Μελέτη της έκφρασης miRNAs που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση αποπτωτικών γονιδίων της οικογένειας BCL2, στον καρκίνο του μαστού: Αξιολόγηση της διαφοροδιαγνωστικής, προβλεπτικής και προγνωστικής τους αξίας

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πιο συχνά διαγνωσθείσα κακοήθεια και την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον γυναικείο πληθυσμό, αντιπροσωπεύοντας το 25% όλων των νέων περιπτώσεων καρκίνου και το 15% του συνόλου των θανάτων από καρκίνο παγκοσμίως. Εκτιμάται ότι περίπου 1 στις 8 γυναίκες θα αναπτύξει κακοήθη νεοπλασία του μαστικού αδένα κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της νόσου είναι η ενδογενής μοριακή ετερογένεια, η οποία εν μέρει ευθύνεται για τους υφιστάμενους περιορισμούς στην ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών. Η επιλογή του θεραπευτικού σχήματος βασίζεται εξ ολοκλήρου στην ιστοπαθολογική ανάλυση και στο γονιδιακό προφίλ των όγκων. Μάλιστα, η σύνθεση της ανοσοέκφρασης ορισμένων βιοδεικτών συνέβαλε πρόσφατα στην ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού σε διαφορετικούς μοριακούς υποτύπους, οι οποίοι ορίζονται ως Αυλικού τύπου A, Αυλικού τύπου B, HER2-θετικά και Βασικού τύπου/TNBCs. Ο κάθε μοριακός υπότυπος των καρκινωμάτων του μαστού σχετίζεται με συγκεκριμένα μονοπάτια καρκινογένεσης, εκδηλώνοντας διαφοροποιήσεις στη βιολογική συμπεριφορά, στη μεταστατική δυναμική των κυττάρων του και κατ’ επέκτασιν, στην ανταπόκριση των ασθενών έναντι των χορηγούμενων θεραπευτικών σχημάτων. Ως εκ τούτου, η μοριακή και ιστολογική ταξινόμηση των όγκων θεωρούνται ότι είναι καθοριστικής σημασίας για τον προσδιορισμό της κατάλληλης θεραπευτικής προσέγγισης. Συνεπώς, η ταυτοποίηση νέων βιομορίων είναι αναγκαία και ζωτικής σημασίας για τους ασθενείς με καρκίνο του μαστού. Ιδιαίτερα, όταν η έκφρασή τους θα συσχετίζεται με τους μοριακούς υπότυπους και τις κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές, ή θα έχει ρυθμιστικό ρόλο σε παράγοντες που συμβάλλουν στην ογκογένεση και στα περαιτέρω στάδια της νόσου στο μαστό. Ωστόσο, κατά την τελευταία δεκαετία, η εμφάνιση των miRNAs δημιούργησε νέες ευκαιρίες στο ερευνητικό πεδίο για την θεραπεία του καρκίνου. Μάλιστα, έχει προταθεί ότι τα miRNAs μπορεί να είναι πολύτιμα μόρια ως βιοδείκτες στον καρκίνο του μαστού, δεδομένου ότι το πρότυπο έκφρασής τους φαίνεται να συνδέεται με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά αυτής της νόσου. Επομένως, η αναγνώριση των αποκλίσεων στην έκφραση των miRNAs θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στην πρόγνωση, τη διάγνωση και την παρακολούθηση των κακοηθειών του μαστού. Επιπλέον, τα miRNAs είναι υποψήφια βιομόρια για στοχευμένη μοριακή θεραπεία στον καρκίνο του μαστού και διάφορες προσεγγίσεις για τον χειρισμό της έκφρασής τους βρίσκονται υπό ανάπτυξη. Ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους τα miRNAs επηρεάζουν την ανάπτυξη του όγκου είναι μέσω της ρύθμισης των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην αποπτωτική διαδικασία και καλούνται ως apoptomiRs. Η απορύθμιση του μηχανισμού της απόπτωσης συνιστά ένα μεταβατικό στάδιο, επιτρέποντας στα γενετικά ασταθή κύτταρα να επιβιώσουν και να συσσωρεύσουν περαιτέρω μεταλλάξεις που τελικά οδηγούν σε ογκογένεση. Αρκετά μέλη της οικογένειας BCL2 βρέθηκαν να αποτελούν ρυθμιστικούς στόχους των apoptomiRs. H αυξημένη έκφραση των αντιαποπτωτικών γονιδίων ή αντίστοιχα η μειωμένη έκφραση των προαποπτωτικών γονιδίων της οικογένειας BCL2, συνδέεται με την παθογένεια και την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού, καθώς και με την απόκριση των όγκων στην εκάστοτε θεραπευτική προσέγγιση. Eπιπροσθέτως, αρκετά δεδομένα αναγνωρίζουν τα miRNAs ως ρυθμιστές που στοχεύουν άμεσα ή έμμεσα τα μέλη της οικογένειας BCL2, καθώς και βιομόρια επόμενων σταδίων στον καρκίνο του μαστού. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνάται, για πρώτη φορά, η έκφραση και η κλινική αξία των miR-29b-3p, miR-128-1-5p, miR-331-3p, miR-365a-3p, miR-195-5p και miR-497-5p, τα οποία ρυθμίζουν την έκφραση αποπτωτικών γονιδίων της οικογένειας BCL2, στον καρκίνο του μαστού. Βασικός στόχος της διατριβής ήταν η ανάπτυξη ευαίσθητων μεθοδολογιών ανάλυσης της έκφρασης των υπό μελέτη miRNAs που μετα-μεταγραφικά ρυθμίζουν αποπτωτικά γονίδια της οικογένειας BCL2, καθώς και η αξιολόγηση της διαφοροδιαγνωστικής, προβλεπτικής και προγνωστικής τους σημασίας στον καρκίνο του μαστού. Προς επίτευξη των στόχων αυτών αρχικά πραγματοποιήθηκε η συλλογή του βιολογικού υλικού, σύμφωνα με τις ηθικές αρχές που διέπουν την ιατρική και κλινική έρευνα. Συγκεκριμένα, ένας στατιστικά σημαντικός αριθμός 210 ιστολογικών δειγμάτων προήλθε από 140 ασθενείς με καρκίνο στο μαστό και 70 ασθενείς με καλοήθεις όγκους. Η επεξεργασία του συνόλου των ιστοτεμαχίων περιελάμβανε την ομογενοποίηση, την απομόνωση του ολικού RNA, τον ποιοτικό έλεγχο ως προς την καθαρότητα και την ακεραιότητα του RNA, καθώς και τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του RNA σε κάθε ιστολογικό δείγμα. Στο επόμενο στάδιο, πραγματοποιήθηκε η διαδικασία της πολυαδενυλίωσης του ολικού RNA και ακολούθησε η σύνθεση του cDNA μέσω της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής του συνόλου των διαφορετικών miRNAs. Στην συνέχεια, προσδιορίστηκε η έκφραση των υπό μελέτη miR-29b-3p, miR-128-1-5p, miR-331-3p, miR-365a-3p, miR-195-5p και miR-497-5p, καθώς και του γονιδίου αναφοράς SNORD48, γνωστό και ως RNU48. Για την διαδικασία ανάλυσης της έκφρασης των προαναφερόμενων βιομορίων σχεδιάστηκαν οι ειδικοί εκκινητές, ακολούθησε η ανάπτυξη και βελτιστοποίηση πρωτόκολλου qRT-PCR μεθοδολογίας με τη χρήση της χρωστικής SYBR Green I και τέλος, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασής τους μέσω εφαρμογής της μεθόδου σχετικής ποσοτικοποίησης 2-ΔΔCT . Η παρούσα μελέτη ολοκληρώθηκε με την δημιουργία μίας λεπτομερούς βάσης δεδομένων με πλήρης καταγραφή των κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων των ασθενών και της μετεγχειρητικής τους πορείας, και ακολούθως, με την διεξαγωγή εκτενούς βιοστατιστικής ανάλυσης για την αξιολόγηση της κλινικής αξίας των υπό μελέτη miRNAs. H μελέτη του miR-29b, το οποίο συμβάλλει στη ρύθμιση των αντιαποπτωτικών γονιδίων BCL2, BCLW και MCL1, ανέδειξε ότι η έκφρασή του θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε όλες τις ομάδες όγκων του μαστού, χωρίς να υπάρχουν μεταβολές μεταξύ των καρκινικών και των καλοήθων ιστολογικών δειγμάτων του μαστού. Συνεπώς, η έκφραση του miR-29b δεν εμφανίζει σημαντική διαγνωστική αξία για την διάκριση μεταξύ των κακόηθων και καλόηθων όγκων του μαστού. Όμως, η έκφραση του miR-29b διαφοροποιείται μεταξύ λοβιακών και πορογενών καρκινωμάτων του μαστού, εμφανίζοντας σημαντική μείωση (P=0.010) στα πορογενή. Επίσης, ένα ακόμα εύρημα προέκυψε από τη συσχέτιση της έκφρασης του miR-29b με την σταδιοποίηση του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου (P=0.035). Τα επίπεδα έκφρασης του miR-29b σταδιακά μειώθηκαν καθώς μεγάλωνε το στάδιο Τ, επιδεικνύοντας παράλληλα την τάση να συσχετίζεται αρνητικά με το μέγεθος του όγκου. Επίσης, η συσχέτιση της έκφρασης του miR-29b με την έκφραση των ΕR στα υπό ανάλυση δείγματα, αποκάλυψαν σημαντική υπερέκφραση του miR-29b σε εκείνα που είχαν χαρακτηριστεί ως ER-θετικά (P=0.021). Επιπρόσθετα, η υπερέκφραση του miR-29b συσχετίστηκε σημαντικά με μεγαλύτερο χρονικό διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) (P=0.010) στην ανάλυση Kaplan-Meier και με τον μικρότερο κίνδυνο υποτροπής στην μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox (HR= 0.35, 95% CI: 0.15 – 0.81; P=0.014). Συνεκτιμώντας τα ανωτέρω ευρήματα, τα επίπεδα έκφρασης του miR-29b αποτελούν ένα πολλά υποσχόμενο βιολογικό δείκτη ευνοϊκής πρόγνωσης για τους ασθενείς με διηθητικό πορογενές καρκίνωμα του μαστού και υποδηλώνουν ότι η έκφρασή του μπορεί να επηρεαστεί από την ιστολογική προέλευση της κακοήθειας του μαστού. Το miR-128 αποτελεί ένα μετα-μεταγραφικό ρυθμιστή του προαποπτωτικού γονιδίου ΒΑΧ. Σύμφωνα με τα δεδομένα μας, η έκφραση του miR-128 ήταν πιο αυξημένη στα καρκινικά δείγματα συγκριτικά με εκείνη που παρατηρήθηκε στα καλοήθη (P=0.004). Μάλιστα, η διαγνωστική αξία των επιπέδων έκφρασης του miR-128 για τη διάκριση των κακοηθών από τους καλοήθεις όγκους του μαστού, επιβεβαιώθηκε με την ανάλυση της καμπύλης ROC (AUC=0.642; 95%CI=0.552-0.732; P=0.004). Επίσης, δεδομένου του μεγαλύτερου χρόνου επιβίωσης [DFS (P=0.010) και OS (P=0.006)] καθώς και του μικρότερου κινδύνου υποτροπής [DFS-μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox (HR= 0.43, 95% CI: 0.218 – 0.833; P=0.013), DFS-πολυμεταβλητή (HR=0.39, 95% CI: 0.180 – 0.861; P=0.020)] ή μικρότερου κινδύνου κατάληξης από την νόσο (HR= 0.36, 95% CI: 0.164 – 0.769; P = 0.009) των ασθενών που εκφράζουν αυτό το μόριο, μπορεί να θεωρηθεί ως υποσχόμενος ανεξάρτητος ευμενής προγνωστικός δείκτης στον καρκίνο του μαστού. Ένα άλλο miRNA που σχετίζεται με τη ρύθμιση του προαποπτωτικού γονιδίου ΒΑΧ και η έκφρασή του στον καρκίνο του μαστού μελετήθηκε για πρώτη φορά στην παρούσα εργασία, είναι το miR-331. Σύμφωνα με την στατιστική αξιολόγηση των δεδομένων μας, το miR-331 αυξάνεται στα καρκινικά δείγματα συγκριτικά με τα καλοήθη. Επίσης, η ανάλυση της καμπύλης ROC έδειξε ότι τα επίπεδα του miR-331 είχαν τη δυνατότητα διάκρισης μεταξύ των δειγμάτων του μαστού με κακοήθη και καλοήθη φαινότυπο (AUC:0.597±0.044, 95% CI 0.511–0.683, P=0.026). H έκφραση του miR-331 συσχετίζεται μόνο με τον ιστολογικό υπότυπο, αποκαλύπτοντας τη σημαντική μείωση της ρύθμισής του στα λοβιακά καρκινώματα (P=0.026). Λόγω έλλειψης οποιασδήποτε άλλης συσχέτισης, το miR-331 δεν παρουσιάζει προγνωστική αξία για τον καρκίνο του μαστού. Η ανάλυση της έκφρασης του miR-365, το οποίο στοχεύει το αντιαποπτωτικό γονίδιο BCL2, παρουσίασε σημαντική μείωση των επιπέδων του στους καλοήθεις όγκους (P<0.001). Eπιπροσθέτως, η ανάλυσή μας με την καμπύλη ROC πρόσθεσε και τη διαγνωστική αξία στην προαναφερθείσα παρατήρηση, υποδεικνύοντας ότι τα επίπεδα του miR-365 είχαν ισχύ για την διάκριση των καρκινικών από τις καλοήθεις εξεργασίες του μαστού (AUC: 0.704, 95% CI 0.629–0.779, P<0.001). Σχετικά με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους, στα πορογενή (P=0.003) και στα τριπλά αρνητικά καρκινώματα (TNBC) (P<0.001) παρατηρήθηκε χαμηλότερη έκφραση του miR-365 συγκριτικά με τα λοβιακά καρκινώματα και τους άλλους μοριακούς υπότυπους. Επίσης, η έκφραση του miR-365 ήταν σημαντικά αυξημένη στα ιστολογικά δείγματα με θετική ανοσοέκφραση των ορμονικών υποδοχέων ER (P<0.001) και PR (P=0.007), υποδηλώνοντας την πιθανή συμβολή του ως ένδειξη καλής προγνώσεως για τους ασθενείς. Ωστόσο, η έλλειψη σημαντικής συσχέτισης των επιπέδων του miR-365 με το DFS και OS δεν ενίσχυσε περισσότερο την κλινική αξία του στον καρκίνο του μαστού. Τέλος, για πρώτη φορά, διερευνήθηκε η έκφραση του συμπλέγματος miR-195/497, όπου και τα δύο miRNAs θεωρούνται άμεσοι ρυθμιστές του γονιδίου BCL2, σε κακοήθη και καλοήθη δείγματα του μαστού. Σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του συμπλέγματος miR-195/497 παρατηρήθηκαν στους καρκινικούς ιστούς συγκριτικά με τους καλοήθεις (miR-195: P=0.015, miR-497: P<0.001). Επιπροσθέτως, επιβεβαιώθηκε και η διαφοροδιαγνωστική αξία τους για τους ασθενείς με όγκους στον μαστό. Συγκεκριμένα, τα επίπεδα miR-195/497 έδειξαν την ικανότητα να διακρίνουν με ακρίβεια τους κακοήθης από τα καλοήθης ιστούς, βάσει της ανάλυσης ROC [(miR-195: AUC:0.605, 95% CI 0.525–0.685, P=0.015), (miR-497: AUC:0.848, 95%CI=0.792-0.905, P<0.001)]. Όσον αφορά τους ιστολογικούς και μοριακούς υπότυπους του μαστού, μόνο το miR-195 ανέδειξε σημαντική συσχέτιση (P<0.001), καταγράφοντας την μικρότερη έκφραση στα πορογενή και στα TNBC καρκινώματα. Επίσης, τα αυξημένα επίπεδα του miR-195 συσχετίζονται με την ομάδα των καρκινικών δειγμάτων που είχαν θετική έκφραση των ER (P=0.002). Στην περίπτωση του miR-497, στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της έκφρασης του miR-497 και του ιστολογικού βαθμού διαφοροποίησης (Grade I-III) (P=0.031), της σταδιοποίησης του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου (P=0.013), καθώς και της έκφρασης του μιτωτικού δείκτη Ki67 (P=0.026). Η προγνωστική αξία του miR-497 ενισχύθηκε από τις αναλύσεις επιβίωσης, όπου οι ασθενείς με μειωμένη έκφραση του miR-497 εμφάνισαν μικρότερο χρονικό διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) (P=0.028) στην ανάλυση Kaplan-Meier και με τον διπλάσιο κίνδυνο υποτροπής στην μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox (HR= 2.282, 95% CI:1.069 – 4.869; P=0.033). Συνοψίζοντας, στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε η συλλογή 210 ιστοτεμαχίων από κακοήθεις και καλοήθεις όγκους μαστού. Τα ιστολογικά δείγματα επεξεργάστηκαν μέσω ανάπτυξης μεθοδολογιών για τον προσδιορισμό των υπό μελέτη miRNAs που ρυθμίζουν αποπτωτικά γονίδια της οικογένειας BCL2. Έπειτα, τα επίπεδα έκφρασης των εξετασθέντων βιομορίων συσχετίστηκαν με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους των ασθενών και τη μετεγχειρητική τους πορεία μέσω εκτενούς βιοστατιστικής ανάλυσης. Τα ευρήματα μας ανέδειξαν την ισχυρή κλινική αξία στα περισσότερα υπό μελέτη miRNAs, για την διαφορική διάγνωση και την πρόγνωση στον καρκίνο του μαστού. Αξίζει να αναφερθεί ότι η συγκριτική μελέτη των ευρημάτων μεταξύ των miRNAs (miR-29b, miR-365 και miR-195) που ρυθμίζουν αντιαποπτωτικά γονίδια, αποκάλυψε ότι η υπερέκφρασή τους συσχετίζεται με τα λοβιακά αδενοκαρκινώματα. Η παρατήρηση αυτή έχει ιδιαίτερη κλινική και ερευνητική αξία, καθώς θα μπορούσε ενδεχομένως να δημιουργήσει ως υπόθεση ότι θα πρέπει να εξεταστεί η επίδραση της ιστολογικής προέλευσης της κακοήθειας του μαστού στην έκφραση των miRNAs που στοχεύουν αντιαποπτωτικά γονίδια και κυρίως το BCL2. Eπιπλέον, η συσχέτιση της έκφρασης των miR-365 και miR-195 με τους μοριακούς υπότυπους, ίσως προσφέρει επιπρόσθετη πληροφορία για την θεραπευτική προσέγγιση των ΤΝBC αδενοκαρκινωμάτων, των οποίων οι ασθενείς στερούνται των επιλογών της ορμονοθεραπείας και της στοχευμένης θεραπείας.Breast cancer remains the most frequently diagnosed malignancy and the leading cause of cancer death in the female population, accounting for 25% of all new cancer cases and 15% of all cancer deaths, worldwide. It has been estimated that, approximately, 1 in 8 women will develop malignant neoplasia of the mammary gland in their lifetime. One of the main features of disease is the intrinsic molecular heterogeneity, is partially responsible for the existing limitations in the development of therapeutic strategies. The choice of treatment regimen is entirely based on the histopathological analysis and the gene expression profiling of tumors. Indeed, the synthesis of the immunoexpression of certain biomarkers recently contributed to breast cancer classification at different molecular subtypes defined as luminal A, luminal B, HER2-overexpression, and basal-like/TNBCs. Each molecular subtype of mammary carcinomas is associated with specific carcinogenic pathways, exhibiting variations in biological behavior, metastatic cell dynamics, and by extension, in patient response to administered regimens. Hence, the molecular and histological classification of tumors has been claimed to be crucial for the determination of an appropriate therapeutic approach. Therefore, the identification of new biomolecules is necessary and vital for breast cancer patients. Particularly, when their expression will be correlated with molecular subtypes and clinicopathological variables, or will play a regulatory role in factors that contribute to tumorigenesis and further stages of breast disease. However, in the past decade, the emergence of miRNAs has occasioned new opportunities in cancer investigation and treatment. Interestingly, it has been suggested that miRNAs might be valuable as breast cancer biomarkers because their expression pattern seems to be associated with the clinicopathological features of this disease. Hence, identifying aberrations in miRNA expression might lead to significant improvement in prognosis, diagnosis, and the monitoring of breast malignancies. Moreover, miRNAs are candidate biomolecules for targeted molecular therapy in breast cancer and various approaches to manipulating their expression are under development. One of the mechanisms by which miRNAs affect tumor growth is by regulating the proteins that are involved in the apoptotic process, and named as apoptomiRs. The deregulation of the apoptotic mechanism constitutes a transient stage, allowing genetically unstable cells to survive and accumulate further mutations that eventually lead to tumorigenesis. Several members of the BCL2 family were found to be regulatory targets of apoptomiRs. Elevated expression of anti-apoptotic genes or, respectively, reduced expression of pre-apoptotic genes of the BCL2 family is associated with the pathogenesis and progression of breast cancer, as well as, with the response of tumors to the respective therapeutic approach. Furthermore, a plethora of data recognizes miRNAs as regulators that directly or indirectly target BCL2 family members, as well as downstream targets in breast cancer. In the present Ph.D. Thesis, the expression and the clinical value of miR-29b-3p, miR-128-1-5p, miR-331-3p, miR-365a-3p, miR-195-5p and miR-497-5p, was investigated for the first time. These micromolecules regulate the expression of apoptotic genes of the BCL2 family, in breast cancer. The main objectives of the Ph.D. Thesis were the development of sensitive methodologies for the expression analysis of the examined miRNAs that post-transcriptionally regulate apoptotic genes of BCL2 family, as well as the evaluation of their differential diagnosis, predictive and prognostic significance in breast cancer. In order to accomplish these objectives, the collection of biological material was initially carried out in accordance with the ethical principles governing medical and clinical research. Specifically, a statistically significant number of 210 histological samples originated from 140 malignant and 70 benign breast tumors. Tissue processing included homogenization, isolation of total RNA, quality control of the purity and integrity of RNA, and determination of RNA concentration in each histological specimen. Thereafter, the polyadenylation of total RNA was carried out, followed by the reverse transcription reaction, resulting in cDNA of all different miRNAs. Subsequently, the expression of miR-29b-3p, miR-128-1-5p, miR-331-3p, miR-365a-3p, miR-195-5p and miR-497-5p, as well as the SNORD48 reference gene that is also known as RNU48, was analyzed. Specific primers were designed for the expression analysis of the aforementioned biomolecules, followed by the development and optimization of the qRT-PCR protocol using the SYBR Green I dye and finally, their expression levels were determined by applying the 2-ΔCTT relative quantification method. The present study was completed by the creation of a detailed database with a complete record of patients' clinicopathological parameters and their postoperative course, and afterwards, by conducting extensive biostatistical analysis in order to assess the clinical value of the tested miRNAs. The study of miR-29b, which contributes to the regulation of the anti-apoptotic genes BCL2, BCLW and MCL1, revealed that its expression could be detected in all breast tumor groups without any changes between the cancerous and benign breast tissue specimens. Consequently, the expression of miR-29b has no significant diagnostic value for the distinction between malignant and benign breast tumors. However, the expression of miR-29b differentiated between lobular and ductal breast carcinomas, showing a significant decrease (P=0.010) in the ductal. One more finding was obtained by correlating the expression of miR-29b with staging of the primary tumor size (P=0.035). The miR-29b expression levels gradually declined as T staging progressed, demonstrating in parallel the propensity to negatively correlate with tumor size. Moreover, the correlation of miR-29b expression with the ER status of the analyzed samples, revealing significant overexpression of miR-29b in the ER-positive ones (P=0.021). Furthermore, miR-29b overexpression was correlated with longer DFS (P=0.010) in Kaplan-Meier analysis and lower risk of relapse in univariate Cox regression model (HR= 0.35, 95% CI: 0.15 – 0.81; P=0.014). Taking into account the above findings, miR-29b expression levels constitute a promising biomarker of favorable prognosis for patients with invasive ductal breast carcinoma and imply that its expression status might be affected by the histological origin of breast malignancy. miR-128 is a post-transcriptional regulator of pro-apoptotic BAX gene According to our data, the expression of miR-128 was more elevated in cancerous samples compared to those observed in benign ones (P=0.004). Additionally, the ROC analysis confirmed the diagnostic value of the miR-128 expression levels in distinguishing malignant from benign breast tumors (AUC=0.642; 95%CI=0.552-0.732; P=0.004). Ιn view of the fact that miR-128-positive patients are correlated with longer DFS (P=0.010) and OS (P=0.006), as well as, with lower risk of relapse [DFS-univariate Cox regression analysis (HR= 0.43, 95% CI: 0.218 – 0.833; P=0.013), DFS- multivariate (HR=0.39, 95% CI: 0.180 – 0.861; P=0.020)] or death due to the disease(HR= 0.36, 95% CI: 0.164 – 0.769; P = 0.009), the expression of miR-128 could be considered as a promising independent favorable prognostic marker in breast cancer. One of the miRNAs associated with the regulation of the pro-apoptotic ΒΑΧ and its expression status in breast cancer was firstly studied herein, is miR-331. According to the statistical evaluation of our data, it was revealed that miR-331 was significantly upregulated (P=0.026) in malignant specimens in comparison to their benign counterparts. In addition, ROC curve analysis showed that miR-331 levels had the potential to discriminate between samples of malignant and benign phenotype (AUC:0.597±0.044, 95% CI 0.511–0.683, P=0.026). Τhe expression of miR-331 was correlated only with the histological subtype, uncovering its significantly downregulation in lobular carcinomas (P=0.026). By virtue of the lack of any other correlation, miR-331 demonstrates no prognostic value for breast cancer. Τhe expression analysis of miR-365, which target the anti-apoptotic BCL2, revealed the significantly decreased levels of miR-365 in beni

Expression study of miRNAs that regulate the gene expression of apoptotic genes of BCL2 family, in breast cancer: evaluation of their differential diagnostic, predictive and prognostic value

Breast cancer remains the most frequently diagnosed malignancy and the leading cause of cancer death in the female population, accounting for 25% of all new cancer cases and 15% of all cancer deaths, worldwide. It has been estimated that, approximately, 1 in 8 women will develop malignant neoplasia of the mammary gland in their lifetime. One of the main features of disease is the intrinsic molecular heterogeneity, is partially responsible for the existing limitations in the development of therapeutic strategies. The choice of treatment regimen is entirely based on the histopathological analysis and the gene expression profiling of tumors. Indeed, the synthesis of the immunoexpression of certain biomarkers recently contributed to breast cancer classification at different molecular subtypes defined as luminal A, luminal B, HER2-overexpression, and basal-like/TNBCs. Each molecular subtype of mammary carcinomas is associated with specific carcinogenic pathways, exhibiting variations in biological behavior, metastatic cell dynamics, and by extension, in patient response to administered regimens. Hence, the molecular and histological classification of tumors has been claimed to be crucial for the determination of an appropriate therapeutic approach. Therefore, the identification of new biomolecules is necessary and vital for breast cancer patients. Particularly, when their expression will be correlated with molecular subtypes and clinicopathological variables, or will play a regulatory role in factors that contribute to tumorigenesis and further stages of breast disease.However, in the past decade, the emergence of miRNAs has occasioned new opportunities in cancer investigation and treatment. Interestingly, it has been suggested that miRNAs might be valuable as breast cancer biomarkers because their expression pattern seems to be associated with the clinicopathological features of this disease. Hence, identifying aberrations in miRNA expression might lead to significant improvement in prognosis, diagnosis, and the monitoring of breast malignancies. Moreover, miRNAs are candidate biomolecules for targeted molecular therapy in breast cancer and various approaches to manipulating their expression are under development.One of the mechanisms by which miRNAs affect tumor growth is by regulating the proteins that are involved in the apoptotic process, and named as apoptomiRs. The deregulation of the apoptotic mechanism constitutes a transient stage, allowing genetically unstable cells to survive and accumulate further mutations that eventually lead to tumorigenesis. Several members of the BCL2 family were found to be regulatory targets of apoptomiRs. Elevated expression of anti-apoptotic genes or, respectively, reduced expression of pre-apoptotic genes of the BCL2 family is associated with the pathogenesis and progression of breast cancer, as well as, with the response of tumors to the respective therapeutic approach. Furthermore, a plethora of data recognizes miRNAs as regulators that directly or indirectly target BCL2 family members, as well as downstream targets in breast cancer. In the present Ph.D. Thesis, the expression and the clinical value of miR-29b-3p, miR-128-1-5p, miR-331-3p, miR-365a-3p, miR-195-5p and miR-497-5p, was investigated for the first time. These micromolecules regulate the expression of apoptotic genes of the BCL2 family, in breast cancer. The main objectives of the Ph.D. Thesis were the development of sensitive methodologies for the expression analysis of the examined miRNAs that post-transcriptionally regulate apoptotic genes of BCL2 family, as well as the evaluation of their differential diagnosis, predictive and prognostic significance in breast cancer.In order to accomplish these objectives, the collection of biological material was initially carried out in accordance with the ethical principles governing medical and clinical research. Specifically, a statistically significant number of 210 histological samples originated from 140 malignant and 70 benign breast tumors. Tissue processing included homogenization, isolation of total RNA, quality control of the purity and integrity of RNA, and determination of RNA concentration in each histological specimen. Thereafter, the polyadenylation of total RNA was carried out, followed by the reverse transcription reaction, resulting in cDNA of all different miRNAs. Subsequently, the expression of miR-29b-3p, miR-128-1-5p, miR-331-3p, miR-365a-3p, miR-195-5p and miR-497-5p, as well as the SNORD48 reference gene that is also known as RNU48, was analyzed. Specific primers were designed for the expression analysis of the aforementioned biomolecules, followed by the development and optimization of the qRT-PCR protocol using the SYBR Green I dye and finally, their expression levels were determined by applying the 2-ΔCTT relative quantification method. The present study was completed by the creation of a detailed database with a complete record of patients' clinicopathological parameters and their postoperative course, and afterwards, by conducting extensive biostatistical analysis in order to assess the clinical value of the tested miRNAs.The study of miR-29b, which contributes to the regulation of the anti-apoptotic genes BCL2, BCLW and MCL1, revealed that its expression could be detected in all breast tumor groups without any changes between the cancerous and benign breast tissue specimens. Consequently, the expression of miR-29b has no significant diagnostic value for the distinction between malignant and benign breast tumors. However, the expression of miR-29b differentiated between lobular and ductal breast carcinomas, showing a significant decrease (P=0.010) in the ductal. One more finding was obtained by correlating the expression of miR-29b with staging of the primary tumor size (P=0.035). The miR-29b expression levels gradually declined as T staging progressed, demonstrating in parallel the propensity to negatively correlate with tumor size. Moreover, the correlation of miR-29b expression with the ER status of the analyzed samples, revealing significant overexpression of miR-29b in the ER-positive ones (P=0.021). Furthermore, miR-29b overexpression was correlated with longer DFS (P=0.010) in Kaplan-Meier analysis and lower risk of relapse in univariate Cox regression model (HR= 0.35, 95% CI: 0.15 – 0.81; P=0.014). Taking into account the above findings, miR-29b expression levels constitute a promising biomarker of favorable prognosis for patients with invasive ductal breast carcinoma and imply that its expression status might be affected by the histological origin of breast malignancy.miR-128 is a post-transcriptional regulator of pro-apoptotic BAX gene According to our data, the expression of miR-128 was more elevated in cancerous samples compared to those observed in benign ones (P=0.004). Additionally, the ROC analysis confirmed the diagnostic value of the miR-128 expression levels in distinguishing malignant from benign breast tumors (AUC=0.642; 95%CI=0.552-0.732; P=0.004). Ιn view of the fact that miR-128-positive patients are correlated with longer DFS (P=0.010) and OS (P=0.006), as well as, with lower risk of relapse [DFS-univariate Cox regression analysis (HR= 0.43, 95% CI: 0.218 – 0.833; P=0.013), DFS- multivariate (HR=0.39, 95% CI: 0.180 – 0.861; P=0.020)] or death due to the disease(HR= 0.36, 95% CI: 0.164 – 0.769; P = 0.009), the expression of miR-128 could be considered as a promising independent favorable prognostic marker in breast cancer.One of the miRNAs associated with the regulation of the pro-apoptotic ΒΑΧ and its expression status in breast cancer was firstly studied herein, is miR-331. According to the statistical evaluation of our data, it was revealed that miR-331 was significantly upregulated (P=0.026) in malignant specimens in comparison to their benign counterparts. In addition, ROC curve analysis showed that miR-331 levels had the potential to discriminate between samples of malignant and benign phenotype (AUC:0.597±0.044, 95% CI 0.511–0.683, P=0.026). Τhe expression of miR-331 was correlated only with the histological subtype, uncovering its significantly downregulation in lobular carcinomas (P=0.026). By virtue of the lack of any other correlation, miR-331 demonstrates no prognostic value for breast cancer.Τhe expression analysis of miR-365, which target the anti-apoptotic BCL2, revealed the significantly decreased levels of miR-365 in benign tumors (P<0.001). Moreover, our ROC curve analysis added diagnostic value to the above observation indicating that miR-365 levels had discriminatory power in distinguishing cancerous from benign breast lesions (AUC: 0.704, 95% CI 0.629–0.779, P<0.001). Regarding the clinicopathological parameters, a statistically significant lower expression of the miR‐365 was observed in the ductal (P=0.003) and the triple negative (TNBC) (P<0.001) by comparison with lobular carcinomas and the other molecular subtypes. Furthermore, miR‐365 levels were positively correlated with ER (P<0.001) and PR (P<0.007) staining, suggesting its possible contribution as an indication of good prognosis for patients. However, the lack of significant correlation of miR-365 levels with DFS and OS did not further enhance its clinical value in breast cancer.Finally, for first time, the expression of the miR-195/497 cluster, both miRNAs are considered to be direct regulators of the BCL2 gene, was investigated in malignant and benign breast samples. Significantly lower expression levels of miR-195/497 cluster were observed in cancerous compared to benign specimens (miR-195: P=0.015, miR-497: P<0.001). Additionally, their differential diagnostic value was confirmed for patients with breast tumors. Specifically, miR‐195/497 levels showed the ability to accurately discriminate between malignant and benign specimens, based on ROC curve analysis [(miR-195: AUC:0.605, 95% CI 0.525–0.685, P=0.015), (miR-497: AUC:0.848, 95%CI=0.792-0.905, P<0.001)]. Αs regards the histological and molecular subtypes of the breast, only miR-195 revealed significant correlation (P<0.001), detecting the lower expression in both ductal and TNBC carcinomas. Moreover, increased levels of miR-195 were correlated with the group of ER-positive cancer samples (P=0.002). In the case of miR-497, statistically significant negative correlation was observed between the expression of miR-497 and the histological degree of differentiation (Grade I-III) (P=0.031), the staging of the primary tumor size (P=0.013) as well as, the expression of mitotic index Ki67 (P=0.026). The prognostic value of miR-497 was enhanced by survival analyses, indicating that decreased miR-497 levels significantly associated with sorter DFS of breast cancer patients (P=0.028) in Kaplan-Meier analysis and with a twofold risk of relapse in univariate Cox regression analysis (HR= 2.282, 95% CI:1.069 – 4.869; P=0.033).Ιn conclusion, in the present Ph.D. Thesis, 210 tissue specimens from malignant and benign breast tumors were collected. Samples were processed by developing methodologies to determine the tested miRNAs that regulate apoptotic genes of BCL2 family. Thereafter, the expression levels of the examined biomolecules were correlated with the clinicopathological features and post-operative status of patients, by comprehensive statistical analysis. Οur findings revealed the significant clinical value in the majority of examined miRNAs for the differential diagnosis and prognosis in breast cancer. Interestingly, the comparative study of findings among miRNAs (miR-29b, miR-365 and miR-195) regulating anti-apoptotic genes revealed that their overexpression was correlated with lobular adenocarcinomas. This observation seems to be of special clinical and investigational value, as it might possibly generate a hypothesis that needs to be tested regarding the effect of the histological origin of breast malignancy on the miRNAs that target anti-apoptotic genes and specifically BCL2. Furthermore, the association of miR-365 and miR-195 expression levels with molecular subtypes of breast cancer, might provide additional information on the therapeutic approach of TNBC adenocarcinomas, whose patients lack the options of targeted and hormone therapy.Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πιο συχνά διαγνωσθείσα κακοήθεια και την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον γυναικείο πληθυσμό, αντιπροσωπεύοντας το 25% όλων των νέων περιπτώσεων καρκίνου και το 15% του συνόλου των θανάτων από καρκίνο παγκοσμίως. Εκτιμάται ότι περίπου 1 στις 8 γυναίκες θα αναπτύξει κακοήθη νεοπλασία του μαστικού αδένα κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της νόσου είναι η ενδογενής μοριακή ετερογένεια, η οποία εν μέρει ευθύνεται για τους υφιστάμενους περιορισμούς στην ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών. Η επιλογή του θεραπευτικού σχήματος βασίζεται εξ ολοκλήρου στην ιστοπαθολογική ανάλυση και στο γονιδιακό προφίλ των όγκων. Μάλιστα, η σύνθεση της ανοσοέκφρασης ορισμένων βιοδεικτών συνέβαλε πρόσφατα στην ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού σε διαφορετικούς μοριακούς υποτύπους, οι οποίοι ορίζονται ως Αυλικού τύπου A, Αυλικού τύπου B, HER2-θετικά και Βασικού τύπου/TNBCs. Ο κάθε μοριακός υπότυπος των καρκινωμάτων του μαστού σχετίζεται με συγκεκριμένα μονοπάτια καρκινογένεσης, εκδηλώνοντας διαφοροποιήσεις στη βιολογική συμπεριφορά, στη μεταστατική δυναμική των κυττάρων του και κατ’ επέκτασιν, στην ανταπόκριση των ασθενών έναντι των χορηγούμενων θεραπευτικών σχημάτων. Ως εκ τούτου, η μοριακή και ιστολογική ταξινόμηση των όγκων θεωρούνται ότι είναι καθοριστικής σημασίας για τον προσδιορισμό της κατάλληλης θεραπευτικής προσέγγισης. Συνεπώς, η ταυτοποίηση νέων βιομορίων είναι αναγκαία και ζωτικής σημασίας για τους ασθενείς με καρκίνο του μαστού. Ιδιαίτερα, όταν η έκφρασή τους θα συσχετίζεται με τους μοριακούς υπότυπους και τις κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές, ή θα έχει ρυθμιστικό ρόλο σε παράγοντες που συμβάλλουν στην ογκογένεση και στα περαιτέρω στάδια της νόσου στο μαστό.Ωστόσο, κατά την τελευταία δεκαετία, η εμφάνιση των miRNAs δημιούργησε νέες ευκαιρίες στο ερευνητικό πεδίο για την θεραπεία του καρκίνου. Μάλιστα, έχει προταθεί ότι τα miRNAs μπορεί να είναι πολύτιμα μόρια ως βιοδείκτες στον καρκίνο του μαστού, δεδομένου ότι το πρότυπο έκφρασής τους φαίνεται να συνδέεται με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά αυτής της νόσου. Επομένως, η αναγνώριση των αποκλίσεων στην έκφραση των miRNAs θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στην πρόγνωση, τη διάγνωση και την παρακολούθηση των κακοηθειών του μαστού. Επιπλέον, τα miRNAs είναι υποψήφια βιομόρια για στοχευμένη μοριακή θεραπεία στον καρκίνο του μαστού και διάφορες προσεγγίσεις για τον χειρισμό της έκφρασής τους βρίσκονται υπό ανάπτυξη. Ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους τα miRNAs επηρεάζουν την ανάπτυξη του όγκου είναι μέσω της ρύθμισης των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην αποπτωτική διαδικασία και καλούνται ως apoptomiRs. Η απορύθμιση του μηχανισμού της απόπτωσης συνιστά ένα μεταβατικό στάδιο, επιτρέποντας στα γενετικά ασταθή κύτταρα να επιβιώσουν και να συσσωρεύσουν περαιτέρω μεταλλάξεις που τελικά οδηγούν σε ογκογένεση. Αρκετά μέλη της οικογένειας BCL2 βρέθηκαν να αποτελούν ρυθμιστικούς στόχους των apoptomiRs. H αυξημένη έκφραση των αντιαποπτωτικών γονιδίων ή αντίστοιχα η μειωμένη έκφραση των προαποπτωτικών γονιδίων της οικογένειας BCL2, συνδέεται με την παθογένεια και την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού, καθώς και με την απόκριση των όγκων στην εκάστοτε θεραπευτική προσέγγιση. Eπιπροσθέτως, αρκετά δεδομένα αναγνωρίζουν τα miRNAs ως ρυθμιστές που στοχεύουν άμεσα ή έμμεσα τα μέλη της οικογένειας BCL2, καθώς και βιομόρια επόμενων σταδίων στον καρκίνο του μαστού. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνάται, για πρώτη φορά, η έκφραση και η κλινική αξία των miR-29b-3p, miR-128-1-5p, miR-331-3p, miR-365a-3p, miR-195-5p και miR-497-5p, τα οποία ρυθμίζουν την έκφραση αποπτωτικών γονιδίων της οικογένειας BCL2, στον καρκίνο του μαστού. Βασικός στόχος της διατριβής ήταν η ανάπτυξη ευαίσθητων μεθοδολογιών ανάλυσης της έκφρασης των υπό μελέτη miRNAs που μετα-μεταγραφικά ρυθμίζουν αποπτωτικά γονίδια της οικογένειας BCL2, καθώς και η αξιολόγηση της διαφοροδιαγνωστικής, προβλεπτικής και προγνωστικής τους σημασίας στον καρκίνο του μαστού. Προς επίτευξη των στόχων αυτών αρχικά πραγματοποιήθηκε η συλλογή του βιολογικού υλικού, σύμφωνα με τις ηθικές αρχές που διέπουν την ιατρική και κλινική έρευνα. Συγκεκριμένα, ένας στατιστικά σημαντικός αριθμός 210 ιστολογικών δειγμάτων προήλθε από 140 ασθενείς με καρκίνο στο μαστό και 70 ασθενείς με καλοήθεις όγκους. Η επεξεργασία του συνόλου των ιστοτεμαχίων περιελάμβανε την ομογενοποίηση, την απομόνωση του ολικού RNA, τον ποιοτικό έλεγχο ως προς την καθαρότητα και την ακεραιότητα του RNA, καθώς και τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του RNA σε κάθε ιστολογικό δείγμα. Στο επόμενο στάδιο, πραγματοποιήθηκε η διαδικασία της πολυαδενυλίωσης του ολικού RNA και ακολούθησε η σύνθεση του cDNA μέσω της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής του συνόλου των διαφορετικών miRNAs. Στην συνέχεια, προσδιορίστηκε η έκφραση των υπό μελέτη miR-29b-3p, miR-128-1-5p, miR-331-3p, miR-365a-3p, miR-195-5p και miR-497-5p, καθώς και του γονιδίου αναφοράς SNORD48, γνωστό και ως RNU48. Για την διαδικασία ανάλυσης της έκφρασης των προαναφερόμενων βιομορίων σχεδιάστηκαν οι ειδικοί εκκινητές, ακολούθησε η ανάπτυξη και βελτιστοποίηση πρωτόκολλου qRT-PCR μεθοδολογίας με τη χρήση της χρωστικής SYBR Green I και τέλος, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασής τους μέσω εφαρμογής της μεθόδου σχετικής ποσοτικοποίησης 2-ΔΔCT . Η παρούσα μελέτη ολοκληρώθηκε με την δημιουργία μίας λεπτομερούς βάσης δεδομένων με πλήρης καταγραφή των κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων των ασθενών και της μετεγχειρητικής τους πορείας, και ακολούθως, με την διεξαγωγή εκτενούς βιοστατιστικής ανάλυσης για την αξιολόγηση της κλινικής αξίας των υπό μελέτη miRNAs.H μελέτη του miR-29b, το οποίο συμβάλλει στη ρύθμιση των αντιαποπτωτικών γονιδίων BCL2, BCLW και MCL1, ανέδειξε ότι η έκφρασή του θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε όλες τις ομάδες όγκων του μαστού, χωρίς να υπάρχουν μεταβολές μεταξύ των καρκινικών και των καλοήθων ιστολογικών δειγμάτων του μαστού. Συνεπώς, η έκφραση του miR-29b δεν εμφανίζει σημαντική διαγνωστική αξία για την διάκριση μεταξύ των κακόηθων και καλόηθων όγκων του μαστού. Όμως, η έκφραση του miR-29b διαφοροποιείται μεταξύ λοβιακών και πορογενών καρκινωμάτων του μαστού, εμφανίζοντας σημαντική μείωση (P=0.010) στα πορογενή. Επίσης, ένα ακόμα εύρημα προέκυψε από τη συσχέτιση της έκφρασης του miR-29b με την σταδιοποίηση του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου (P=0.035). Τα επίπεδα έκφρασης του miR-29b σταδιακά μειώθηκαν καθώς μεγάλωνε το στάδιο Τ, επιδεικνύοντας παράλληλα την τάση να συσχετίζεται αρνητικά με το μέγεθος του όγκου. Επίσης, η συσχέτιση της έκφρασης του miR-29b με την έκφραση των ΕR στα υπό ανάλυση δείγματα, αποκάλυψαν σημαντική υπερέκφραση του miR-29b σε εκείνα που είχαν χαρακτηριστεί ως ER-θετικά (P=0.021). Επιπρόσθετα, η υπερέκφραση του miR-29b συσχετίστηκε σημαντικά με μεγαλύτερο χρονικό διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) (P=0.010) στην ανάλυση Kaplan-Meier και με τον μικρότερο κίνδυνο υποτροπής στην μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox (HR= 0.35, 95% CI: 0.15 – 0.81; P=0.014). Συνεκτιμώντας τα ανωτέρω ευρήματα, τα επίπεδα έκφρασης του miR-29b αποτελούν ένα πολλά υποσχόμενο βιολογικό δείκτη ευνοϊκής πρόγνωσης για τους ασθενείς με διηθητικό πορογενές καρκίνωμα του μαστού και υποδηλώνουν ότι η έκφρασή του μπορεί να επηρεαστεί από την ιστολογική προέλευση της κακοήθειας του μαστού.Το miR-128 αποτελεί ένα μετα-μεταγραφικό ρυθμιστή του προαποπτωτικού γονιδίου ΒΑΧ. Σύμφωνα με τα δεδομένα μας, η έκφραση του miR-128 ήταν πιο αυξημένη στα καρκινικά δείγματα συγκριτικά με εκείνη που παρατηρήθηκε στα καλοήθη (P=0.004). Μάλιστα, η διαγνωστική αξία των επιπέδων έκφρασης του miR-128 για τη διάκριση των κακοηθών από τους καλοήθεις όγκους του μαστού, επιβεβαιώθηκε με την ανάλυση της καμπύλης ROC (AUC=0.642; 95%CI=0.552-0.732; P=0.004). Επίσης, δεδομένου του μεγαλύτερου χρόνου επιβίωσης [DFS (P=0.010) και OS (P=0.006)] καθώς και του μικρότερου κινδύνου υποτροπής [DFS-μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox (HR= 0.43, 95% CI: 0.218 – 0.833; P=0.013), DFS-πολυμεταβλητή (HR=0.39, 95% CI: 0.180 – 0.861; P=0.020)] ή μικρότερου κινδύνου κατάληξης από την νόσο (HR= 0.36, 95% CI: 0.164 – 0.769; P = 0.009) των ασθενών που εκφράζουν αυτό το μόριο, μπορεί να θεωρηθεί ως υποσχόμενος ανεξάρτητος ευμενής προγνωστικός δείκτης στον καρκίνο του μαστού.Ένα άλλο miRNA που σχετίζεται με τη ρύθμιση του προαποπτωτικού γονιδίου ΒΑΧ και η έκφρασή του στον καρκίνο του μαστού μελετήθηκε για πρώτη φορά στην παρούσα εργασία, είναι το miR-331. Σύμφωνα με την στατιστική αξιολόγηση των δεδομένων μας, το miR-331 αυξάνεται στα καρκινικά δείγματα συγκριτικά με τα καλοήθη. Επίσης, η ανάλυση της καμπύλης ROC έδειξε ότι τα επίπεδα του miR-331 είχαν τη δυνατότητα διάκρισης μεταξύ των δειγμάτων του μαστού με κακοήθη και καλοήθη φαινότυπο (AUC:0.597±0.044, 95% CI 0.511–0.683, P=0.026). H έκφραση του miR-331 συσχετίζεται μόνο με τον ιστολογικό υπότυπο, αποκαλύπτοντας τη σημαντική μείωση της ρύθμισής του στα λοβιακά καρκινώματα (P=0.026). Λόγω έλλειψης οποιασδήποτε άλλης συσχέτισης, το miR-331 δεν παρουσιάζει προγνωστική αξία για τον καρκίνο του μαστού.Η ανάλυση της έκφρασης του miR-365, το οποίο στοχεύει το αντιαποπτωτικό γονίδιο BCL2, παρουσίασε σημαντική μείωση των επιπέδων του στους καλοήθεις όγκους (P<0.001). Eπιπροσθέτως, η ανάλυσή μας με την καμπύλη ROC πρόσθεσε και τη διαγνωστική αξία στην προαναφερθείσα παρατήρηση, υποδεικνύοντας ότι τα επίπεδα του miR-365 είχαν ισχύ για την διάκριση των καρκινικών από τις καλοήθεις εξεργασίες του μαστού (AUC: 0.704, 95% CI 0.629–0.779, P<0.001). Σχετικά με τις κλινικοπαθολογοανατ

Down-regulation of kallikrein-related peptidase 5 (<it>KLK5</it>) expression in breast cancer patients: a biomarker for the differential diagnosis of breast lesions

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Kallikrein-related peptidase 5 (KLK5) is a secreted trypsin-like protease of the KLK family, encoded by the <it>KLK5 </it>gene. KLK5 has been found to cleave various extracellular matrix components, as well as to activate several other KLK proteases, triggering the stimulation of tissue microenvironment proteolytic cascades.</p> <p>Material and Methods</p> <p><it>KLK5 </it>expression levels were quantified in 102 cancerous and benign breast tissue specimens, obtained by randomly chosen patients, using RT-qPCR assay. Subsequently, advanced biostatistics were applied in order to analyze the <it>KLK5 </it>expression profile in the two patients' cohorts and also to evaluate its clinical significance for the discrimination of breast tumors.</p> <p>Results</p> <p>A statistically significant (p < 0.001) down-regulation of the <it>KLK5 </it>expression levels were observed in the malignant specimens compared to the benign ones. Logistic regression and ROC curve analysis revealed the significant (p < 0.001) and the independent (p < 0.001) value of the <it>KLK5 </it>expression quantification, for the discrimination of the malignant from the benign mammary gland biopsies. Moreover, <it>KLK5 </it>expression levels correlate with the pre-menopausal status (p < 0.005) as well as the ER-negative staining (p = 0.028) of women with breast cancer.</p> <p>Conclusions</p> <p>The quantification of <it>KLK5 </it>expression in breast tissue biopsies may be considered as a novel and independent biomarker for the differential diagnosis between malignant and benign tumors of the mammary gland.</p