8 research outputs found
In vivo-Untersuchungen von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Nicotiana tabacum
Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Ă„nderungen der
Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die
in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder
Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind,
sollten mit verschiedenen in vivo-Methoden Hinweise auf den biochemischen
Reaktions-Mechanismus gesammelt werden. Hierzu wurden zum einen
intermolekulare Interaktionen einzelner CDPK-Domänen mit dem bereits in Hefe
etablierten Split-Ubiquitin (SplitUB) System in trans untersucht. Zum
anderen wurde das System auch fĂĽr eine durch Agrobacterium tumefaciens
vermittelte, transiente Expression in der Tabak-Art Nicotiana benthamiana
weiterentwickelt und erfolgreich angewandt. Dabei konnte eine Interaktion
der Calmodulin-ähnlichen Domäne
(CLD) mit der autoinhibitorischen Junction-Domäne (J) der CDPK nachgewiesen
werden. Auch das System der "Bimolecular Fluorescence Complementation" wurde
fĂĽr die transiente Expression in N. benthamiana weiterentwickelt und konnte
Interaktionen der N-terminalen Domänen (VKJ) mit der CLD nachweisen.
Aufgrund stärkerer Hintergrund-Fluoreszenz konnte diese Methode nur Hinweise
auf eine mögliche Stimulus-Abhängigkeit der Interaktionen liefern. Neben den
intermolekularen Wechselwirkungen wurden auch intramolekulare Interaktionen
und somit die Gesamt-Konformation von Proteinen analysiert. Die hierzu
verwendete Methode des "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) in
cis konnte eine Abhängigkeit der Konformation von der Struktur der
Junction-Domäne in planta nachweisen. Zudem wurde das SplitUB-System in cis
fĂĽr die Anwendung in Pflanze weiterentwickelt.
Hiermit konnte durch Analysen mutierter Formen von NtCDPK2 eine Abhängigkeit
der Konformation von einer biologischen Funktionalität sowohl der
Kinase-Domäne als auch von J aufgezeigt werden. Ebenso spielte die
Calcium-Affinität der in der CLD lokalisierten EF-Hände eine zentrale Rolle.
Diese Ergebnisse vervollständigten ein in der Literatur diskutiertes
Aktivierungs-Modell fĂĽr CDPKs. Aufgrund einer hohen Hintergrund-Abspaltung
des Reporters konnten jedoch keine Aussagen ĂĽber schnelle, dynamische
Prozesse wie z.B. nach einer Stimulus-induzierten, transienten Aktivierung
des Enzyms getroffen werden. Das SplitUB-System wurde auch fĂĽr
Untersuchungen von Licht-abhängigen Konformations-Änderungen am Beispiel des
Cryptochroms AtCRY2 aus Arabidopsis thaliana angewandt. Dieser UV-A- und
Blaulicht-Rezeptor lieĂź einen eindeutigeren Nachweis erwarten, da eine
konstante Aktivierung des Enzyms durch Lichteinstrahlung postuliert wird. Es
konnte in dieser Arbeit erstmals die Licht-abhängige Konformations-Änderung
eines Cryptochroms in vivo nachgewiesen werden. Das SplitUB-System erlaubte
es hierbei im Gegensatz zu Untersuchungen an NtCDPK2, auch reziproke und
dynamische Unterschiede nach Ăśbergang in Dauerlicht- oder
Dauerdunkel-Bedingungen zu detektieren
In vivo-Untersuchungen von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Nicotiana tabacum
Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Ă„nderungen der
Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die
in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder
Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind,
sollten mit verschiedenen in vivo-Methoden Hinweise auf den biochemischen
Reaktions-Mechanismus gesammelt werden. Hierzu wurden zum einen
intermolekulare Interaktionen einzelner CDPK-Domänen mit dem bereits in Hefe
etablierten Split-Ubiquitin (SplitUB) System in trans untersucht. Zum
anderen wurde das System auch fĂĽr eine durch Agrobacterium tumefaciens
vermittelte, transiente Expression in der Tabak-Art Nicotiana benthamiana
weiterentwickelt und erfolgreich angewandt. Dabei konnte eine Interaktion
der Calmodulin-ähnlichen Domäne
(CLD) mit der autoinhibitorischen Junction-Domäne (J) der CDPK nachgewiesen
werden. Auch das System der "Bimolecular Fluorescence Complementation" wurde
fĂĽr die transiente Expression in N. benthamiana weiterentwickelt und konnte
Interaktionen der N-terminalen Domänen (VKJ) mit der CLD nachweisen.
Aufgrund stärkerer Hintergrund-Fluoreszenz konnte diese Methode nur Hinweise
auf eine mögliche Stimulus-Abhängigkeit der Interaktionen liefern. Neben den
intermolekularen Wechselwirkungen wurden auch intramolekulare Interaktionen
und somit die Gesamt-Konformation von Proteinen analysiert. Die hierzu
verwendete Methode des "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) in
cis konnte eine Abhängigkeit der Konformation von der Struktur der
Junction-Domäne in planta nachweisen. Zudem wurde das SplitUB-System in cis
fĂĽr die Anwendung in Pflanze weiterentwickelt.
Hiermit konnte durch Analysen mutierter Formen von NtCDPK2 eine Abhängigkeit
der Konformation von einer biologischen Funktionalität sowohl der
Kinase-Domäne als auch von J aufgezeigt werden. Ebenso spielte die
Calcium-Affinität der in der CLD lokalisierten EF-Hände eine zentrale Rolle.
Diese Ergebnisse vervollständigten ein in der Literatur diskutiertes
Aktivierungs-Modell fĂĽr CDPKs. Aufgrund einer hohen Hintergrund-Abspaltung
des Reporters konnten jedoch keine Aussagen ĂĽber schnelle, dynamische
Prozesse wie z.B. nach einer Stimulus-induzierten, transienten Aktivierung
des Enzyms getroffen werden. Das SplitUB-System wurde auch fĂĽr
Untersuchungen von Licht-abhängigen Konformations-Änderungen am Beispiel des
Cryptochroms AtCRY2 aus Arabidopsis thaliana angewandt. Dieser UV-A- und
Blaulicht-Rezeptor lieĂź einen eindeutigeren Nachweis erwarten, da eine
konstante Aktivierung des Enzyms durch Lichteinstrahlung postuliert wird. Es
konnte in dieser Arbeit erstmals die Licht-abhängige Konformations-Änderung
eines Cryptochroms in vivo nachgewiesen werden. Das SplitUB-System erlaubte
es hierbei im Gegensatz zu Untersuchungen an NtCDPK2, auch reziproke und
dynamische Unterschiede nach Ăśbergang in Dauerlicht- oder
Dauerdunkel-Bedingungen zu detektieren
Coupling of protein localization and cell movements by a dynamically localized response regulator in Myxococcus xanthus
Myxococcus xanthus cells harbor two motility machineries, type IV pili (Tfp) and the A-engine. During reversals, the two machineries switch polarity synchronously. We present a mechanism that synchronizes this polarity switching. We identify the required for motility response regulator (RomR) as essential for A-motility. RomR localizes in a bipolar, asymmetric pattern with a large cluster at the lagging cell pole. The large RomR cluster relocates to the new lagging pole in parallel with cell reversals. Dynamic RomR localization is essential for cell reversals, suggesting that RomR relocalization induces the polarity switching of the A-engine. The analysis of RomR mutants shows that the output domain targets RomR to the poles and the receiver domain is essential for dynamic localization. The small GTPase MglA establishes correct RomR polarity, and the Frz two-component system regulates dynamic RomR localization. FrzS localizes with Tfp at the leading pole and relocates in an Frz-dependent manner to the opposite pole during reversals; FrzS and RomR localize and oscillate independently. The Frz system synchronizes these oscillations and thus the synchronous polarity switching of the motility machineries
Antagonistic control of powdery mildew host cell entry by barley calcium-dependent protein kinases (CDPKs)
Ethylene-mediated cross-talk between calcium-dependent protein kinase and MAPK signaling controls stress responses in plants
Plants are constantly exposed to environmental changes and need to integrate multiple external stress cues. Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) are implicated as major primary Ca(2+) sensors in plants. CDPK activation, like activation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), is triggered by biotic and abiotic stresses, although distinct stimulus-specific stress responses are induced. To investigate whether CDPKs are part of an underlying mechanism to guarantee response specificity, we identified CDPK-controlled signaling pathways. A truncated form of Nicotiana tabacum CDPK2 lacking its regulatory autoinhibitor and calcium-binding domains was ectopically expressed in Nicotiana benthamiana. Infiltrated leaves responded to an abiotic stress stimulus with the activation of biotic stress reactions. These responses included synthesis of reactive oxygen species, defense gene induction, and SGT1-dependent cell death. Furthermore, N-terminal CDPK2 signaling triggered enhanced levels of the phytohormones jasmonic acid, 12-oxo-phytodienoic acid, and ethylene but not salicylic acid. These responses, commonly only observed after challenge with a strong biotic stimulus, were prevented when the CDPK's intrinsic autoinhibitory peptide was coexpressed. Remarkably, elevated CDPK signaling compromised stress-induced MAPK activation, and this inhibition required ethylene synthesis and perception. These data indicate that CDPK and MAPK pathways do not function independently and that a concerted activation of both pathways controls response specificity to biotic and abiotic stress
Multisite evaluation of phenotypic plasticity for specialized metabolites, some involved in carrot quality and disease resistance
International audienceRenewed consumer demand motivates the nutritional and sensory quality improvement of fruits and vegetables. Specialized metabolites being largely involved in nutritional and sensory quality of carrot, a better knowledge of their phenotypic variability is required. A metabolomic approach was used to evaluate phenotypic plasticity level of carrot commercial varieties, over three years and a wide range of cropping environments spread over several geographical areas in France. Seven groups of metabolites have been quantified by HPLC or GC methods: sugars, carotenoids, terpenes, phenolic compounds, phenylpropanoids and polyacetylenes. A large variation in root metabolic profiles was observed, in relation with environment, variety and variety by environment interaction effects in decreasing order of importance. Our results show a clear diversity structuration based on metabolite content. Polyacetylenes, beta-pinene and alpha-carotene were identified mostly as relatively stable varietal markers, exhibiting static stability. Nevertheless, environment effect was substantial for a large part of carrot metabolic profile and various levels of phenotypic plasticity were observed depending on metabolites and varieties. A strong difference of environmental sensitivity between varieties was observed for several compounds, particularly myristicin, 6MM and D-germacrene, known to be involved in responses to biotic and abiotic stress. This work provides useful information about plasticity in the perspective of carrot breeding and production. A balance between constitutive content and environmental sensitivity for key metabolites should be reached for quality improvement in carrot and other vegetables