A simple protocol to characterize bacterial cell-envelope lipoproteins in a native-like environment

Physiological conditions in living cells are strictly regulated to allow, optimize, and coordinate biological processes. The bacterial cell envelope is the compartment where the communication with the external environment takes place. This involves membrane proteins, key players in many biological processes that ensure bacterial survival. The biochemical characterization of membrane proteins, either integral, lipidated or peripheral is challenging due to their mixed protein-lipid nature, making it difficult to purify and obtain considerable amounts of samples. In contrast to integral membrane proteins, lipidated proteins are usually purified as truncated soluble versions, neglecting the impact of the membrane environment. Here we report a simple and robust protocol to characterize bacterial lipidated proteins in spheroplasts from Escherichia coli using a β-lactamase as a model. The Metallo-β-lactamase NDM-1 is an enzyme anchored to the inner leaflet of the outer membrane of Gram-negative bacteria. Kinetic parameters and stability of the lipidated NDM-1 and the soluble unbound version (NDM-1 C26A) were measured in spheroplasts and periplasm, respectively. These studies revealed that membrane anchoring increases the KM of the enzyme, consequently decreasing the catalytic efficiency, while not affecting its kinetic stability. This approach can be used to characterize lipidated proteins avoiding the purification step while mimicking its native environment. This approach also helps in filling the gap between in vitro and in vivo studies.Fil: Giannini, Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Vila, Alejandro Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Gonzalez, Lisandro Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentin

An experiment-informed signal transduction model for the role of the Staphylococcus aureus MecR1 protein in β-lactam resistance

The treatment of hospital- and community-associated infections by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a perpetual challenge. This Gram-positive bacterium is resistant specifically to β-lactam antibiotics, and generally to many other antibacterial agents. Its resistance mechanisms to β-lactam antibiotics are activated only when the bacterium encounters a β-lactam. This activation is regulated by the transmembrane sensor/signal transducer proteins BlaR1 and MecR1. Neither the transmembrane/metalloprotease domain, nor the complete MecR1 and BlaR1 proteins, are isolatable for mechanistic study. Here we propose a model for full-length MecR1 based on homology modeling, residue coevolution data, a new extensive experimental mapping of transmembrane topology, partial structures, molecular simulations, and available NMR data. Our model defines the metalloprotease domain as a hydrophilic transmembrane chamber effectively sealed by the apo-sensor domain. It proposes that the amphipathic helices inserted into the gluzincin domain constitute the route for transmission of the β-lactam-binding event in the extracellular sensor domain, to the intracellular and membrane-embedded zinc-containing active site. From here, we discuss possible routes for subsequent activation of proteolytic action. This study provides the first coherent model of the structure of MecR1, opening routes for future functional investigations on how β-lactam binding culminates in the proteolytic degradation of MecI.Fil: Belluzo, Bruno Salvador. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Abriata, Luciano Andres. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. École Polytechnique Fédérale de Lausanne; SuizaFil: Giannini, Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Mihovilcevic, Damila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Dal Peraro, Matteo. École Polytechnique Fédérale de Lausanne; SuizaFil: Llarrull, Leticia Irene. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

The reaction mechanism of metallo-beta-lactamases is tuned by the conformation of an active site mobile loop

Carbapenems are "last resort" β-lactam antibiotics used to treat serious and life-threatening health care-associated infections caused by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Unfortunately, the worldwide spread of genes coding for carbapenemases among these bacteria is threatening these life-saving drugs. Metallo-β-lactamases (MβLs) are the largest family of carbapenemases. These are Zn(II)-dependent hydrolases that are active against almost all β-lactam antibiotics. Their catalytic mechanism and the features driving substrate specificity have been matter of intense debate. The active sites of MβLs are flanked by two loops, one of which, loop L3, was shown to adopt different conformations upon substrate or inhibitor binding, and thus are expected to play a role in substrate recognition. However, the sequence heterogeneity observed in this loop in different MβLs has limited the generalizations about its role. Here, we report the engineering of different loops within the scaffold of the clinically relevant carbapenemase NDM-1. We found that the loop sequence dictates its conformation in the unbound form of the enzyme, eliciting different degrees of active-site exposure. However, these structural changes have a minor impact on the substrate profile. Instead, we report that the loop conformation determines the protonation rate of key reaction intermediates accumulated during the hydrolysis of different β-lactams in all MβLs. This study demonstrates the existence of a direct link between the conformation of this loop and the mechanistic features of the enzyme, bringing to light an unexplored function of active-site loops on MβLs.Fil: Palacios, Antonela Rocio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Mojica, María F.. Case Western Reserve University; Estados UnidosFil: Giannini, Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Taracila, Magdalena A.. Case Western Reserve University; Estados Unidos. Louis Stokes Veterans Affairs Medical Center; Estados UnidosFil: Bethel, Christopher R.. Louis Stokes Veterans Affairs Medical Center; Estados UnidosFil: Alzari, Pedro M.. Institut Pasteur de Paris; FranciaFil: Otero, Lisandro Horacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Klinke, Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Llarrull, Leticia Irene. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Bonomo, Robert A.. Case Western Reserve University; Estados UnidosFil: Vila, Alejandro Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Estudio bioquímico y estructural de la metalo-beta-lactamasa NDM-1: residuos de segunda esfera e implicancias de su anclaje a membrana

La resistencia bacteriana a antibióticos representa hoy una de las amenazas más serias a la salud. Las infecciones causadas por bacterias resistentes son cada vez más comunes en los ambientes clínicos, y algunos patógenos se han vuelto resistentes a varias clases de antibióticos, limitando las posibilidades de tratamiento. En particular, la diseminación mundial de bacterias Gram-negativas resistentes a carbapenemes se ha vuelto una causa importante de morbilidad y mortalidad. Las carbapenemasas son β-lactamasas capaces de hidrolizar los carbapenemes (antibióticos β-lactámicos utilizados como último recurso terapéutico para el tratamiento de infecciones resistentes a la mayoría de los fármacos). Las carbapenemasas de mayor diseminación clínica son las metalo-β-lactamasas (MBLs), enzimas con una gran versatilidad, ya que son capaces de inactivar igualmente bien las penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes. En la actualidad, no existen inhibidores de MBLs de uso clínico. La carbapenemasa NDM-1, se ha expandido a más de 80 países en solamente 12 años y su gen se encuentra acoplado a un cassette de multi-resistencia. Más aún, el gen de NDM-1 ha sido encontrado en gran cantidad de bacterias ambientales en la comunidad, por lo cual su riesgo de diseminación es aún mayor. La enzima NDM-1 posee un sitio activo conservado en todas las MBLs de impacto clínico (como las enzimas del tipo VIM, IMP y SPM). Estas poseen dos sitios de unión a metal, el llamado sitio Zn1, compuesto por los residuos His116, His118 e His196, y el sitio Zn2, formado por los residuos Asp120, Cys221 e His263. Ambos iones Zn(II) son esenciales y están implicados en el mecanismo de hidrólisis de los antibióticos β-lactámicos. Asimismo, las MBLs poseen un conjunto de residuos de segunda esfera de coordinación (RSCs) que forman una red de enlaces de hidrógeno conservada por debajo de la base del sitio activo. Esta red involucra residuos de distintas regiones de la cadena polipeptídica y uno o más de los ligandos metálicos. NDM-1 difiere de las demás enzimas de su clase debido a su localización celular: es una lipoproteína anclada a la cara interna de la membrana externa de organismos Gram-negativos, mientras que las demás MBLs caracterizadas son enzimas periplasmáticas solubles. Esta localización celular se debe a la presencia de una señal de lipidación denominada lipobox dentro del péptido líder de NDM-1, la cual es reconocida por un sistema biosíntesis de lipoproteínas altamente conservado en bacterias. Se encuentra ampliamente reportado que el ambiente biológico influye en el plegamiento, la estabilidad y la función proteica. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, revelaron que las determinaciones de actividad de MBLs solubles en extractos periplasmáticos reflejan mucho mejor las influencias del entorno nativo de estas enzimas respecto a las determinaciones in vitro con proteínas recombinantes. En el caso particular de las proteínas que se encuentran en el entorno de las membranas biológicas, hay cada vez más evidencia del rol activo de los lípidos en la modulación de su actividad. Por este motivo, en este trabajo de Tesis, nos propusimos desarrollar un sistema modelo para caracterizar NDM-1 simulando su entorno nativo de membrana. La evaluación de actividad β-lactamasa de NDM-1 en preparaciones de membranas totales, micelas de Tritón X-100 y esferoplastos de E. coli, reveló que la enzima se encontraba activa en los tres sistemas. La comparación de NDM-1 en su forma lipidada en esferoplastos y soluble en periplasma, mostró un incremento de eficiencia catalítica para la variante soluble NDM-1-C26A, principalmente influenciado por el valor de KM. Esta diferencia nos permitió hipotetizar que el sitio activo de la variante soluble podría estar más accesible al medio, mientras que en el caso de NDM-1 lipidada su cercanía a la membrana podría estar afectando la unión del sustrato. Por otro lado, ensayos de estabilidad cinética de NDM-1 luego del agregado de Proteinasa K, revelaron que el anclaje no altera la estabilidad de NDM-1 respecto a la de su variante soluble. Continuando con la caracterización de NDM-1 en su forma lipidada, se logró sobreexpresar y purificar la enzima en complejo con detergentes. Se realizaron pruebas de cristalogénesis y fue posible obtener cristales del complejo NDM-1-DDM. Si bien la resolución no fue suficientemente para resolver la estructura e inferir sobre la posible orientación de NDM-1 respecto a la membrana, resulta interesante continuar trabajando en la optimización de los mismos. Por último, se estudió el impacto de mutaciones en RSCs en NDM-1. Estos RSCs modulan fuertemente la estructura y función de las enzimas, siendo capaces de modular tanto la afinidad por Zn(II) como la especificidad de sustrato de las MBLs de impacto clínico. Resulta interesante comprender estos fenómenos y el impacto de mutaciones en RSCs en la evolución de MBLs hacia enzimas optimizadas. Hasta el momento se han reportado 27 variantes alélicas de NDM-1, las cuales son poco divergentes y ninguna posee mutaciones en RSCs. Se aleatorizaron los codones en tres posiciones correspondientes a RSCs (D84, K121 y S262) y se seleccionaron mutantes funcionales. En general la capacidad de las mutantes de conferir resistencia frente a los antibióticos β-lactámicos ensayados fue menor que la de NDM-1, sin embargo, mostraron eficiencias catalíticas dentro del mismo orden. Por otro lado, se evaluó la estabilidad de estas mutantes en condiciones de limitación de metal. Resultó interesante el incremento de estabilidad observado para el apo-derivado (enzima inactiva sin metal) de la mutante K121S. Este incremento resulta relevante en los sitios de infección, donde el hospedador libera al medio grandes cantidades de proteínas quelantes de metal que reducen la disponibilidad del cofactor Zn(II), esencial para la actividad de las MBL. Esta mutación podría resultar, en combinación con otras, relevante en la evolución de NDM-1, fijando nuevos caminos evolutivos de esta enzima de reciente aparición.Fil: Giannini, Estefanía. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina

Arabidopsis thaliana Hcc1 is a Sco‐like metallochaperone for Cu A assembly in Cytochrome c Oxidase

International audienceThe assembly of the CuA site in Cytochrome c Oxidase (COX) is a critical step for aerobic respiration in COX-dependent organisms. Several gene products have been associated with the assembly of this copper site, the most conserved of them belonging to the Sco family of proteins, which have been shown to perform different roles in different organisms. Plants express two orthologs of Sco proteins: Hcc1 and Hcc2. Hcc1 is known to be essential for plant development and for COX maturation, but its precise function has not been addressed until now. Here, we report the biochemical, structural and functional characterization of Arabidopsis thaliana Hcc1 protein (here renamed Sco1). We solved the crystal structure of the Cu+1 -bound soluble domain of this protein, revealing a tri coordinated environment involving a CxxxCxn H motif. We show that AtSco1 is able to work as a copper metallochaperone, inserting two Cu+1 ions into the CuA site in a model of CoxII. We also show that AtSco1 does not act as a thiol-disulfide oxido-reductase. Overall, this information sheds new light on the biochemistry of Sco proteins, highlighting the diversity of functions among them despite their high structural similarities. DATABASE: PDB entry 6N5U (Crystal structure of Arabidopsis thaliana ScoI with copper bound)

Arabidopsis thaliana Hcc1 is a Sco-like metallochaperone for Cu A assembly in Cytochrome c Oxidase

The assembly of the CuA site in Cytochrome c Oxidase (COX) is a critical step for aerobic respiration in COX-dependent organisms. Several gene products have been associated with the assembly of this copper site, the most conserved of them belonging to the Sco family of proteins, which have been shown to perform different roles in different organisms. Plants express two orthologs of Sco proteins: Hcc1 and Hcc2. Hcc1 is known to be essential for plant development and for COX maturation, but its precise function has not been addressed until now. Here, we report the biochemical, structural and functional characterization of Arabidopsis thaliana Hcc1 protein (here renamed Sco1). We solved the crystal structure of the Cu+1-bound soluble domain of this protein, revealing a tri coordinated environment involving a CxxxCxnH motif. We show that AtSco1 is able to work as a copper metallochaperone, inserting two Cu+1 ions into the CuA site in a model of CoxII. We also show that AtSco1 does not act as a thiol-disulfide oxido-reductase. Overall, this information sheds new light on the biochemistry of Sco proteins, highlighting the diversity of functions among them despite their high structural similarities.Fil: Llases, María Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Lisa, María Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Plataforma de Biología Estructural y Metabolómica; ArgentinaFil: Morgada, Marcos Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Giannini, Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Alzari, Pedro M. Université Paris Diderot - Paris 7; FranciaFil: Vila, Alejandro Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Unexpected electron spin density on the axial methionine ligand in Cu A suggests its involvement in electron pathways

International audienceThe CuA center is a paradigm for the study of long-range biological electron transfer. This metal center is an essential cofactor for terminal oxidases like cytochrome c oxidase, the enzymatic complex responsible for cellular respiration in eukaryotes and in most bacteria. CuA acts as an electron hub by transferring electrons from reduced cytochrome c to the catalytic site of the enzyme where dioxygen reduction takes place. Different electron transfer pathways have been proposed involving a weak axial methionine ligand residue, conserved in all CuA sites. This hypothesis has been challenged by theoretical calculations indicating the lack of electron spin density in this ligand. Here we report an NMR study with selectively labeled methionine in a native CuA. NMR spectroscopy discloses the presence of net electron spin density in the methionine axial ligand in the two alternative ground states of this metal center. Similar spin delocalization observed on two second sphere mutants further supports this evidence. These data provide a novel view of the electronic structure of CuA centers and support previously neglected electron transfer pathways

The Reaction Mechanism of Metallo-β-Lactamases Is Tuned by the Conformation of an Active-Site Mobile Loop

International audienceCarbapenems are "last resort" β-lactam antibiotics used to treat serious and life-threatening health care-associated infections caused by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Unfortunately, the worldwide spread of genes coding for carbapenemases among these bacteria is threatening these life-saving drugs. Metallo-β-lactamases (MβLs) are the largest family of carbapenemases. These are Zn(II)-dependent hydrolases that are active against almost all β-lactam antibiotics. Their catalytic mechanism and the features driving substrate specificity have been matter of intense debate. The active sites of MβLs are flanked by two loops, one of which, loop L3, was shown to adopt different conformations upon substrate or inhibitor binding, and thus are expected to play a role in substrate recognition. However, the sequence heterogeneity observed in this loop in different MβLs has limited the generalizations about its role. Here, we report the engineering of different loops within the scaffold of the clinically relevant carbapenemase NDM-1. We found that the loop sequence dictates its conformation in the unbound form of the enzyme, eliciting different degrees of active-site exposure. However, these structural changes have a minor impact on the substrate profile. Instead, we report that the loop conformation determines the protonation rate of key reaction intermediates accumulated during the hydrolysis of different β-lactams in all MβLs. This study demonstrates the existence of a direct link between the conformation of this loop and the mechanistic features of the enzyme, bringing to light an unexplored function of active-site loops on MβLs

MitraClip in secondary mitral regurgitation as a bridge to heart transplantation: 1-year outcomes from the International MitraBridge Registry.

BACKGROUND Patients awaiting heart transplantation (HTx) often need bridging therapies to reduce worsening and progression of underlying disease. Limited data are available regarding the use of the MitraClip procedure in secondary mitral regurgitation for this clinical condition. METHODS We evaluated an international, multicenter (17 centers) registry including 119 patients (median age: 58 years) with moderate-to-severe or severe secondary mitral regurgitation and advanced heart failure (HF) (median left ventricular ejection fraction: 26%) treated with MitraClip as a bridge strategy according to 1 of the following criteria: (1) patients active on HTx list (in list group) (n = 31); (2) patients suitable for HTx but awaiting clinical decision (bridge to decision group) (n = 54); or (3) patients not yet suitable for HTx because of potentially reversible relative contraindications (bridge to candidacy group) (n = 34). RESULTS Procedural success was achieved in 87.5% of cases, and 30-day survival was 100%. At 1 year, Kaplan-Meier estimates of freedom from the composite primary end-point (death, urgent HTx or left ventricular assist device implantation, first rehospitalization for HF) was 64%. At the time of last available follow-up (median: 532 days), 15% of patients underwent elective transplant, 15.5% remained or could be included in the HTx waiting list, and 23.5% had no more indication to HTx because of clinical improvement. CONCLUSIONS MitraClip procedure as a bridge strategy to HTx in patients with advanced HF with significant mitral regurgitation was safe, and two thirds of patients remained free from adverse events at 1 year. These findings should be considered exploratory and hypothesis-generating to guide further study for percutaneous intervention in high-risk patients with advanced HF