Neutrophil-fibroblast crosstalk drives immunofibrosis in Crohn’s disease through IFNα pathway

IntroductionCrohn’s disease (CD) is characterized by chronic inflammation and intestinal fibrosis leading to lifelong complications. However, the disease pathogenesis remains elusive, and the therapeutic options are limited. Here, we investigated the interaction between neutrophils and intestinal fibroblasts in the development of CD immunofibrosis, a disease mechanism predisposing to inflammatory and fibrotic complications.MethodsPeripheral neutrophils, enriched neutrophil extracellular traps (eNETs), serum, primary intestinal fibroblasts (PIFs) and intestinal biopsies from CD, ulcerative colitis (UC) patients, and healthy individuals (HI), were studied. Transcriptome analysis of neutrophils, multi-cytokine profiling and cell-based functional assays at mRNA/protein level were performed.ResultsCompared to UC, PIFs from CD patients, independently to the presence of strictures, displayed a distinct pro-fibrotic phenotype characterized by negative Krüppellike Factor-2 (KLF2) and increased cellular communication network factor-2 (CCN2) expression leading to collagen production. In both UC and CD, PIFs-derived IL-8 acted as a culprit chemoattractant for neutrophils in the intestine, where CD neutrophils were accumulated close to fibrotic lesions. Functionally, only CD neutrophils via eNETs induced a CD-like phenotype in HI PIFs, suggesting their fibrotic plasticity. High IFNa in serum and IFΝ-responsive signature in peripheral neutrophils were observed in CD, distinguishing it from UC. Moreover, CD serum stimulated the release of fibrogenic eNETs from neutrophils in an IFNa-dependent manner, suggesting the priming role of IFNa in circulating neutrophils. Inhibition of eNETs or JAK signaling in neutrophils or PIFs prevented the neutrophil-mediated fibrotic effect on PIFs. Furthermore, both serum IFNa levels and mRNA levels of key IFN signaling components in neutrophils were wellcorrelated with CD severity.ConclusionsThis study reveals the important role of the IFNa/neutrophil/fibroblast axis in CD immunofibrosis, suggesting candidate biomarkers and putative therapeutic targets

Επίδραση του συστήματος σηματοδότησης της υπεροικογένειας του TGFβ κατά την ομοιόσταση και παθοφυσιολογία του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος

Η υπεροικογένεια του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού β (TGFβ) συνίσταται από περισσότερα από 30 μέλη, που σχετίζονται δομικά μεταξύ τους, και περιλαμβάνει τους TGFβs, τις μορφογενετικές πρωτεΐνες των οστών (BMPs), τις Ακτιβίνες και άλλα. Η σηματοδότηση από μέλη της συγκεκριμένης υπεροικογένειας έχει συνδεθεί με θεμελιώδεις διαδικασίες που διέπουν την ομοιόσταση του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), συμπεριλαμβανομένων της νευρογένεσης, της διαφοροποίησης των κυττάρων της γλοίας, της συγκρότησης και διατήρησης της ακεραιότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και άλλων. Επιπλέον, πολυάριθμες μελέτες συσχετίζουν την υπεροικογένεια του TGFβ με παθολογικές καταστάσεις του ΚΝΣ που αφορούν μεγάλο ποσοστό του παγκόσμιου πληθυσμού, όπως η νευροφλεγμονή, οι βλάβες μετά από μηχανικές τραυματικές κακώσεις και οι νευροεκφυλιστικές νόσοι. Μάλιστα, αρκετοί παράγοντες του συγκεκριμένου σηματοδοτικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων προσδετών, υποδοχέων και ενδοκυττάριων τελεστών, υπερεκφράζονται σε επίπεδο mRNA ή/και πρωτεΐνης σε πειραματικά μοντέλα μηχανικού ή/και βιοχημικού τραυματισμού του νευρικού ιστού, μέσω χορήγησης νευροτοξινών. Επιπλέον, έχουν βρεθεί αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα των ίδιων παραγόντων σε κακώσεις του ανθρώπινου νωτιαίου μυελού, καθώς και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ή το ραβδωτό σώμα ασθενών με νόσο Πάρκινσον. Παρά την εκτενή μελέτη μεμονωμένων παραγόντων της υπεροικογένειας του TGFβ κατά την ομοιόσταση και παθοφυσιολογία του ΚΝΣ, τα δεδομένα που αφορούν στην ταυτότητα των κυτταρικών αποδεκτών της δράσης αυτής, καθώς και στον τρόπο με τον οποίο τα κύτταρα αυτά αποκωδικοποιούν τα περίπλοκα σήματα που δέχονται από κυτταροκίνες της υπεροικογένειας ώστε να εκδηλώσουν την κατάλληλη φυσιολογική απόκριση σε μια δεδομένη χρονική στιγμή, παραμένουν ελλιπή και αρκετά ασαφή. Αδιευκρίνιστος παραμένει επίσης ο ακριβής ρόλος της ενεργοποίησης των δύο βασικών κλάδων του συστήματος, της TGFβ- και της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης, σε παθολογικές καταστάσεις του ΚΝΣ. Υπάρχει αλληλεπίδραση των δύο σηματοδοτικών κλάδων σε αποκλίνουσες από την ομοιόσταση συνθήκες; Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η αποσαφήνιση των παραπάνω ερωτημάτων χρησιμοποιώντας ένα σύστημα διπλά διαγονιδιακών μυών αναφοράς που αναπτύχθηκε στο ΙΙΒΕΑΑ μέσω διασταύρωσης δύο διαγονιδιακών σειρών που φέρουν στο γονιδίωμά τους τα γονίδια της κόκκινης (RFP) και της ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (eGFP) υπό τον έλεγχο καλά χαρακτηρισμένων αλληλουχιών ειδικής απόκρισης σε TGFβs/Ακτιβίνες (TGFβ Responsive Elements, TRE-RFP) ή σε BMPs (BMP Responsive Elements, BRE-eGFP), αντίστοιχα. Οι δυνητικοί κυτταρικοί αποδέκτες της κανονικής TGFβ ή BMP σηματοδότησης εκφράζουν την πρωτεΐνη RFP ή eGFP, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο ζωικό μοντέλο διαπιστώθηκε ότι η σηματοδότηση από μέλη της υπεροικογένειας του TGFβ είναι ενεργή και οριοθετημένη σε διάφορες περιοχές του νεογνικού και του ενήλικου εγκεφάλου υπό ομοιοστατικές συνθήκες, όπως στους οσφρητικούς βολβούς, στο φλοιό, στα τοιχώματα των κοιλιών, στο χοριοειδές πλέγμα και στο αγγειακό δίκτυο. Μάλιστα, στους κυτταρικούς αποδέκτες της TGFβ ή/και της BMP σηματοδότησης περιλαμβάνονταν νευρώνες, αστροκύτταρα και δομικά κύτταρα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, όπως ενδοθηλιακά κύτταρα και περικύτταρα. Προκειμένου να μελετηθεί η συμμετοχή των TGFβ και BMP κλάδων στην παθοφυσιολογία του ΚΝΣ, εφαρμόστηκε ένα μοντέλο εστιακού διεισδυτικού εγκεφαλικού τραυματισμού. Συγκεκριμένα, ενήλικοι μύες αγρίου τύπου υποβλήθηκαν σε μονόπλευρη οξεία κρανιοεγκεφαλική κάκωση και συλλέχθηκαν δείγματα εγκεφαλικού φλοιού που εμπεριείχαν τις τραυματισμένες και τις αντίστοιχες «υγιείς» περιοχές, σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τον τραυματισμό. Χαρακτηριστικοί δείκτες ενεργοποίησης της υπεροικογένειας του TGFβ, όπως η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Smad και η mRNA έκφραση προσδετών και γονιδίων-στόχων, τόσο της TGFβ όσο και της BMP σηματοδότησης, αυξήθηκαν στην περιοχή του τραύματος τις πρώτες ημέρες μετά την κάκωση. Με τη βοήθεια διπλά διαγονιδιακών μυών αναφοράς δείχθηκε ότι η ενεργοποίηση και των δύο σηματοδοτικών κλάδων αφορούσε κυρίως στα δραστικά αστροκύτταρα που οριοθετούσαν την περιοχή μεταξύ υγιούς και τραυματισμένου ιστού. Για την έμμεση διαλεύκανση του ρόλου της ενεργοποίησης της TGFβ- ή/και BMP-επαγόμενης σηματοδότησης στα κύτταρα της γλοίας που συναθροίζονται στο τραύμα, αναπτύχθηκαν συστήματα απομόνωσης και καλλιέργειας πρωτογενούς γλοίας, καθώς και πρωτόκολλα διαχωρισμού αυτών μέσω κυτταρομετρίας ροής για τη λήψη αμιγών αστροκυτταρικών και μικρογλοιακών πληθυσμών. Τα αμιγή κύτταρα διεγέρθηκαν παρουσία ανασυνδυασμένων TGFβ1 και ΒΜΡ4 και το μεταγράφωμά τους αναλύθηκε με τη μέθοδο της αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA-Seq). Τα αστροκύτταρα αποκρίθηκαν σημαντικά και στους δύο προσδέτες και μάλιστα παρουσίασαν ιδιαίτερα επικαλυπτόμενα μεταγραφικά προφίλ. Εντούτοις, η μικρογλοία ενώ αντέδρασε εξαιρετικά καλά στον TGFβ1, αποκρίθηκε πολύ ασθενώς παρουσία ΒΜΡ4, γεγονός που πιθανότατα σχετίζεται με τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης ΒΜΡ-σχετιζόμενων υποδοχέων και Smads συγκριτικά με τα αστροκύτταρα. H βιοπληροφορική ανάλυση του μεταγραφώματος των διεγερμένων με TGFβ1 και ΒΜΡ4 αστροκυττάρων ανέδειξε ένα σύνολο κυτταρικών διεργασιών που διέπουν την ιστική επιδιόρθωση και την αποκατάσταση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού έπειτα από τραυματισμό, όπως η βιοσύνθεση και μεταφορά χοληστερόλης, η έκφραση παραγόντων καθοδήγησης νευραξόνων, η παραγωγή συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας και η ρύθμιση της ομοιόστασης του γλουταμινικού οξέος. Επιπλέον, υπό την επίδραση και των δύο προσδετών στα αστροκύτταρα και παρουσία του TGFβ1 στη μικρογλοία, ο φαινότυπος της δραστικής γλοίας μετατοπίστηκε προς τους αντιφλεγμονώδεις και σχετιζόμενους με την ιστική επιδιόρθωση αστροκυτταρικό τύπου Α2 και μικρογλοιακούς τύπου Μ0/Μ2 φαινοτύπους, αντίστοιχα. Η αυξημένη έκφραση αφ’ ενός χαρακτηριστικών παραγόντων που συμμετέχουν στις παραπάνω in vitro ρυθμιζόμενες βιολογικές διεργασίες, και αφ’ ετέρου ειδικών μεταγράφων για τα αστροκύτταρα τύπου Α2, επιβεβαιώθηκε in vivo στην περιοχή του τραύματος, έπειτα από εστιακή κρανιοεγκεφαλική κάκωση, υποδεικνύοντας ότι οι διαδικασίες αυτές ρυθμίζονται πιθανότατα in situ από τη συνεργιστική δράση της TGFβ ή/και της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης. Εκτός του μηχανικού διεισδυτικού τραυματισμού, εφαρμόστηκε κι ένα μοντέλο βιοχημικού τραυματισμού του εγκεφάλου, μέσω χορήγησης της μιτοχονδριακής νευροτοξίνης MPTP για την προσομοίωση παρκινσονικών συμπτωμάτων σε ενήλικους μύες. Παρατηρήθηκε σημαντική ενεργοποίηση του συστήματος της υπεροικογένειας του TGFβ κατά μήκος της μελαινοραβδωτής οδού στα πειραματόζωα όπου χορηγήθηκε ΜΡΤΡ. Και σε αυτό το μοντέλο εγκεφαλικού τραυματισμού, οι κυτταρικοί αποδέκτες της TGFβ και της BMP σηματοδότησης στο ραβδωτό σώμα και τη μέλαινα ουσία ήταν στην πλειοψηφία τους αστροκύτταρα. Στη συνέχεια, διεξήχθη στερεοτακτική υπερέκφραση ενεργοποιητών ή αναστολέων της BMP σηματοδότησης στη μέλαινα ουσία των πειραματοζώων, πριν από τη χορήγηση MPTP, και μελετήθηκε η κινητική τους δραστηριότητα. Παρατηρήθηκε σχετική βελτίωση ορισμένων συμπεριφορικών παραμέτρων στα ζώα όπου υπερεκφράστηκε η Noggin, υποδεικνύοντας ότι αναστολή της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης στη μέλαινα ουσία παρέχει πιθανότατα νευροπροστατευτική δράση στην ομόπλευρη μελαινοραβδωτή οδό. Συνοψίζοντας, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο σύστημα μελέτης τον εγκέφαλο του μυός, αποκωδικοποιήθηκαν σημαντικές πτυχές της αλληλεπίδρασης μεταξύ των TGFβ και BMP κλάδων του συστήματος σηματοδότησης της υπεροικογένειας του TGFβ και τονίστηκε η σημασία του σχετικού ισοζυγίου των κυτταροκινών της υπεροικογένειας για τη ρύθμιση της ομοιόστασης και την εξέλιξη της παθολογίας στο ΚΝΣ. Ακόμη, αναδείχθηκαν βασικές νευροπροστατευτικές ή/και νευροτοξικές διεργασίες υπό παθοφυσιολογικές συνθήκες, καθώς και συγκεκριμένα μοριακά γεγονότα/μηχανισμοί, που αφορούν στα κύτταρα της γλοίας και μπορούν να αξιοποιηθούν μελλοντικά στην ανάπτυξη αποτελεσματικότερων θεραπευτικών προσεγγίσεων στο πλαίσιο νευροφλεγμονωδών διαταραχών ή/και τραυματικών κακώσεων του ΚΝΣ.The Transforming Growth Factor beta (TGFβ) superfamily comprises more than 30 structurally related members including, among others, TGFβs, Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) and Activins. Signaling by members of this superfamily has been implicated in fundamental processes regulating the homeostasis of the Central Nervous System (CNS), including neurogenesis, differentiation of glia cells, formation of blood-brain barrier and maintenance of its integrity and others. In addition, numerous studies have linked TGFβ superfamily to CNS pathologies affecting a large proportion of the world's population, such as neuroinflammation, tissue damage following mechanical traumatic injuries and neurodegenerative diseases. In fact, several components of this signaling system, including ligands, receptors and intracellular mediators, are upregulated at mRNA and/or protein levels in experimental models of mechanical and/or biochemical – through neurotoxin administration – CNS injuries. Furthermore, increased protein levels of these components have been found in human spinal cord injuries, as well as in the cerebrospinal fluid or the striatum of patients with Parkinson's disease. Despite the extensive characterization of individual components of the TGFβ superfamily system during CNS homeostasis and pathophysiology, data concerning the identity of recipient cells of this action, as well as the way by which these cells decode the complex TGFβ-superfamily system generated signaling-input to produce the desired physiological response at any given time, are still lacking. Τhe precise role of the two branches of this signaling system, the TGFβ/Activin- and the BMP-induced pathways, under CNS pathological conditions is still not fully understood. Is there a functional interplay between these two signaling branches in physiology and pathophysiology? The aim of this thesis was to clarify the above questions using a double transgenic reporter mice system, developed in BRFAA by crossing two transgenic animal lines carrying the genes of Red (RFP) and Green Fluorescent Proteins (eGFP) in their genome, under the control of well-characterized sequences responding selectively to TGFβs/Activins (TGFβ Responsive Elements, TRE-RFP) or BMPs (BMP Responsive Elements, BRE-eGFP), respectively. The potential cellular targets of canonical TGFβ or BMP signaling express the RFP or eGFP protein, respectively. Using this animal model in previous experiments, we found that signaling by members of the TGFβ superfamily is active and confined to various regions of neonatal and adult brain, such as the olfactory bulbs, the cortex, the ventricle walls, the choroid plexus and the vasculature, under homeostatic conditions. Actually, neurons, astrocytes and structural cells of the blood-brain barrier, such as endothelial cells and pericytes, were included among the cellular targets of TGFβ and/or BMP signaling. To investigate the contribution of both TGFβ and BMP signaling branches in CNS pathophysiology, we used a mouse model of penetrating focal brain injury. More specifically, adult wild-type mice were subjected to unilateral acute stab wound injury and brain tissues encompassing injured (ipsilateral) and corresponding intact (contralateral) areas were collected, at different time-points post-injury. Hallmarks of TGFβ-superfamily system activation, such as levels of phosphorylated Smads, ligands and target genes for both TGFβ and BMP pathways, were found upregulated within injured tissues, the first days post-injury. Next, using double transgenic reporter mice we showed that activation of both TGFβ and BMP signaling branches involved primarily reactive astrocytes that demarcated the wound area. In order to gain indirectly insights regarding the role of TGFβ and/or BMP signaling activation in glia cells within the injured tissues, we developed primary glia culture systems, as well as fluorescence-activated cell-sorting protocols for the establishment of purified astrocytic and microglial cultures. The latter were treated with recombinant TGFβ1 and BMP4 and their transcriptomes were analyzed by next-generation sequencing (RNA-Seq). Astrocytes responded substantially to both ligands with considerably overlapping transcriptional profiles. Although microglia responded remarkably well to TGFβ1, they failed to respond robustly to BMP4, a finding that is probably related to the relatively lower mRNA expression levels for BMP-related receptors and Smads, compared to the astrocytic ones. Bioinformatics analysis of the transcriptomic profiles of TGFβ1- or BMP4-treated astrocytes revealed novel pathways crucial for tissue-injury repair and blood-brain barrier restoration, such as activation of cholesterol biosynthesis and transport, production of axonal guidance and extracellular matrix components and regulation of glutamate homeostasis. Moreover, both ligands in astrocytes and TGFβ1 in microglia shifted the phenotype of reactive glia cells towards the anti-inflammatory and tissue-reparatory A2-like and M0/M2-like phenotypes, respectively. Increased expression of selected key components of the in vitro modulated pathways and markers of A2-like astrocytes was confirmed in vivo within the wound area, suggesting that these processes could also be modulated in situ by the integrated action of TGFβ- and/or BMP-mediated signaling. Besides the mechanical penetrating injury, a biochemical brain injury model was also applied, through administration of the mitochondrial neurotoxin MPTP that simulates a parkinsonian phenotype in adult mice. Substantial activation of the TGFβ superfamily signaling system was observed across the nigrostriatal pathway in MPTP-treated animals. Also in this brain injury model, the majority of TRE-RFP and BRE-eGFP positive cells in the striatum and the substantia nigra were identified as astrocytes. Then, stereotactic overexpression of activators or inhibitors of BMP signaling was performed in the substantia nigra of animals, prior to MPTP administration, followed by assessment of their locomotor activity. We observed a relative improvement in some behavioral parameters of animals subjected to Noggin overexpression, suggesting that focal inhibition of BMP signaling in the substantia nigra is probably exerting a neuroprotective action in the ipsilateral nigrostriatal pathway. To sum up, using the murine brain as model system, we uncovered important aspects of the interaction between TGFβ and BMP branches of the TGFβ superfamily signaling system and highlighted the importance of the relative equilibrium of cytokines/members of this system for the establishment of homeostasis and progression of pathology in the CNS. In addition, we identified not only key neuroprotective and/or neurotoxic processes under pathophysiological conditions, but also specific molecular events/mechanisms, which involve glia cells and could be potentially used towards the development of more effective therapeutic approaches in the context of neuroinflammatory disorders and/or traumatic CNS injuries

Role of the TGFβ superfamily signaling system in the homeostasis and pathophysiology of the central nervous system

The Transforming Growth Factor beta (TGFβ) superfamily comprises more than 30 structurally related members including, among others, TGFβs, Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) and Activins. Signaling by members of this superfamily has been implicated in fundamental processes regulating the homeostasis of the Central Nervous System (CNS), including neurogenesis, differentiation of glia cells, formation of blood-brain barrier and maintenance of its integrity and others. In addition, numerous studies have linked TGFβ superfamily to CNS pathologies affecting a large proportion of the world's population, such as neuroinflammation, tissue damage following mechanical traumatic injuries and neurodegenerative diseases. In fact, several components of this signaling system, including ligands, receptors and intracellular mediators, are upregulated at mRNA and/or protein levels in experimental models of mechanical and/or biochemical – through neurotoxin administration – CNS injuries. Furthermore, increased protein levels of these components have been found in human spinal cord injuries, as well as in the cerebrospinal fluid or the striatum of patients with Parkinson's disease. Despite the extensive characterization of individual components of the TGFβ superfamily system during CNS homeostasis and pathophysiology, data concerning the identity of recipient cells of this action, as well as the way by which these cells decode the complex TGFβ-superfamily system generated signaling-input to produce the desired physiological response at any given time, are still lacking. Τhe precise role of the two branches of this signaling system, the TGFβ/Activin- and the BMP-induced pathways, under CNS pathological conditions is still not fully understood. Is there a functional interplay between these two signaling branches in physiology and pathophysiology? The aim of this thesis was to clarify the above questions using a double transgenic reporter mice system, developed in BRFAA by crossing two transgenic animal lines carrying the genes of Red (RFP) and Green Fluorescent Proteins (eGFP) in their genome, under the control of well-characterized sequences responding selectively to TGFβs/Activins (TGFβ Responsive Elements, TRE-RFP) or BMPs (BMP Responsive Elements, BRE-eGFP), respectively. The potential cellular targets of canonical TGFβ or BMP signaling express the RFP or eGFP protein, respectively. Using this animal model in previous experiments, we found that signaling by members of the TGFβ superfamily is active and confined to various regions of neonatal and adult brain, such as the olfactory bulbs, the cortex, the ventricle walls, the choroid plexus and the vasculature, under homeostatic conditions. Actually, neurons, astrocytes and structural cells of the blood-brain barrier, such as endothelial cells and pericytes, were included among the cellular targets of TGFβ and/or BMP signaling. To investigate the contribution of both TGFβ and BMP signaling branches in CNS pathophysiology, we used a mouse model of penetrating focal brain injury. More specifically, adult wild-type mice were subjected to unilateral acute stab wound injury and brain tissues encompassing injured (ipsilateral) and corresponding intact (contralateral) areas were collected, at different time-points post-injury. Hallmarks of TGFβ-superfamily system activation, such as levels of phosphorylated Smads, ligands and target genes for both TGFβ and BMP pathways, were found upregulated within injured tissues, the first days post-injury. Next, using double transgenic reporter mice we showed that activation of both TGFβ and BMP signaling branches involved primarily reactive astrocytes that demarcated the wound area. In order to gain indirectly insights regarding the role of TGFβ and/or BMP signaling activation in glia cells within the injured tissues, we developed primary glia culture systems, as well as fluorescence-activated cell-sorting protocols for the establishment of purified astrocytic and microglial cultures. The latter were treated with recombinant TGFβ1 and BMP4 and their transcriptomes were analyzed by next-generation sequencing (RNA-Seq). Astrocytes responded substantially to both ligands with considerably overlapping transcriptional profiles. Although microglia responded remarkably well to TGFβ1, they failed to respond robustly to BMP4, a finding that is probably related to the relatively lower mRNA expression levels for BMP-related receptors and Smads, compared to the astrocytic ones.Bioinformatics analysis of the transcriptomic profiles of TGFβ1- or BMP4-treated astrocytes revealed novel pathways crucial for tissue-injury repair and blood-brain barrier restoration, such as activation of cholesterol biosynthesis and transport, production of axonal guidance and extracellular matrix components and regulation of glutamate homeostasis. Moreover, both ligands in astrocytes and TGFβ1 in microglia shifted the phenotype of reactive glia cells towards the anti-inflammatory and tissue-reparatory A2-like and M0/M2-like phenotypes, respectively. Increased expression of selected key components of the in vitro modulated pathways and markers of A2-like astrocytes was confirmed in vivo within the wound area, suggesting that these processes could also be modulated in situ by the integrated action of TGFβ- and/or BMP-mediated signaling. Besides the mechanical penetrating injury, a biochemical brain injury model was also applied, through administration of the mitochondrial neurotoxin MPTP that simulates a parkinsonian phenotype in adult mice. Substantial activation of the TGFβ superfamily signaling system was observed across the nigrostriatal pathway in MPTP-treated animals. Also in this brain injury model, the majority of TRE-RFP and BRE-eGFP positive cells in the striatum and the substantia nigra were identified as astrocytes. Then, stereotactic overexpression of activators or inhibitors of BMP signaling was performed in the substantia nigra of animals, prior to MPTP administration, followed by assessment of their locomotor activity. We observed a relative improvement in some behavioral parameters of animals subjected to Noggin overexpression, suggesting that focal inhibition of BMP signaling in the substantia nigra is probably exerting a neuroprotective action in the ipsilateral nigrostriatal pathway. To sum up, using the murine brain as model system, we uncovered important aspects of the interaction between TGFβ and BMP branches of the TGFβ superfamily signaling system and highlighted the importance of the relative equilibrium of cytokines/members of this system for the establishment of homeostasis and progression of pathology in the CNS. In addition, we identified not only key neuroprotective and/or neurotoxic processes under pathophysiological conditions, but also specific molecular events/mechanisms, which involve glia cells and could be potentially used towards the development of more effective therapeutic approaches in the context of neuroinflammatory disorders and/or traumatic CNS injuries.Η υπεροικογένεια του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού β (TGFβ) συνίσταται από περισσότερα από 30 μέλη, που σχετίζονται δομικά μεταξύ τους, και περιλαμβάνει τους TGFβs, τις μορφογενετικές πρωτεΐνες των οστών (BMPs), τις Ακτιβίνες και άλλα. Η σηματοδότηση από μέλη της συγκεκριμένης υπεροικογένειας έχει συνδεθεί με θεμελιώδεις διαδικασίες που διέπουν την ομοιόσταση του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), συμπεριλαμβανομένων της νευρογένεσης, της διαφοροποίησης των κυττάρων της γλοίας, της συγκρότησης και διατήρησης της ακεραιότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και άλλων. Επιπλέον, πολυάριθμες μελέτες συσχετίζουν την υπεροικογένεια του TGFβ με παθολογικές καταστάσεις του ΚΝΣ που αφορούν μεγάλο ποσοστό του παγκόσμιου πληθυσμού, όπως η νευροφλεγμονή, οι βλάβες μετά από μηχανικές τραυματικές κακώσεις και οι νευροεκφυλιστικές νόσοι. Μάλιστα, αρκετοί παράγοντες του συγκεκριμένου σηματοδοτικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων προσδετών, υποδοχέων και ενδοκυττάριων τελεστών, υπερεκφράζονται σε επίπεδο mRNA ή/και πρωτεΐνης σε πειραματικά μοντέλα μηχανικού ή/και βιοχημικού τραυματισμού του νευρικού ιστού, μέσω χορήγησης νευροτοξινών. Επιπλέον, έχουν βρεθεί αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα των ίδιων παραγόντων σε κακώσεις του ανθρώπινου νωτιαίου μυελού, καθώς και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ή το ραβδωτό σώμα ασθενών με νόσο Πάρκινσον. Παρά την εκτενή μελέτη μεμονωμένων παραγόντων της υπεροικογένειας του TGFβ κατά την ομοιόσταση και παθοφυσιολογία του ΚΝΣ, τα δεδομένα που αφορούν στην ταυτότητα των κυτταρικών αποδεκτών της δράσης αυτής, καθώς και στον τρόπο με τον οποίο τα κύτταρα αυτά αποκωδικοποιούν τα περίπλοκα σήματα που δέχονται από κυτταροκίνες της υπεροικογένειας ώστε να εκδηλώσουν την κατάλληλη φυσιολογική απόκριση σε μια δεδομένη χρονική στιγμή, παραμένουν ελλιπή και αρκετά ασαφή. Αδιευκρίνιστος παραμένει επίσης ο ακριβής ρόλος της ενεργοποίησης των δύο βασικών κλάδων του συστήματος, της TGFβ- και της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης, σε παθολογικές καταστάσεις του ΚΝΣ. Υπάρχει αλληλεπίδραση των δύο σηματοδοτικών κλάδων σε αποκλίνουσες από την ομοιόσταση συνθήκες;Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η αποσαφήνιση των παραπάνω ερωτημάτων χρησιμοποιώντας ένα σύστημα διπλά διαγονιδιακών μυών αναφοράς που αναπτύχθηκε στο ΙΙΒΕΑΑ μέσω διασταύρωσης δύο διαγονιδιακών σειρών που φέρουν στο γονιδίωμά τους τα γονίδια της κόκκινης (RFP) και της ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (eGFP) υπό τον έλεγχο καλά χαρακτηρισμένων αλληλουχιών ειδικής απόκρισης σε TGFβs/Ακτιβίνες (TGFβ Responsive Elements, TRE-RFP) ή σε BMPs (BMP Responsive Elements, BRE-eGFP), αντίστοιχα. Οι δυνητικοί κυτταρικοί αποδέκτες της κανονικής TGFβ ή BMP σηματοδότησης εκφράζουν την πρωτεΐνη RFP ή eGFP, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο ζωικό μοντέλο διαπιστώθηκε ότι η σηματοδότηση από μέλη της υπεροικογένειας του TGFβ είναι ενεργή και οριοθετημένη σε διάφορες περιοχές του νεογνικού και του ενήλικου εγκεφάλου υπό ομοιοστατικές συνθήκες, όπως στους οσφρητικούς βολβούς, στο φλοιό, στα τοιχώματα των κοιλιών, στο χοριοειδές πλέγμα και στο αγγειακό δίκτυο. Μάλιστα, στους κυτταρικούς αποδέκτες της TGFβ ή/και της BMP σηματοδότησης περιλαμβάνονταν νευρώνες, αστροκύτταρα και δομικά κύτταρα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, όπως ενδοθηλιακά κύτταρα και περικύτταρα. Προκειμένου να μελετηθεί η συμμετοχή των TGFβ και BMP κλάδων στην παθοφυσιολογία του ΚΝΣ, εφαρμόστηκε ένα μοντέλο εστιακού διεισδυτικού εγκεφαλικού τραυματισμού. Συγκεκριμένα, ενήλικοι μύες αγρίου τύπου υποβλήθηκαν σε μονόπλευρη οξεία κρανιοεγκεφαλική κάκωση και συλλέχθηκαν δείγματα εγκεφαλικού φλοιού που εμπεριείχαν τις τραυματισμένες και τις αντίστοιχες «υγιείς» περιοχές, σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τον τραυματισμό. Χαρακτηριστικοί δείκτες ενεργοποίησης της υπεροικογένειας του TGFβ, όπως η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Smad και η mRNA έκφραση προσδετών και γονιδίων-στόχων, τόσο της TGFβ όσο και της BMP σηματοδότησης, αυξήθηκαν στην περιοχή του τραύματος τις πρώτες ημέρες μετά την κάκωση. Με τη βοήθεια διπλά διαγονιδιακών μυών αναφοράς δείχθηκε ότι η ενεργοποίηση και των δύο σηματοδοτικών κλάδων αφορούσε κυρίως στα δραστικά αστροκύτταρα που οριοθετούσαν την περιοχή μεταξύ υγιούς και τραυματισμένου ιστού. Για την έμμεση διαλεύκανση του ρόλου της ενεργοποίησης της TGFβ- ή/και BMP-επαγόμενης σηματοδότησης στα κύτταρα της γλοίας που συναθροίζονται στο τραύμα, αναπτύχθηκαν συστήματα απομόνωσης και καλλιέργειας πρωτογενούς γλοίας, καθώς και πρωτόκολλα διαχωρισμού αυτών μέσω κυτταρομετρίας ροής για τη λήψη αμιγών αστροκυτταρικών και μικρογλοιακών πληθυσμών. Τα αμιγή κύτταρα διεγέρθηκαν παρουσία ανασυνδυασμένων TGFβ1 και ΒΜΡ4 και το μεταγράφωμά τους αναλύθηκε με τη μέθοδο της αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA-Seq). Τα αστροκύτταρα αποκρίθηκαν σημαντικά και στους δύο προσδέτες και μάλιστα παρουσίασαν ιδιαίτερα επικαλυπτόμενα μεταγραφικά προφίλ. Εντούτοις, η μικρογλοία ενώ αντέδρασε εξαιρετικά καλά στον TGFβ1, αποκρίθηκε πολύ ασθενώς παρουσία ΒΜΡ4, γεγονός που πιθανότατα σχετίζεται με τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης ΒΜΡ-σχετιζόμενων υποδοχέων και Smads συγκριτικά με τα αστροκύτταρα. H βιοπληροφορική ανάλυση του μεταγραφώματος των διεγερμένων με TGFβ1 και ΒΜΡ4 αστροκυττάρων ανέδειξε ένα σύνολο κυτταρικών διεργασιών που διέπουν την ιστική επιδιόρθωση και την αποκατάσταση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού έπειτα από τραυματισμό, όπως η βιοσύνθεση και μεταφορά χοληστερόλης, η έκφραση παραγόντων καθοδήγησης νευραξόνων, η παραγωγή συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας και η ρύθμιση της ομοιόστασης του γλουταμινικού οξέος. Επιπλέον, υπό την επίδραση και των δύο προσδετών στα αστροκύτταρα και παρουσία του TGFβ1 στη μικρογλοία, ο φαινότυπος της δραστικής γλοίας μετατοπίστηκε προς τους αντιφλεγμονώδεις και σχετιζόμενους με την ιστική επιδιόρθωση αστροκυτταρικό τύπου Α2 και μικρογλοιακούς τύπου Μ0/Μ2 φαινοτύπους, αντίστοιχα. Η αυξημένη έκφραση αφ’ ενός χαρακτηριστικών παραγόντων που συμμετέχουν στις παραπάνω in vitro ρυθμιζόμενες βιολογικές διεργασίες, και αφ’ ετέρου ειδικών μεταγράφων για τα αστροκύτταρα τύπου Α2, επιβεβαιώθηκε in vivo στην περιοχή του τραύματος, έπειτα από εστιακή κρανιοεγκεφαλική κάκωση, υποδεικνύοντας ότι οι διαδικασίες αυτές ρυθμίζονται πιθανότατα in situ από τη συνεργιστική δράση της TGFβ ή/και της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης. Εκτός του μηχανικού διεισδυτικού τραυματισμού, εφαρμόστηκε κι ένα μοντέλο βιοχημικού τραυματισμού του εγκεφάλου, μέσω χορήγησης της μιτοχονδριακής νευροτοξίνης MPTP για την προσομοίωση παρκινσονικών συμπτωμάτων σε ενήλικους μύες. Παρατηρήθηκε σημαντική ενεργοποίηση του συστήματος της υπεροικογένειας του TGFβ κατά μήκος της μελαινοραβδωτής οδού στα πειραματόζωα όπου χορηγήθηκε ΜΡΤΡ. Και σε αυτό το μοντέλο εγκεφαλικού τραυματισμού, οι κυτταρικοί αποδέκτες της TGFβ και της BMP σηματοδότησης στο ραβδωτό σώμα και τη μέλαινα ουσία ήταν στην πλειοψηφία τους αστροκύτταρα. Στη συνέχεια, διεξήχθη στερεοτακτική υπερέκφραση ενεργοποιητών ή αναστολέων της BMP σηματοδότησης στη μέλαινα ουσία των πειραματοζώων, πριν από τη χορήγηση MPTP, και μελετήθηκε η κινητική τους δραστηριότητα. Παρατηρήθηκε σχετική βελτίωση ορισμένων συμπεριφορικών παραμέτρων στα ζώα όπου υπερεκφράστηκε η Noggin, υποδεικνύοντας ότι αναστολή της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης στη μέλαινα ουσία παρέχει πιθανότατα νευροπροστατευτική δράση στην ομόπλευρη μελαινοραβδωτή οδό. Συνοψίζοντας, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο σύστημα μελέτης τον εγκέφαλο του μυός, αποκωδικοποιήθηκαν σημαντικές πτυχές της αλληλεπίδρασης μεταξύ των TGFβ και BMP κλάδων του συστήματος σηματοδότησης της υπεροικογένειας του TGFβ και τονίστηκε η σημασία του σχετικού ισοζυγίου των κυτταροκινών της υπεροικογένειας για τη ρύθμιση της ομοιόστασης και την εξέλιξη της παθολογίας στο ΚΝΣ. Ακόμη, αναδείχθηκαν βασικές νευροπροστατευτικές ή/και νευροτοξικές διεργασίες υπό παθοφυσιολογικές συνθήκες, καθώς και συγκεκριμένα μοριακά γεγονότα/μηχανισμοί, που αφορούν στα κύτταρα της γλοίας και μπορούν να αξιοποιηθούν μελλοντικά στην ανάπτυξη αποτελεσματικότερων θεραπευτικών προσεγγίσεων στο πλαίσιο νευροφλεγμονωδών διαταραχών ή/και τραυματικών κακώσεων του ΚΝΣ

Transcriptomic analysis reveals shared deregulated neutrophil responses in COVID-19 and idiopathic pulmonary fibrosis

Abstract Background Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a respiratory disease linked with deregulated immune responses, leading to hyperinflammation, acute respiratory distress syndrome, and pulmonary fibrosis, often with fatal outcomes. Neutrophils play a central role in COVID-19 pathogenesis, with elevated peripheral blood neutrophil counts correlating with disease severity. Despite extensive research, the molecular processes associated with neutrophil hyperactivation in COVID-19 remain elusive. Methods To investigate the molecular signatures underlying neutrophil-driven pathology, we conducted transcriptome analysis in neutrophils isolated from the peripheral blood of COVID-19 patients versus healthy individuals. To evaluate the specificity of identified neutrophil signatures in COVID-19, we extended our transcriptomic analysis to neutrophils from patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), a non-infectious fibrotic lung disease. Additionally, immunofluorescence staining was performed on lung biopsy specimens from IPF patients to validate transcriptomic findings at the tissue level. Results Our analysis revealed significant transcriptional changes in COVID-19 neutrophils, particularly in pathways involved in immune regulation, inflammation, and antiviral responses. Additionally, pathways associated with autophagy and chromatin remodeling were upregulated, while translation-related processes were suppressed, indicating an increased predisposition for neutrophil extracellular trap (NET) release. This neutrophil transcriptional signature in COVID-19 appears to be associated with the previously reported deregulation of the Activin/Follistatin system in the periphery. Notably, a comparative transcriptomic analysis with neutrophils isolated from IPF patients revealed the induction of substantially overlapping inflammatory processes, suggesting common deregulated responses in COVID-19 and IPF. Consistently, significant NET formation, a hallmark of COVID-19-related inflammation, was observed within lung biopsies from IPF patients. Conclusion By delineating both shared and disease-specific molecular pathways, our findings validate the critical role of neutrophils in COVID-19 and IPF pathophysiology, highlighting their involvement in balancing the inflammatory response across diverse lung diseases

Activation of both transforming growth factor-β and bone morphogenetic protein signalling pathways upon traumatic brain injury restrains pro-inflammatory and boosts tissue reparatory responses of reactive astrocytes and microglia

AbstractVarious ligands and receptors of the transforming growth factor-β superfamily have been found upregulated following traumatic brain injury; however, the role of this signalling system in brain injury pathophysiology is not fully characterized. To address this, we utilized an acute stab wound brain injury model to demonstrate that hallmarks of transforming growth factor-β superfamily system activation, such as levels of phosphorylated Smads, ligands and target genes for both transforming growth factor-β and bone morphogenetic protein pathways, were upregulated within injured tissues. Using a bone morphogenetic protein-responsive reporter mouse model, we showed that activation of the bone morphogenetic protein signalling pathway involves primarily astrocytes that demarcate the wound area. Insights regarding the potential role of transforming growth factor-β superfamily activation in glia cells within the injured tissues were obtained indirectly by treating purified reactive astrocytes and microglia with bone morphogenetic protein-4 or transforming growth factor-β1 and characterizing changes in their transcriptional profiles. Astrocytes responded to both ligands with considerably overlapping profiles, whereas, microglia responded selectively to transforming growth factor-β1. Novel pathways, crucial for repair of tissue-injury and blood–brain barrier, such as activation of cholesterol biosynthesis and transport, production of axonal guidance and extracellular matrix components were upregulated by transforming growth factor-β1 and/or bone morphogenetic protein-4 in astrocytes. Moreover, both ligands in astrocytes and transforming growth factor-β1 in microglia shifted the phenotype of reactive glia cells towards the anti-inflammatory and tissue reparatory ‘A2’-like and ‘M0/M2’-like phenotypes, respectively. Increased expression of selected key components of the in vitro modulated pathways and markers of ‘A2’-like astrocytes was confirmed within the wound area, suggesting that these processes could also be modulated in situ by the integrated action of transforming growth factor-β and/or bone morphogenetic protein-mediated signalling. Collectively, our study provides a comprehensive comparative analysis of transforming growth factor-β superfamily signalling in reactive astrocytes and microglia and points towards a crucial role of both transforming growth factor-β and bone morphogenetic protein pathways in modulating the inflammatory and brain injury reparatory functions of activated glia cells.</jats:p

Coordinated activation of both TGFβ and BMP canonical pathways regulates autophagy and tissue regeneration in acetaminophen induced liver injury

AbstractTransforming Growth Factor-βs (TGFβs)/Activins and Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) have been implicated in numerous aspects of hepatic pathophysiology. However, the way by which hepatocytes integrate and decode the interplay between the TGFβ/Activin and BMP branches in health and disease is still not fully understood. To address this, TGFβ/BMP Smad- responsive double transgenic reporter mice were generated and utilized to map patterns of TGFβ- and/or BMP-pathway activation during acetaminophen- induced liver injury. TGFβ signaling was blocked either pharmacologically or by Smad7 over-expression and the transcriptomes of canonical TGFβ- and/or BMP4-treated hepatospheres and Smad7-treated livers were analyzed to highlight TGFβ-superfamily-regulated pathways and processes. Acetaminophen administration led to dynamically evolving, stage- and context-specific, patterns of hepatic TGFβ/Activin and BMP-reporter expression. TGFβ-superfamily signaling was activated in an autophagy prone zone at the borders between healthy and injured tissue. Inhibition of TGFβ-superfamily signaling attenuated autophagy, exacerbated liver histopathology, and finally led to accelerated tissue-recovery. Hallmarks of this process were the paraptosis-like cell death and the attenuation of immune and reparatory cell responses. Transcriptomic analysis highlighted autophagy as a prominent TGFβ1- and BMP4-regulated process and recognized Trp53inp2 as the top TGFβ-superfamily-regulated autophagy-related gene. Collectively, these findings implicate the coordinated activation of both canonical TGFβ-superfamily signalling branches in balancing autophagic response and tissue-reparatory and -regenerative processes upon acetaminophen-induced hepatotoxicity, highlighting opportunities and putative risks associated with their targeting for treatment of hepatic diseases.</jats:p

Coordinated activation of TGF-β and BMP pathways promotes autophagy and limits liver injury after acetaminophen intoxication

Ligands of the transforming growth factor–β (TGF-β) superfamily, including TGF-βs, activins, and bone morphogenetic proteins (BMPs), have been implicated in hepatic development, homeostasis, and pathophysiology. We explored the mechanisms by which hepatocytes decode and integrate injury-induced signaling from TGF-βs and activins (TGF-β/Activin) and BMPs. We mapped the spatiotemporal patterns of pathway activation during liver injury induced by acetaminophen (APAP) in dual reporter mice carrying a fluorescent reporter of TGF-β/Activin signaling and a fluorescent reporter of BMP signaling. APAP intoxication induced the expression of both reporters in a zone of cells near areas of tissue damage, which showed an increase in autophagy and demarcated the borders between healthy and injured tissues. Inhibition of TGF-β superfamily signaling by overexpressing the inhibitor Smad7 exacerbated acute liver histopathology but eventually accelerated tissue recovery. Transcriptomic analysis identified autophagy as a process stimulated by TGF-β1 and BMP4 in hepatocytes, with Trp53inp2 , which encodes a rate-limiting factor for autophagy initiation, as the most highly induced autophagy-related gene. Collectively, these findings illustrate the functional interconnectivity of the TGF-β superfamily signaling system, implicate the coordinated activation of TGF-β/Activin and BMP pathways in balancing tissue reparatory and regenerative processes upon APAP-induced hepatotoxicity, and highlight opportunities and potential risks associated with targeting this signaling system for treating hepatic diseases. </jats:p

Activin/Follistatin-axis deregulation is independently associated with COVID-19 in-hospital mortality

AbstractRationaleActivins are inflammatory and tissue-repair-related members of the TGFβ-superfamily that have been implicated in the pathogenesis of several immuno-inflammatory disorders including sepsis/acute respiratory distress syndrome (ARDS). We hypothesized that they might be of particular relevance to COVID-19 pathophysiology.ObjectivesTo assess the involvement of the Activin-Follistatin-axis in COVID-19 pathophysiology.MethodsLevels of Activins -A, -B and their physiological inhibitor Follistatin, were retrospectively analyzed in 314 serum samples from 117 COVID-19 patients derived from two independent centers and compared with common demographic, clinical and laboratory parameters. Optimal-scaling with ridge-regression was used to screen variables and establish a prediction model.Main ResultsThe Activin/Follistatin-axis was significantly deregulated during the course of COVID-19 and was independently associated with severity and in-hospital mortality. FACT-CLINYCoD, a novel disease scoring system, adding one point for each of Follistatin &gt;6235 pg/ml, Activin-A &gt;591 pg/ml, Activin-B &gt;249 pg/ml, CRP &gt;10.3 mg/dL, LDH &gt;427 U/L, Intensive Care Unit (ICU) admission, Neutrophil/Lymphocyte-Ratio &gt;5.6, Years of Age &gt;61, Comorbidities &gt;1 and D-dimers &gt;1097 ng/ml, efficiently predicted and monitored fatal outcome independently of multiplicity and timing of sampling (AUC: 0.951±0.032, p&lt;10-6). Validation in 35 samples derived from a third hospital indicated comparable AUC (0.958±0.086, p=0.032).ConclusionThis study unravels the link between Activin/Folistatin-axis and COVID-19 mortality and introduces FACT-CLINYCoD, a novel pathophysiology-based tool that copes with the dynamic and heterogeneous nature of COCVID-19, predicts disease outcome and supports clinical decision making. Prospective large-scale validation of this calculator, as well as investigation of the mechanisms linking Activin/Folistatin-axis to COVID-19 pathogenesis is warranted.</jats:sec

The Activin/Follistatin Axis Is Severely Deregulated in COVID-19 and Independently Associated With In-Hospital Mortality

Abstract Background Activins are members of the transforming growth factor-β superfamily implicated in the pathogenesis of several immunoinflammatory disorders. Based on our previous studies demonstrating that overexpression of activin-A in murine lung causes pathology sharing key features of coronavirus disease 2019 (COVID-19), we hypothesized that activins and their natural inhibitor follistatin might be particularly relevant to COVID-19 pathophysiology. Methods Activin-A, activin-B, and follistatin were retrospectively analyzed in 574 serum samples from 263 COVID-19 patients hospitalized in 3 independent centers, and compared with demographic, clinical, and laboratory parameters. Optimal scaling with ridge regression was used to screen variables and establish a prediction model. Result The activin/follistatin axis was significantly deregulated during the course of COVID-19, correlated with severity and independently associated with mortality. FACT-CLINYCoD, a scoring system incorporating follistatin, activin-A, activin-B, C-reactive protein, lactate dehydrogenase, intensive care unit admission, neutrophil/lymphocyte ratio, age, comorbidities, and D-dimers, efficiently predicted fatal outcome (area under the curve [AUC], 0.951; 95% confidence interval, .919−.983; P &amp;lt;10−6). Two validation cohorts indicated similar AUC values. Conclusions This study demonstrates a link between activin/follistatin axis and COVID-19 mortality and introduces FACT-CLINYCoD, a novel pathophysiology-based tool that allows dynamic prediction of disease outcome, supporting clinical decision making. </jats:sec