A modeling approach to study the effect of cell polarization on keratinocyte migration

The skin forms an efficient barrier against the environment, and rapid cutaneous wound healing after injury is therefore essential. Healing of the uppermost layer of the skin, the epidermis, involves collective migration of keratinocytes, which requires coordinated polarization of the cells. To study this process, we developed a model that allows analysis of live-cell images of migrating keratinocytes in culture based on a small number of parameters, including the radius of the cells, their mass and their polarization. This computational approach allowed the analysis of cell migration at the front of the wound and a reliable identification and quantification of the impaired polarization and migration of keratinocytes from mice lacking fibroblast growth factors 1 and 2 an established model of impaired healing. Therefore, our modeling approach is suitable for large-scale analysis of migration phenotypes of cells with specific genetic defects or upon treatment with different pharmacological agents.Comment: 27 pages, 3 figure

Hypoxia-inducible factor 1α is a new target of microphthalmia-associated transcription factor (MITF) in melanoma cells

In melanocytes and melanoma cells α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH), via the cAMP pathway, elicits a large array of biological responses that control melanocyte differentiation and influence melanoma development or susceptibility. In this work, we show that cAMP transcriptionally activates Hif1a gene in a melanocyte cell–specific manner and increases the expression of a functional hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) protein resulting in a stimulation of Vegf expression. Interestingly, we report that the melanocyte-specific transcription factor, microphthalmia-associated transcription factor (MITF), binds to the Hif1a promoter and strongly stimulates its transcriptional activity. Further, MITF “silencing” abrogates the cAMP effect on Hif1a expression, and overexpression of MITF in human melanoma cells is sufficient to stimulate HIF1A mRNA. Our data demonstrate that Hif1a is a new MITF target gene and that MITF mediates the cAMP stimulation of Hif1a in melanocytes and melanoma cells. Importantly, we provide results demonstrating that HIF1 plays a pro-survival role in this cell system. We therefore conclude that the α-MSH/cAMP pathway, using MITF as a signal transducer and HIF1α as a target, might contribute to melanoma progression

Mise au point et validation d'un modèle d'étude in vivo et ex vivo des aspects moléculaires de la cicatrisation cutanée

NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Signature transcriptomale des kératinocytes humains dans un modèle de réépithélisation (validation fonctionnelle des molécules impliquées)

Le travail qui fait l objet de cette thèse contribue à une meilleure compréhension des événements moléculaires qui régissent la cicatrisation cutanée. En étudiant la réponse biologique spécifique des kératinocytes, nous avons utilisé la technologie des puces à ADN et un système original de blessure développé dans notre laboratoire 1) pour identifier les gènes qui sont induits ou réprimés dans les kératinocytes humains en culture en réponse à une blessure mécanique 2) pour caractériser les voies de signalisation qui contrôlent l expression de ces gènes. Nous avons montré que la blessure d un tapis de kératinocytes provoque la stimulation et l inhibition de l expression de 161 nouveaux marqueurs de la réparation épidermique. Une analyse pharmacologique réalisée en présence des inhibiteurs spécifiques de voies de signalisation ERK1/2,p38[MAPK] et PI3K, montre que ces voies exercent une contrôle sélectif sur le processus de réparation en contrôlant l expression des gènes spécifiques. Une étude fonctionnelle réalisée à la suite de notre analyse transcriptomale nous a permis de montrer que la stimulation d HB-EGF, d ETS1 et de NDRG1 est une condition sine qua non pour la migration et la prolifération des kératinocytes en réponse à une blessure, la surexpression ou l inhibition de l expression de chacun d eux entraînant des altérations cinétiques du processus de fermeture de blessure. Par ailleurs, nous démontrons pour la première fois que HIF1a joue un rôle fondamental dans la migration cellulaire en contrôlant le niveau d expression de la sous-unité ax3 de la laminine 5, une protéine qui joue un rôle essentiel dans la migration, la prolifération, et l adhésion des kératinocytes.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Régulation de la prolifération cellulaire au cours de la cicatrisation cutanée (rôle de p27KIP1, un inhibiteur des Kinases Dépendantes des Cyclines)

La cicatrisation cutanée consiste en un programme dynamique et coordonné d'événements, dont les signaux initiateurs conduisent des cellules quiescentes, situées aux berges de la blessure, à migrer, proliférer et déposer une nouvelle matrice dans le lit de la blessure, de manière à restaurer à la peau son intégrité physique et fonctionnelle. La prolifération, en particulier celle des fibroblastes dermiques, est une étape essentielle de ce processus. Des pathologies cicatricielles comme les chéloïdes, les cicatrices hypertrophiques et les ulcères sont des exemples de désordres fibroprolifératifs et il est actuellement admis que la chronicité du processus de cicatrisation contribue à l'apparition de certains carcinomes spinocellulaires. Si la cicatrisation est bien étudiée d'un point de vue descriptif, il n'existe en revanche aucun système biologique performant permettant une étude moléculaire. Pour contourner cette difficulté, nous avons développé un système original et reproductible qui mime in vitro les différentes étapes du processus et permet la détection et la quantification des événements moléculaires associés. Mon travail de thèse a eu pour but de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine 1) de l'entrée des fibroblastes dermiques dans le cycle cellulaire en réponse à une blessure, et 2) de leur arrêt de prolifération une fois la blessure refermée. Nous décrivons pour la première fois que la blessure mécanique d'un tapis confluent de fibroblastes provoque une entrée synchrone des cellules dans le cycle cellulaire. Cette entrée en cycle s'accompagne d'une diminution de l'ARN messager de p27, un inhibiteur de l'activité des cyclines-dépendantes kinases qui joue un rôle clef dans le contrôle de la prolifération cellulaire, et de la stimulation de l'expression d'Id3, un gène de réponse précoce codant un inhibiteur de l'activité transcriptionnelle des facteurs de type bHLH. Grâce à une approche siRNA, nous démontrons qu'Id3 contrôle la diminution de p27, permettant l'entrée en cycle et la division cellulaire. Lorsque la lésion est comblée, la prolifération cellulaire s'arrête et les cellules entrent dans une nouvelle phase de quiescence. Nous avons démontré que cette sortie de cycle est précédée i) d'une stabilisation pré-mitotique de l'inhibiteur p27, ii) de son association avec les complexes cycline A-Cdk1/2 et cycline D1-Cdk4/6, iii) d'une diminution de la phosphorylation des " pocket " protéines pRb et p130. En revanche, p27 ne s'associe pas avec les complexes cycline B1-Cdk1 et n'inhibe pas leur activité enzymatique. Les fibroblastes dermiques entrent donc en mitose puis sortent du cycle de manière réversible dans la phase G1 suivante. La réduction du niveau d'expression de p27 par une approche siRNA réverse partiellement ce phénotype. En conclusion, notre travail démontre pour la première fois dans le contexte physiologique de la cicatrisation cutanée, que p27 est l'élément clef qui contrôle à la fois l'entrée des cellules en cycle et leur sortie en fin de cicatrisation, et qu'il est un médiateur de signaux antiprolifératifs agissant après le point de restriction et avant la mitose.Skin wound healing is a complex phenomenon that involves multiple cellular processes (migration, proliferation, differenciation...) and cell types allowing the reconstruction of skin lesions. Many genetic or acquired defects can perturb the normal wound healing process, leading to skin pathologies like hypertrophic scars, keloïds or ulcers, in which fibroblasts are characterised by an abnormal proliferation. However, the molecular abnormalities at the origin of these pathologies are still unknown notably because the classical experimental systems do not allow a molecular approach of the process. To circumvent this hurdle, we have developed an original device that performs calibrated injuries and enables the detection of a wide range of molecular events activated during wound healing. Using this experimental system, we show that mechanical lesions performed within confluent human dermal fibroblasts provoke a synchronous cell cycle entry followed by a cell cycle exit after mitosis. We demonstrate that the mRNA of p27Kip1, a cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor which plays a key role in negative control of cell proliferation, is transiently downregulated after injury. We identify Id3, a bHLH transcriptional repressor, as a candidate for p27 down regulation. Id3-siRNA reversed the injury mediated p27 down-regulation and blocks the cell cycle progression, demonstrating that Id3 is involved in the transcriptional repression of p27 and that this early regulation is required for cell proliferation. When cells reach confluence, the cell cycle exit is preceded by pre-mitotic stabilization of p27 and association with cyclin A-Cdk1/2 and cyclin D1-Cdk4/6 (but not cyclin B1-Cdk1) complexes, and decreased pocket protein phosphorylation. Reduction of p27 by siRNA partially reverses this phenotype, supporting a role for p27 as a mediator of anti-proliferative cues occurring after the restriction point.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocPARIS-Académie Médecine (751065201) / SudocSudocFranceF

Confluence-induced cell cycle exit involves pre-mitotic CDK inhibition by p27Kip1 and cyclin D1 downregulation

International audienceTissue homeostasis requires precise control of cell proliferation and arrest in response to environmental cues. In situation such as wound healing, injured cells are stimulated to divide, but as soon as confluence is reached proliferation must be blocked. Such reversible cell cycle exit occurs in G(1), requires pRb family members, and is driven by p27(Kip1)-dependent Cdk inactivation. This implies that, while dividing, cells should simultaneously prepare the exit once mitosis is accomplished. For a long time, the decision to cycle or not was presumed to occur in G(1), prior to the restriction point, beyond which the cells were bound to divide even in the absence of mitogens, before finally arresting after mitosis. However, more recent reports suggested that the commitment to cycle in response to serum occurs already in G(2) phase and requires the Ras-dependent induction of cyclin D1, which promotes following G(1)/S transition. To test whether this hypothesis applies to arrest induced by contact inhibition, we used an in vitro wounding model where quiescent human dermal fibroblasts, stimulated to proliferate by mechanical injury, synchronously exit cell cycle after mitosis due to renewed confluence. We show that this exit is preceded by p27-dependent inhibition of cyclin A-Cdk1/2, cyclin D1 downregulation and reduced pre-mitotic pRb pocket protein phosphorylation. Overexpression of cyclin D1 but not p27 depletion reversed this phenotype and compromised confluence-driven cell cycle exit. Thus, a balance between cyclin D1 and p27 may provide sensitive responses to variations in proliferative cues operating throughout the cell cycle