Entwicklung eines hochauflösenden Ophthalmoskops mit strukturierter Beleuchtung und Beiträge zur Verbesserung der zugrundeliegenden Mikroskopiemethode

Die strukturierte Beleuchtung stellt eine die ganze Bildfläche simultan betrachtende Fluoreszenzmikroskopietechnik dar. Durch computergestützte Nachbearbeitung, die sogenannte Rekonstruktion, der mit einem periodischen Muster beleuchteten Aufnahmen lassen sich superauflösende Bilder erzeugen. Die konventionelle Rekonstruktion strukturiert beleuchteter Daten benötigt ein geringes relatives Rauschniveau, also ein starkes Signal, um gute Ergebnisse zu erreichen, was in der Praxis insbesondere bei lebenden Objekten oftmals nicht realisierbar ist. Daher wurde eine entfaltungsbasierte Methode, die auf einer Sortierung der Bildpunkte beruht, zur Rekonstruktion strukturiert beleuchteter Daten entwickelt, welche einen deutlich geringeren Einfluss des Rauschens auf das Ergebnis aufweist. Eine weitere bisherige Einschränkung der strukturierten Beleuchtung liegt in der geringen Größe des aufnehmbaren Bereichs. Um dennoch die superauflösende Untersuchung großer Volumina zu ermöglichen, wurde ein Verfahren zur Bildzusammenführung erarbeitet, das das Bleichen der Fluoreszenz berücksichtigt. Die altersbedingte Makuladegeneration ist die häufigste Erblindungsursache in der westlichen Welt. Zur Aufzeichnung mit dieser Erkrankung einhergehender, autofluoreszenter Veränderungen im Augenhintergrund mit hoher Auflösung, wurde ein Ophthalmoskop mit strukturierter Beleuchtung entwickelt und seine Leistungsfähigkeit im Rahmen einer klinischen Studie überprüft. Die Gegenüberstellung mit einem leistungsfähigen konventionellen Vergleichsprodukt zeigt eine deutlich verbesserte Auflösung des erhaltenen Bildes. Dadurch kann die entwickelte Technik einen entscheidenden Beitrag zur besseren Untersuchung und Diagnose der Makuladegeneration liefern

Postwachstum von rechts

Einführung in den Schwerpunk

Single molecule localization microscopy of the distribution of chromatin using Hoechst and DAPI fluorescent probes

Several approaches have been described to fluorescently label and image DNA and chromatin in situ on the single-molecule level. These superresolution microscopy techniques are based on detecting optically isolated, fluorescently tagged anti-histone antibodies, fluorescently labeled DNA precursor analogs, or fluorescent dyes bound to DNA. Presently they suffer from various drawbacks such as low labeling efficiency or interference with DNA structure. In this report, we demonstrate that DNA minor groove binding dyes, such as Hoechst 33258, Hoechst 33342, and DAPI, can be effectively employed in single molecule localization microscopy (SMLM) with high optical and structural resolution. Upon illumination with low intensity 405 nm light, a small subpopulation of these molecules stochastically undergoes photoconversion from the original blue-emitting form to a green-emitting form. Using a 491 nm laser excitation, fluorescence of these green-emitting, optically isolated molecules was registered until “bleached”. This procedure facilitated substantially the optical isolation and localization of large numbers of individual dye molecules bound to DNA in situ, in nuclei of fixed mammalian cells, or in mitotic chromosomes, and enabled the reconstruction of high-quality DNA density maps. We anticipate that this approach will provide new insights into DNA replication, DNA repair, gene transcription, and other nuclear processes

Autofluorescence imaging of human RPE cell granules using structured illumination microscopy

ABSTRACT Background/aims To characterise single autofluorescent (AF) granules in human retinal pigment epithelium (RPE) cells using structured illumination microscopy (SIM). Methods Morphological characteristics and autofluorescence behaviour of lipofuscin (LF) and melanolipofuscin (MLF) granules of macular RPE cells (66-year-old donor) were examined with SIM using three different laser light excitation wavelengths (488, 568 and 647 nm). High-resolution images were reconstructed and exported to Matlab R2009a (The Mathworks Inc, Natick, MA, USA) to determine accurate size and emission intensities of LF and MLF granules. Results SIM doubles lateral resolution compared with conventionally used wide-field microscopy and allows visualisation of intracellular structures down to 110 nm lateral resolution. AF patterns were examined in 133 LF and 27 MLF granules. LF granules (9686220 nm) were significantly smaller in diameter than MLF granules (10976110 nm; p<0.001). LF granules showed an inhomogeneous intragranular pattern, and the average intensity negatively correlated with the size of these granules when excited at 647 nm. The autofluorescence of MLF granules was more homogeneous, but shifted towards higher excitation wavelengths in the centre of the granules. Conclusion SIM is a useful tool for examining AF signals within single LF and MLF granules in RPE cells. This allows new insights into RPE autofluorescence patterns

Nonresponse und Interviewer-Erfolg im Telefoninterview. Empirische Untersuchungen zum Einfluss stimmlicher Eigenschaften der Interviewer

"Basierend auf der Messung von objektiven Eigenschaften und subjektiven Bewertungen der Stimmen von 56 weiblichen Telefoninterviewern wird der Zusammenhang zwischen Stimmeigenschaften und dem Interviewerfolg empirisch untersucht. Theoretisch lässt sich argumentieren, dass die Interviewer-Stimmen einerseits Nutzenerwartungen der Respondenten beeinflussen können, indem sie z.B. belohnend wirken oder Seriosität vermitteln. Ausgehend von dual-process-Theorien ist außerdem zu erwarten, dass die Stimme einen situativen Hinweisreiz darstellt, der - ohne rationale Abwägung - Kooperationsnormen aktivieren kann und hierdurch die Wahrscheinlichkeit der Teilnahme am Interview erhöht. Empirisch zeigt sich, dass subjektiv eingeschätzte Stimmmerkmale in keinem Zusammenhang mit der Erfolgsquote der Interviewer stehen. Objektive Merkmale der Stimme hingegen, insbesondere die Stimmhöhe, haben substanziellen Einfluss auf die Erfolgsquote. Es ist jedoch wichtig zu bemerken, dass der Zusammenhang zwischen der Stimmhöhe oder der Sprechgeschwindigkeit und dem Interviewerfolg nicht linear ist, sondern einen umgekehrt U-förmigen Verlauf hat. Die Autoren finden empirisch, dass Interviewerinnen mit durchschnittlicher Stimmhöhe und durchschnittlicher Sprechgeschwindigkeit die höchsten Erfolgsquoten aufweisen." (Autorenreferat)"This study examines nonresponse in telephone surveys. The analysis relates response rates to interviewer voice characteristics. Drawing on theory we argue that interviewer voices can affect the respondents' utility expectations, e.g. by indicating integrity, or by providing an intrinsic reward. Based on dual-process theories, one can additionally expect the voice to be a situative cue. The authors use contact data generated in a CATI survey and supplement these data with information on interviewers' voices. The survey was conducted during 2007 and 2008 at the University of Mannheim, Germany. To obtain metadata, we recorded the interviewers' voices and generated phonetic measures of vocal characteristics. This enabled us to study the determinants of interviewer effectiveness and nonresponse with a special focus on objective voice characteristics (pitch, speech rate, etc.). Additionally, they accounted for a variety of subjective voice attributes (friendliness, trustworthiness, etc.). The results show that objective vocal characteristics have greater explanatory power than subjective indicators. Furthermore, the objective voice characteristics are related to the interviewers' productivity in a nonlinear way." (author's abstract

Structured illumination microscopy of autofluorescent aggregations in human tissue

Sections from human eye tissue were analyzed with Structured Illumination Microscopy (SIM) using a specially designed microscope setup. In this microscope the structured illumination was generated with a Twyman-Green Interferometer. This SIM technique allowed us to acquire light-optical images of autofluorophore distributions in the tissue with previously unmatched optical resolution. In this work the unique setup of the microscope made possible the application of SIM with three different excitation wavelengths (488, 568 and 647nm), thus enabling us to gather spectral information about the autofluorescence signal

Quantitative super-resolution localization microscopy of DNA in situ using Vybrant® DyeCycle™ Violet fluorescent probe

Single Molecule Localization Microscopy (SMLM) is a recently emerged optical imaging method that was shown to achieve a resolution in the order of tens of nanometers in intact cells. Novel high resolution imaging methods might be crucial for understanding of how the chromatin, a complex of DNA and proteins, is arranged in the eukaryotic cell nucleus. Such an approach utilizing switching of a fluorescent, DNA-binding dye Vybrant® DyeCycle™ Violet has been previously demonstrated by us (Żurek-Biesiada et al., 2015) [1]. Here we provide quantitative information on the influence of the chemical environment on the behavior of the dye, discuss the variability in the DNA-associated signal density, and demonstrate direct proof of enhanced structural resolution. Furthermore, we compare different visualization approaches. Finally, we describe various opportunities of multicolor DNA/SMLM imaging in eukaryotic cell nuclei