. Systematic changes in synthesis conditions (pH, reagents type and proportion) were carried out to understand the nanostructures synthesis mechanism. Electron microscopy results showed the obtaining of SiNCs with homogeneous morphology and size when using only buffer solution or water as aqueous phase. The synthesis mechanism took place through precursors polymerization by electrostatic attraction at the oil/water interface. Thus, it was possible to produce SiNCs with a hydrophilic core under mild pH conditions and without the addition of chemical catalysts. Thus, taken together, the obtained results confirmed the potential of using GA-AuNPs as an active tool against melanoma, as well as to develop SiNCs with the potential to house biomolecules capable of acting in the treatment of cancer, for example. Keywords: Nanoparticles. Nanocapsules. Gold. Silica. Cancer

In vitro attenuation of classic metastatic melanoma-related features by highly diluted natural complexes: molecular and functional analyses

Metastasis is responsible for the majority of deaths among patients with malignant melanoma. Despite recent advances, the majority of current and modern therapies are ineffective and/or financially unfeasible. Thus, in this study, we investigated two low-cost highly-diluted natural complexes (HDNCs) that have been shown to be effective against malignant melanoma in a murine model in vivo. The aim of this study was to determine the mechanisms through which these HDNCs directly affect melanoma cells, either alone or in an artificial tumor microenvironment, suppressing the metastatic phenotype, thus explaining previous in vivo effects. For this purpose, HDNC in vitro treatments of B16-F10 melanoma cells, alone or in co-culture with Balb/3T3 fibroblasts, were carried out. Molecular biology techniques and standard functional assays were used to assess the changes in molecule expression and in cell behaviors related to the metastatic phenotype. Melanoma progression features were found to be regulated by HDNCs. Molecules related to cell adhesion (N-cadherin, β1-integrin and CD44), and migration, extracellular matrix remodeling and angiogenesis were modulated. The cell migratory, invasive and clonogenic capacities were reduced by the HDNCs. No loss of cell proliferation or viability were observed. On the whole, the findings of this study indicate that HDNCs directly reprogram, molecularly and functionally, melanoma cells in vitro, modulating their metastatic phenotype. Such findings are likely to be responsible for the attenuation of tumor growth and lung colonization previously observed in vivo