Functional and genetic analysis of sexual reproduction in the thermodimorphic fungal pathogen Paracoccidioides spp

Tese de Doutoramento em Ciências da Vida e SaúdeParacoccidioides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii são fungos multinucleares e termo dimórficos, sendo também os agentes etiológicos da Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose que é endémica da América do Sul. Estima-se que a PCM afeta 10 milhões de pessoas em países da América Latina, sendo que o Brasil apresenta cerca de 80% dos casos relatados. Este fungo sofre uma transição morfológica da sua forma nãopatogénica, micelar e conídeos, existentes em temperaturas ambientes, para a forma de levedura que é patogénica na temperatura corporal dos mamíferos. Paracoccidioides apresenta um ciclo de vida assexuado. Entretanto, estudos recentes apoiam a existência de ciclo sexual em Paracoccidioides, pela: i) a existência no seu genoma de praticamente todos os genes homólogos necessários para a reprodução sexual em Ascomicetos, incluindo recetores de feromonas, membros da via de sinalização para reprodução sexuada e isoformas dos loci MAT1-1/MAT1-2, e ii) identificação de eventos de recombinação genética entre isolados do meio ambiente. Apesar destas evidências, a reprodução sexuada no género Paracoccidioides nunca foi observada na natureza ou em condições laboratoriais; contrariamente ao observado em espécies de géneros filogeneticamente próximos como Histoplasma e Aspergillus. Nesta tese, estudámos o processo de reprodução sexuada em Paracoccidioides sob diversos aspetos do processo de reprodução sexuada em Ascomicetos. Os nossos resultados mostram a baixa expressão dos genes que expressam os recetores das feromonas a e α (PREA e PREB, receptivamente), o gene da feromona α (PBα) e os genes MAT, nas formas de levedura e micélio em vários isolados de Paracoccidioides. O ensaio de indução realizado com a feromona sintética Pbα nas estirpes MAT1-2 de Paracoccidioides tinha como objetivo avaliar a resposta transcricional dos genes relacionados com a reprodução sexuada, entretanto a presença de Pbα falhou e não serviu como estímulo para a resposta da ativação da transcrição dos genes MAT1-2, PREB e STE12, sugerindo que as estirpes testadas são insensíveis à Pbα. As funcionalidades dos genes relacionados com a reprodução sexuada em Paracoccidioides foram analisadas através da expressão heteróloga desses genes em estipes mutantes de Saccharomyces cerevisiae que não possuíam os genes homólogos correspondentes. Nós demonstramos que as estirpes de S. cerevisiae que expressavam de forma heteróloga PREB respondiam à Pbα sintética, tanto como à Pbα extraída do sobrenadante de culturas de Paracoccidioides através da formação de shmoos e pela paragem de crescimento e ciclo celular. Estes resultados nos levaram a concluir que as estirpes de Paracoccidioides secretam a feromona alfa ativa no meio de cultura, que é capaz de ativar seu recetor cognitivo. Em A. nidulans e A. fumigatus, um grupo específico de proteínas reguladoras que respondem à presença da luz, denominadas proteínas Velvet, apresentam um papel crucial no ciclo sexual na ausência de luz. Através de análises in silico, nós demonstramos que Paracoccidioides tem proteínas que apresentam os domínios Velvet, demonstrando elevada homologia com os domínios das proteínas de Aspergillus. Além disso, o regulador negativo GprD e os reguladores positivos NsdD e LaeA da reprodução sexuada apresentam funções importantes durante o desenvolvimento sexual. Homólogos destes componentes também estão presentes no género Paracoccidioides. Neste estudo, nós analisamos os padrões de expressão génica destes genes na presença e ausência de luz em diferentes estirpes de Paracoccidioides. Nós concluímos que a expressão do MAT locus, dos genes Velvet, e dos reguladores LAEA, GPRD e NSD, ocorrem independente da presença de luz. Neste trabalho, nós também realizamos ensaios de reprodução sexuada com isolados de Paracoccidioides. Nós delineamos nossos ensaios, através das informações previamente publicadas relacionadas com os ensaios de reprodução sexuada em Aspergillus e Paracoccidioides, também usamos estirpes MAT1-1 e MAT1-2 de Paracoccidioides que expressam genes responsáveis pela resistência à dois antibióticos diferentes. Após oito meses de incubação em diferentes meios e no escuro, analisamos as células recolhidas da intersecção das duas estirpes de MAT locus opostos, co-cultivadas que eram resistentes à ambos antibióticos. Através de análise microscópica, encontramos estruturas semelhantes à esporulação, ondulação de hifas, típicas em estágios iniciais da reprodução sexuada, e ascomas revestidos por células Hülle. As morfologias observadas nessas estruturas são comuns entre Ascomicetos durante o desenvolvimento sexual. O cultivo de ascósporos das estruturas semelhantes à ascomata para posterior análise não foi possível ser realizado. Também efetuamos análise por PCR das células que se desenvolveram em meio seletivo com ambos antibióticos de forma a confirmar a recombinação genética resultante da reprodução sexuada, que seria demonstrada pela presença de genes parentais e dos genes responsáveis pela resistência aos antibióticos, derivados das estirpes parentais. Contudo, os resultados dessa análise não foram conclusivos. De forma geral, nossos resultados fornecem novos conhecimentos relativos à existência de um sistema de reprodução sexuada em Paracoccidioides, através da demonstração da ativação da via de sinalização da reprodução sexuada pelo reconhecimento de feromona-recetor, no sistema heterólogo. Também identificamos as proteínas Velvet e a homologia de seus domínios, assim como demonstramos que a expressão de tais genes é independente da luz. Finalmente, em nossos ensaios de reprodução sexuada fomos capazes de obter em Paracoccidioides estruturas comuns ao início da reprodução sexuada. Estes resultados apresentam novas indicações para: i) a identificação de experimentos que possuam as condições ideais para a reprodução sexuada de Paracoccidioides em condições laboratoriais; ii) descobrir os mecanismos moleculares e os componentes envolvidos neste processo.Paracoccidioides brasiliensis and Paracoccidioides lutzii are multinuclear thermodimorphic fungi and the etiological agents of paracoccidioidomycosis (PCM), a prevalent mycosis in South America. PCM is estimated to affect 10 million individuals in countries from Latin America, and Brazil present 80% of the diagnosed disease. The fungus undergoes a morphological transition from a non-pathogenic mycelial or conidial form at environmental temperatures to a multiple-budding pathogenic yeast form at the mammalian host temperature. Paracoccidioides is known to present an asexual cycle, but sexual reproduction in the Paracoccidioides genus was never observed, neither in nature nor under laboratory conditions. However, recent studies have revealed indications that support the existence of a sexual cycle in Paracoccidioides isolates. The first indication is that this fungus harbors homologues of most of the genes necessary for sexual reproduction in Ascomycetes, including pheromone receptors, mating signaling pathway components and MAT1-1/MAT1-2 idiomorphs. A second indication came from the discovery of recombination events in Paracoccidioides strains isolated from nature. This information supports the idea of the occurrence of sexual reproduction in the Paracoccidioides genus. Despite the presence of mating loci and all essential mating-pheromone signaling pathway genes and the discovery of such a mode of reproduction in the closely-related phylogenetic genera Histoplasma and Aspergillus, sexual reproduction in Paracoccidioides was never uncovered. In this thesis, we studied several aspects that are relevant for sexual reproduction in Ascomycetes. We present data showing low expression levels of the a- and α-pheromone receptor genes (PREA and PREB), the α-pheromone gene (PBα) and the MAT genes, in yeast and mycelia forms of Paracoccidioides isolates. Induction assays with synthetic α-pheromone were performed in P. brasiliensis MAT1-2 strains to assess the transcriptional response of mating-related genes, however Pbα failed to elicit transcriptional activation of MAT1-2, PREB and STE12, suggesting that the strains tested are insensitive to Pbα. Functionality of Paracoccidioides mating genes was further assessed by their heterologous expression in the corresponding Saccharomyces cerevisiae null mutants. We show that S. cerevisiae strains heterologously expressing PREB respond to Pbα either isolated from Paracoccidioides culture supernatants or in its synthetic form, by shmoo formation and by growth and cell cycle arrests. This led us to conclude that Paracoccidioides species secrete an active α-pheromone into the culture medium that is capable to activate its cognate receptor. In A. nidulans and A. fumigatus, a particular group of light-responsive regulatory proteins, named Velvet proteins, play a crucial role in the sexual cycle in the absence of light. In addition, the negative regulator GprD and positive regulator NsdD of sexual reproduction play an important role during the sexual development. Homologues of these components are also present in the Paracoccidioides genus. In this study, we therefore analyzed the gene expression patterns of these genes in the presence and absence of light in different Paracoccidioides strains. Through in silico analysis, we show that Paracoccidioides Velvet proteins harbor the Velvet domains present in the homologous proteins from Aspergillus. We conclude that expression of the mating locus (MAT), the Velvet genes, and regulators LAEA, GPRD and NSDD, occurs in a light-independent manner. Based on the presence and expression of these genes in Paracoccidioides isolates and their protein interactions as described in A. nidulans, a protein interaction model was also proposed for Paracoccidioides, that may be uncovered by further functional genomics and protein analysis. In this work, we also performed mating assays with Paracoccidioides isolates. We designed our mating assays taking advantage of previous information regarding mating assays in Aspergillus and Paracoccidioides, and used MAT1-1 and MAT1-2 Paracoccidioides strains that were marked with two different antibiotic resistance genes. After eight months of incubation on different media in the dark, we analyzed cells from the intersection of the two co-cultivated opposite mating types that were resistant to both antibiotics. By microscopic analysis we found structures that are similar to sporulation, the hyphae loops classical in early stages of sexual reproduction, and the ascoma structures surrounded by Hülle cells. The morphology observed in these structures is common among ascomycetes during sexual reproduction development. Cultivation of ascospores from the ascomata-like structures for further analysis however could not be achieved. We also performed PCR analysis on cells that had developed on both selective antibiotics in order to confirm genetic recombination resulting from sexual reproduction, as would be indicated by the presence of parental and antibiotic genes derived from both mating strains. However, the result of this analysis was not conclusive. Overall, our results provide new insights into the existence of a functional mating system in Paracoccidioides, by demonstrating signal activation by the mating α-pheromone-receptor system in a yeast model. Moreover, we identified Velvet proteins motifs in Paracoccidioides and showed that their gene expression is independent of light. Finally, we also achieved the development of early-stage sexual structures in Paracoccidioides mating assays. These data therefore provide novel directions for the experimental identification of the ideal conditions for Paracoccidioides sexual reproduction in laboratory and consequently uncover the molecular mechanisms and the components involved in this process

Regulação e caracterização de transportes de ácidos carboxílicos em Saccharomyces cerevisiae e Candida glabrata

Dissertação de mestrado em Genética MolecularOs estudos de endocitose e tráfego intracelular de proteínas da membrana plasmática, tais como transportadores e receptores em células eucariontes são de grande importância, visto que são processos altamente regulados que possuem grande relevância na fisiologia celular. Alterações nas condições ambientais (nutrientes e substratos) podem conduzir à endocitose de transportadores indesejados. O transportador de monocarboxilatos Jen1 em Saccharomyces cerevisiae tem-se revelado um excelente modelo eucarionte para dissecar geneticamente os mecanismos que regulam o tráfego intracelular de transportadores membranares, de acordo com alterações fisiológicas. Trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo demonstraram que a glucose induz a endocitose de Jen1, apenas em minutos, um processo dependente quer de fosforilação por Yck1, quer de ubiquitinação a cargo da ubiquitina ligase Rsp5. Este trabalho teve como objectivo estudar os mecanismos e sinais que regulam a endocitose de Jen1 em S. cerevisiae. Verificou-se que, para além da glucose, outros açúcares como a frutose e sacarose, conduziam a uma rápida internalização e degradação do transportador. Demonstrámos que a proteína Art4, pertencente a família dos adaptadores Arrestin-related trafficking (Art), é crucial para a internalização e perda de actividade de Jen1, induzida por glucose. Adicionalmente, tentámos identificar qual a via de sinalização que regula a endocitose de Jen1 após um pulso de glucose, a células crescidas em meio contendo ácido láctico. Verificou-se que Reg1, um componente da fosfatase Glc7 é essencial para a diminuição na actividade de Jen1, ao contrário do que se verifica para o sensor de glucose Gpr1. Numa outra vertente deste trabalho investigámos a capacidade de Candida glabrata, a segunda levedura patogénica mais prevalente em humanos, crescer em meios com diferentes fontes de carbono, nomeadamente meios contendo ácidos carboxílicos. Estes estudos fisiológicos foram estendidos a duas estirpes interrompidas em genes potencialmente codificantes para transportadores de ácido acético. Os resultados obtidos mostraram que a fonte preferencial de carbono em C. glabrata é a glucose e que todas as estirpes estudadas possuem dificuldade de crescimento em meio contendo ácido acético a pH 5,0. Esta caracterização constituiu uma base essencial para trabalhos futuros nesta levedura.Studies on the endocytosis and intracellular traffic of plasma membrane proteins such as transporters and receptors in eukaryotes cells are very important since they are highly regulated processes and very relevant to the cell physiology. The monocarboxylate transporter Jen1 of Saccharomyces cerevisiae, has proven to be an excellent eukaryotic model for genetically dissecting mechanisms that regulate intracellular trafficking of plasma membrane proteins, in response to physiological constraints. Previous work carried out by our group, demonstrated that glucose induces downregulation of Jen1 within minutes, a process dependent both on phosphorylation by Yck1 and ubiquitylation, carried out by the ubiquitin ligase Rsp5. One of the main goals of this work was to study the mechanisms and signals that regulate Jen1 endocytosis in S. cerevisiae. It was demonstrated that, in addition to glucose, other sugars such as fructose and sucrose trigger a rapid internalization and degradation of the transporter. We demonstrated that the protein Art4, belonging to the family of Arrestin-related trafficking proteins (Art) is crucial for Jen1 glucose induced downregulation. Additionally, we attempted to identify the signaling pathway that regulates Jen1 endocytosis, after a pulse of glucose to cells grown in a lactic acid containing media. We have shown that Reg1, a component of the Glc7 phosphatase, is essential for Jen1 downregulation, in contrast to what is observed for the glucose sensor Gpr1. In another scope of this work, we have studied the ability of Candida glabrata, the second most prevalent pathogenic yeast in humans, to grow in media containing different carbon sources, namely in media containing carboxylic acids. These physiological studies were extended to two other strains deleted in genes potentially coding for acetic acid transporters. The results obtained show that glucose is the preferential carbon source in C. glabrata and that all the studied strains have difficulties in growing in media containing acetic acid at pH 5,0, as the sole carbon and energy source. This physiological characterization is an essential base of study for future work

NEOTROPICAL CARNIVORES: a data set on carnivore distribution in the Neotropics

Mammalian carnivores are considered a key group in maintaining ecological health and can indicate potential ecological integrity in landscapes where they occur. Carnivores also hold high conservation value and their habitat requirements can guide management and conservation plans. The order Carnivora has 84 species from 8 families in the Neotropical region: Canidae; Felidae; Mephitidae; Mustelidae; Otariidae; Phocidae; Procyonidae; and Ursidae. Herein, we include published and unpublished data on native terrestrial Neotropical carnivores (Canidae; Felidae; Mephitidae; Mustelidae; Procyonidae; and Ursidae). NEOTROPICAL CARNIVORES is a publicly available data set that includes 99,605 data entries from 35,511 unique georeferenced coordinates. Detection/non-detection and quantitative data were obtained from 1818 to 2018 by researchers, governmental agencies, non-governmental organizations, and private consultants. Data were collected using several methods including camera trapping, museum collections, roadkill, line transect, and opportunistic records. Literature (peer-reviewed and grey literature) from Portuguese, Spanish and English were incorporated in this compilation. Most of the data set consists of detection data entries (n = 79,343; 79.7%) but also includes non-detection data (n = 20,262; 20.3%). Of those, 43.3% also include count data (n = 43,151). The information available in NEOTROPICAL CARNIVORES will contribute to macroecological, ecological, and conservation questions in multiple spatio-temporal perspectives. As carnivores play key roles in trophic interactions, a better understanding of their distribution and habitat requirements are essential to establish conservation management plans and safeguard the future ecological health of Neotropical ecosystems. Our data paper, combined with other large-scale data sets, has great potential to clarify species distribution and related ecological processes within the Neotropics. There are no copyright restrictions and no restriction for using data from this data paper, as long as the data paper is cited as the source of the information used. We also request that users inform us of how they intend to use the data

NEOTROPICAL XENARTHRANS: a data set of occurrence of xenarthran species in the Neotropics

Xenarthrans—anteaters, sloths, and armadillos—have essential functions for ecosystem maintenance, such as insect control and nutrient cycling, playing key roles as ecosystem engineers. Because of habitat loss and fragmentation, hunting pressure, and conflicts with domestic dogs, these species have been threatened locally, regionally, or even across their full distribution ranges. The Neotropics harbor 21 species of armadillos, 10 anteaters, and 6 sloths. Our data set includes the families Chlamyphoridae (13), Dasypodidae (7), Myrmecophagidae (3), Bradypodidae (4), and Megalonychidae (2). We have no occurrence data on Dasypus pilosus (Dasypodidae). Regarding Cyclopedidae, until recently, only one species was recognized, but new genetic studies have revealed that the group is represented by seven species. In this data paper, we compiled a total of 42,528 records of 31 species, represented by occurrence and quantitative data, totaling 24,847 unique georeferenced records. The geographic range is from the southern United States, Mexico, and Caribbean countries at the northern portion of the Neotropics, to the austral distribution in Argentina, Paraguay, Chile, and Uruguay. Regarding anteaters, Myrmecophaga tridactyla has the most records (n = 5,941), and Cyclopes sp. have the fewest (n = 240). The armadillo species with the most data is Dasypus novemcinctus (n = 11,588), and the fewest data are recorded for Calyptophractus retusus (n = 33). With regard to sloth species, Bradypus variegatus has the most records (n = 962), and Bradypus pygmaeus has the fewest (n = 12). Our main objective with Neotropical Xenarthrans is to make occurrence and quantitative data available to facilitate more ecological research, particularly if we integrate the xenarthran data with other data sets of Neotropical Series that will become available very soon (i.e., Neotropical Carnivores, Neotropical Invasive Mammals, and Neotropical Hunters and Dogs). Therefore, studies on trophic cascades, hunting pressure, habitat loss, fragmentation effects, species invasion, and climate change effects will be possible with the Neotropical Xenarthrans data set. Please cite this data paper when using its data in publications. We also request that researchers and teachers inform us of how they are using these data