In vivo-Untersuchungen von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Nicotiana tabacum

Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind, sollten mit verschiedenen in vivo-Methoden Hinweise auf den biochemischen Reaktions-Mechanismus gesammelt werden. Hierzu wurden zum einen intermolekulare Interaktionen einzelner CDPK-Domänen mit dem bereits in Hefe etablierten Split-Ubiquitin (SplitUB) System in trans untersucht. Zum anderen wurde das System auch für eine durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte, transiente Expression in der Tabak-Art Nicotiana benthamiana weiterentwickelt und erfolgreich angewandt. Dabei konnte eine Interaktion der Calmodulin-ähnlichen Domäne (CLD) mit der autoinhibitorischen Junction-Domäne (J) der CDPK nachgewiesen werden. Auch das System der "Bimolecular Fluorescence Complementation" wurde für die transiente Expression in N. benthamiana weiterentwickelt und konnte Interaktionen der N-terminalen Domänen (VKJ) mit der CLD nachweisen. Aufgrund stärkerer Hintergrund-Fluoreszenz konnte diese Methode nur Hinweise auf eine mögliche Stimulus-Abhängigkeit der Interaktionen liefern. Neben den intermolekularen Wechselwirkungen wurden auch intramolekulare Interaktionen und somit die Gesamt-Konformation von Proteinen analysiert. Die hierzu verwendete Methode des "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) in cis konnte eine Abhängigkeit der Konformation von der Struktur der Junction-Domäne in planta nachweisen. Zudem wurde das SplitUB-System in cis für die Anwendung in Pflanze weiterentwickelt. Hiermit konnte durch Analysen mutierter Formen von NtCDPK2 eine Abhängigkeit der Konformation von einer biologischen Funktionalität sowohl der Kinase-Domäne als auch von J aufgezeigt werden. Ebenso spielte die Calcium-Affinität der in der CLD lokalisierten EF-Hände eine zentrale Rolle. Diese Ergebnisse vervollständigten ein in der Literatur diskutiertes Aktivierungs-Modell für CDPKs. Aufgrund einer hohen Hintergrund-Abspaltung des Reporters konnten jedoch keine Aussagen über schnelle, dynamische Prozesse wie z.B. nach einer Stimulus-induzierten, transienten Aktivierung des Enzyms getroffen werden. Das SplitUB-System wurde auch für Untersuchungen von Licht-abhängigen Konformations-Änderungen am Beispiel des Cryptochroms AtCRY2 aus Arabidopsis thaliana angewandt. Dieser UV-A- und Blaulicht-Rezeptor ließ einen eindeutigeren Nachweis erwarten, da eine konstante Aktivierung des Enzyms durch Lichteinstrahlung postuliert wird. Es konnte in dieser Arbeit erstmals die Licht-abhängige Konformations-Änderung eines Cryptochroms in vivo nachgewiesen werden. Das SplitUB-System erlaubte es hierbei im Gegensatz zu Untersuchungen an NtCDPK2, auch reziproke und dynamische Unterschiede nach Übergang in Dauerlicht- oder Dauerdunkel-Bedingungen zu detektieren

In vivo-Untersuchungen von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Nicotiana tabacum

Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind, sollten mit verschiedenen in vivo-Methoden Hinweise auf den biochemischen Reaktions-Mechanismus gesammelt werden. Hierzu wurden zum einen intermolekulare Interaktionen einzelner CDPK-Domänen mit dem bereits in Hefe etablierten Split-Ubiquitin (SplitUB) System in trans untersucht. Zum anderen wurde das System auch für eine durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte, transiente Expression in der Tabak-Art Nicotiana benthamiana weiterentwickelt und erfolgreich angewandt. Dabei konnte eine Interaktion der Calmodulin-ähnlichen Domäne (CLD) mit der autoinhibitorischen Junction-Domäne (J) der CDPK nachgewiesen werden. Auch das System der "Bimolecular Fluorescence Complementation" wurde für die transiente Expression in N. benthamiana weiterentwickelt und konnte Interaktionen der N-terminalen Domänen (VKJ) mit der CLD nachweisen. Aufgrund stärkerer Hintergrund-Fluoreszenz konnte diese Methode nur Hinweise auf eine mögliche Stimulus-Abhängigkeit der Interaktionen liefern. Neben den intermolekularen Wechselwirkungen wurden auch intramolekulare Interaktionen und somit die Gesamt-Konformation von Proteinen analysiert. Die hierzu verwendete Methode des "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) in cis konnte eine Abhängigkeit der Konformation von der Struktur der Junction-Domäne in planta nachweisen. Zudem wurde das SplitUB-System in cis für die Anwendung in Pflanze weiterentwickelt. Hiermit konnte durch Analysen mutierter Formen von NtCDPK2 eine Abhängigkeit der Konformation von einer biologischen Funktionalität sowohl der Kinase-Domäne als auch von J aufgezeigt werden. Ebenso spielte die Calcium-Affinität der in der CLD lokalisierten EF-Hände eine zentrale Rolle. Diese Ergebnisse vervollständigten ein in der Literatur diskutiertes Aktivierungs-Modell für CDPKs. Aufgrund einer hohen Hintergrund-Abspaltung des Reporters konnten jedoch keine Aussagen über schnelle, dynamische Prozesse wie z.B. nach einer Stimulus-induzierten, transienten Aktivierung des Enzyms getroffen werden. Das SplitUB-System wurde auch für Untersuchungen von Licht-abhängigen Konformations-Änderungen am Beispiel des Cryptochroms AtCRY2 aus Arabidopsis thaliana angewandt. Dieser UV-A- und Blaulicht-Rezeptor ließ einen eindeutigeren Nachweis erwarten, da eine konstante Aktivierung des Enzyms durch Lichteinstrahlung postuliert wird. Es konnte in dieser Arbeit erstmals die Licht-abhängige Konformations-Änderung eines Cryptochroms in vivo nachgewiesen werden. Das SplitUB-System erlaubte es hierbei im Gegensatz zu Untersuchungen an NtCDPK2, auch reziproke und dynamische Unterschiede nach Übergang in Dauerlicht- oder Dauerdunkel-Bedingungen zu detektieren

Coupling of protein localization and cell movements by a dynamically localized response regulator in Myxococcus xanthus

Myxococcus xanthus cells harbor two motility machineries, type IV pili (Tfp) and the A-engine. During reversals, the two machineries switch polarity synchronously. We present a mechanism that synchronizes this polarity switching. We identify the required for motility response regulator (RomR) as essential for A-motility. RomR localizes in a bipolar, asymmetric pattern with a large cluster at the lagging cell pole. The large RomR cluster relocates to the new lagging pole in parallel with cell reversals. Dynamic RomR localization is essential for cell reversals, suggesting that RomR relocalization induces the polarity switching of the A-engine. The analysis of RomR mutants shows that the output domain targets RomR to the poles and the receiver domain is essential for dynamic localization. The small GTPase MglA establishes correct RomR polarity, and the Frz two-component system regulates dynamic RomR localization. FrzS localizes with Tfp at the leading pole and relocates in an Frz-dependent manner to the opposite pole during reversals; FrzS and RomR localize and oscillate independently. The Frz system synchronizes these oscillations and thus the synchronous polarity switching of the motility machineries

Ethylene-mediated cross-talk between calcium-dependent protein kinase and MAPK signaling controls stress responses in plants

Plants are constantly exposed to environmental changes and need to integrate multiple external stress cues. Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) are implicated as major primary Ca(2+) sensors in plants. CDPK activation, like activation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), is triggered by biotic and abiotic stresses, although distinct stimulus-specific stress responses are induced. To investigate whether CDPKs are part of an underlying mechanism to guarantee response specificity, we identified CDPK-controlled signaling pathways. A truncated form of Nicotiana tabacum CDPK2 lacking its regulatory autoinhibitor and calcium-binding domains was ectopically expressed in Nicotiana benthamiana. Infiltrated leaves responded to an abiotic stress stimulus with the activation of biotic stress reactions. These responses included synthesis of reactive oxygen species, defense gene induction, and SGT1-dependent cell death. Furthermore, N-terminal CDPK2 signaling triggered enhanced levels of the phytohormones jasmonic acid, 12-oxo-phytodienoic acid, and ethylene but not salicylic acid. These responses, commonly only observed after challenge with a strong biotic stimulus, were prevented when the CDPK's intrinsic autoinhibitory peptide was coexpressed. Remarkably, elevated CDPK signaling compromised stress-induced MAPK activation, and this inhibition required ethylene synthesis and perception. These data indicate that CDPK and MAPK pathways do not function independently and that a concerted activation of both pathways controls response specificity to biotic and abiotic stress

Multisite evaluation of phenotypic plasticity for specialized metabolites, some involved in carrot quality and disease resistance

International audienceRenewed consumer demand motivates the nutritional and sensory quality improvement of fruits and vegetables. Specialized metabolites being largely involved in nutritional and sensory quality of carrot, a better knowledge of their phenotypic variability is required. A metabolomic approach was used to evaluate phenotypic plasticity level of carrot commercial varieties, over three years and a wide range of cropping environments spread over several geographical areas in France. Seven groups of metabolites have been quantified by HPLC or GC methods: sugars, carotenoids, terpenes, phenolic compounds, phenylpropanoids and polyacetylenes. A large variation in root metabolic profiles was observed, in relation with environment, variety and variety by environment interaction effects in decreasing order of importance. Our results show a clear diversity structuration based on metabolite content. Polyacetylenes, beta-pinene and alpha-carotene were identified mostly as relatively stable varietal markers, exhibiting static stability. Nevertheless, environment effect was substantial for a large part of carrot metabolic profile and various levels of phenotypic plasticity were observed depending on metabolites and varieties. A strong difference of environmental sensitivity between varieties was observed for several compounds, particularly myristicin, 6MM and D-germacrene, known to be involved in responses to biotic and abiotic stress. This work provides useful information about plasticity in the perspective of carrot breeding and production. A balance between constitutive content and environmental sensitivity for key metabolites should be reached for quality improvement in carrot and other vegetables