Development and characterization of soluplus® nanomicelles associated to specific igg as an innovative strategy for the detection and neutralization of shiga toxin type 2

Shiga toxin type 2 (Stx2) is the main virulence factor of Shiga toxinproducing Escherichia coli and is responsible for triggering HemolyticUremic Syndrome (HUS). We aimed to develop and characterizepolymeric nanomicelles (PN) with the amphiphilic polymerSoluplus® coupled to anti-Stx2 IgG in order to introduce innovativeproposals for the detection of Stx2 and treatment of HUS. PN ofSoluplus® were formulated in PBS and coupled with IgG anti Stx2from hyperimmune (PN-IgG-Stx2) or control bovine colostrum (PNIgG-Ctrl). The hydrodynamic size of PN, PN-IgG-Stx2 and PN-IgGCtrlwas evaluated by Dynamic Light Scattering. Morphology of PNor PN-IgG-Stx2 was analyzed by Transmission Electron Microscopy(TEM). The PN toxicity was evaluated on both Vero and Human GlomerularEndothelial cells (HGEC) and cell viability was determinedby neutral red uptake. After coupling PN with IgG, Stx2 neutralizationcapacity of PN-IgG-Stx2 or PN-IgG-Ctrl was evaluated on Vero andHGEC cells and the percentage of cell viability was analyzed. Thehydrodynamic size of the PN of Soluplus® and IgG-Stx2 showed anaverage diameter of 70.2 ± 1.5 nm and 40.9 ± 2 nm, respectively.When both components were coupled, a single peak with a similarhydrodynamic size of the PN was observed (70.4 ± 0.2 nm). TEManalysis revealed circular particles with a diameter corresponding to100 nm either in PN and PN-IgG-Stx2 particles. PN-IgG-Stx2 wereable to neutralize Stx2 on Vero and HGEC cells in a dose dependentmanner. When comparing the neutralization capacity of Stx2 by IgGStx2vs PN-IgG-Stx2 a significant improvement in the cell viabilityof Vero and HGEC was observed with the PN-IgG-Stx2 (p<0.001).The association between anti-Stx2 IgG from bovine colostrum andSoluplus® PN was optimized and characterized. Encouraging resultsof antibody functionality coupled with PN were registered.These results may open the perspective of the design of new nanoplatformsfor neutralization and/or detection of Stx2.Fil: Girón Reyes, Claudio Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay; ArgentinaFil: Gomez, Fernando Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay; ArgentinaFil: Amaral, María Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay; ArgentinaFil: Chiappetta, Diego Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Tecnología Farmacéutica; ArgentinaFil: Moretton, Marcela Analía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Tecnología Farmacéutica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Ibarra, Cristina Adriana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay; ArgentinaFil: Sacerdoti, Flavia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay; ArgentinaLXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; LXIX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología; LIII Reunión Anual de la Asociación Argentina de Farmacología Experimental y XI Reunión Anual de la Asociación Argentina de NanomedicinasArgentinaSociedad Argentina de Investigación ClínicaSociedad Argentina de InmunologíaAsociación Argentina de Farmacología ExperimentalAsociación Argentina de Nanomedicina

Efecto del acetato y formato sobre la capacidad de E. coli productora de toxina Shiga y E. coli enteroagregativa de aumentar la expresión de genes asociados a la virulencia e inducir la secreción de IL-8 en células epiteliales intestinales

Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica ClínicaLas cepas de Escherichia coli (E. coli) diarreogénicas (ECD) son bacilos Gram negativo que se caracterizan por su plasticidad génica y capacidad de generar diarrea. Estas cepas se han agrupado en distintos patotipos, distinguiéndose cada uno por sus factores de virulencia y mecanismos de patogenicidad para colonizar el intestino. El microambiente intestinal cumple un papel importante en la regulación de la virulencia en los patógenos entéricos, pudiendo ser la microbiota intestinal uno de los factores involucrados en modular la interacción entre ECD y el hospedero. En nuestro laboratorio se realizó un estudio que encontró la existencia de una microbiota distintiva en pacientes que presentaban diarrea asociada a la presencia de ECD, distinguiéndose significativamente en este grupo la presencia de la bacteria Escherichia albertii (E. albertii). En ensayos de infección sobre células intestinales T84, utilizando las cepas de ECD productora de toxina Shiga (STEC) y enteroagregativa (EAEC) co-incubadas con el sobrenadante de un cultivo de E. albertii, se observó un aumento significativo en la secreción de la citoquina proinflamatoria IL-8 en comparación a la condición control. Un análisis de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas del sobrenadante de E. albertii reveló la presencia de los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) acetato y formato. Los SCFA son producidos principalmente a partir de la fermentación de carbohidratos no digeribles en el intestino y se han sido descrito como moléculas reguladoras de la virulencia de enteropatógenos. Con estos antecedentes, en este trabajo se propuso estudiar el rol del acetato y el formato en la expresión de factores de virulencia en STEC y EAEC, junto con evaluar el efecto en la inducción de la respuesta inflamatoria inducida por estos patógenos en células epiteliales intestinales. Nuestra hipótesis es que el acetato, formato y los SCFA a concentraciones fisiológicas humanas inducen un aumento de la expresión de genes involucrados en la virulencia de cepas de STEC y de EAEC, correlacionado con un aumento en la secreción de IL-8 en células epiteliales intestinales in vitro infectadas con estos patógenos. El objetivo general de la tesis es determinar el efecto del acetato, formato y los SCFA en concentraciones fisiológicas humanas en la expresión de genes involucrados en la virulencia en STEC y EAEC, y en la secreción de IL-8 en células epiteliales intestinales mediada por estos patotipos. En primer lugar, se determinó que concentraciones de acetato mayores a 100 mM retrasan el crecimiento bacteriano de STEC y EAEC en comparación a su control de osmolaridad (NaCl). Posteriormente se encontró que el formato y el acetato aumentan la expresión de los genes que codifican para la toxina Shiga (stx2) e intimina (eae) en STEC y la proteína autotransportadora Pet (pet) en EAEC. No se encontraron diferencias significativas en el efecto del acetato y el formato sobre STEC y EAEC en la capacidad de inducir secreción de IL-8 sobre células T84 en comparación a su respectivo control. Además, se evaluó el efecto de los SCFA en un contexto fisiológico humano, y se observó que al incubar STEC o EAEC en presencia de la condición de SCFA presentes en colon, aumentó la expresión de los genes stx2 y eae en STEC, en EAEC aumentó la expresión de los genes; regulador maestro de virulencia (aggR), fimbria de adherencia agregativa (aafA) y autotransportador Pet. No se observó un efecto significativo en la inducción de la secreción de IL-8 en las células T84, cuando las cepas de STEC y de EAEC se incuba en presencia de un exceso de formato y acetato sobre la condición fisiológica de SCFA en colon. Como conclusión, en este trabajo se observó que el formato, y los SCFA presentes en el colon, modulan positivamente la expresión de factores de virulencia en STEC y EAEC. También se observó que un aumento en la expresión de los genes evaluado en las cepas de ECD, no se traduce en un aumento en la secreción de IL-8 en el modelo celular utilizado. Estos resultados sugieren que los SCFA podrían participar en la regulación de virulencia de las cepas de ECDDiarrheagenic E. coli (DEC) are Gram negative bacilli that have been characterized by their gene plasticity and ability to generate diarrhea. These strains have been grouped into different pathotypes, each being distinguished by their virulence factors and pathogenic mechanisms to colonize the human gut. Human gut microenvironment has an important role in the regulation of virulence of enteric pathogens, being the intestinal microbiota one of the factors that could be involved in modulating the interaction between DEC and the host. A study carried out in our laboratory determined the existence of a distinctive microbiota in patients presenting diarrhea associated with the presence of DEC, significantly distinguishing in this group the presence of Escherichia albertii (E. albertii). Infection assays were performed on T84 intestinal cells using shiga Toxin-producing E. coli (STEC) and enteroaggregative E. coli (EAEC), which were co-cultured with the supernatant of E. albertii, producing an increase in the secretion of the IL-8 proinflammatory cytokine compared to the control condition. A gas chromatography analysis coupled to spectrometry would reveal the presence of short chain fatty acids (SCFA), acetate and formate in the supernatant of E. albertii. SCFA are produced through the fermentation of none digestible carbohydrates (NDC) in the human gut and have been described as molecules involved in the modulation of virulence factors in enteropathogenic bacteria. In this study we proposed that the acetate, formate and SCFA in a human physiological context induce an upregulation in the expression of virulence factors in STEC and EAEC, increasing the secretion of IL-8 on epithelial cells in vitro infected with these pathogens. The main objective in this study was to determine the effect that the formate, acetate and SCFA in the human gut could have in the expression of virulence factors in STEC and EAEC, and to evaluate the secretion on IL-8 on epithelial cells infected with these pathogens. It was first determined that acetate concentrations greater than 100 mM have a significant effect on the bacterial growth of STEC and EAEC compared to their osmolarity control, sodium chloride (NaCl). Subsequently, it was determined that acetate and formate increased gene expression of Shiga toxin (stx2) and intimin (eae) in STEC and the autotransporter protein (pet) in EAEC. There is no significant difference in the effect of acetate and formate on STEC and EAEC to induce secretion of IL-8 on T84 cells compared to their respective control. In addition, the effect of SCFA in a human physiological context was evaluated, and it was observed that when incubating STEC or EAEC in the presence of concentrations of SCFA present in the colon, the expression of the genes stx2, and eae increased in STEC, as well as the genes that encode the master regulator (aggR), fimbria of aggregative adhesion (aafA) and pet in EAEC. It was observed that there is no significant effect on the induction of IL-8 secretion in T84 cells, when STEC and EAEC are incubated in the presence of an excess formate and acetate on the physiological condition of SCFA in the colon. In this work we concluded that formate, acetate and the SCFA present in the colon, positively modulate the expression of certain virulence factors in STEC and EAEC. It was also observed that an increase in the expression of the evaluated genes in DEC strains does not translate into an increase in the secretion of IL-8 in the cellular model used. These results suggest that the SCFA could participate in the virulence regulation of DEC strainFONDECYT 116042

Compilación de Proyectos de Investigacion de 1984-2002

Instituto Politecnico Nacional. UPIICS