FECONDATION IN VITRO AVEC MICROINJECTION DE SPERMATOZOIDES EPIDIDYMAIRES OU TESTICULAIRES CRYOCONSERVES

CLERMONT FD-BCIU-Santé (631132104) / SudocLYON1-BU Santé (693882101) / SudocSudocFranceF

CRYOCONSERVATION DES SPERMATOZOIDES HUMAINS EN VUE D'ASSISTANCE MEDICALE A LA PROCREATION (EXISTE-T-IL UN INTERET A REALISER LA MIGRATION SUR GRADIENT DE DENSITE AVANT LA CRYOCONSERVATION (DES BIOL. MED.))

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LES PROSTASOMES (FONCTION ANTIOXYDANTE DANS LE SPERME HUMAIN (DOCTORAT : BIOLOGIE DE LA REPRODUCTION))

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Effets de la cryopréservation du cortex ovarien humain sur la maturation folliculaire (études in vivo et in vitro)

L'objectif de notre travail porte sur l'étude de la folliculogenèse dans un modèle original de tissu ovarien humain (cortex entourant les kystes bénins de l'ovaire) et sur l'efficacité d'un protocole de congélation utilisant un milieu chimiquement défini contenant du propanediol comme cryoprotecteur et un refroidissement plus rapide que celui classiquement utilisé. Le tissu ovarien est analysé avant et après congélation. La survie du tissu et le développement folliculaire sont appréciés après 80 jours de xénogreffe à des souris SCID et 28 jours de culture. Notre modèle de cortex ovarien (en particulier dans les kystes dermoïdes) présente les mêmes caractéristiques morphologiques (densité et qualité des follicules) que le cortex ovarien normal. Après xénogreffe et culture, nous observons une maturation folliculaire jusqu'à l'obtention de follicules secondaires (avec quelques follicules antraux) et une atrésie relativement importante in vitro (90% et 84% après 4 semaines de culture de tissus frais et décongelés respectivement). La mesure de l'œstradiolémie in vivo et la caractérisation immunohistochimique de protéines spécifiques de l'ovocyte (GDF-9) et des cellules de la granulosa (AMH) témoignent de l'activité fonctionnelle des follicules. Après décongélation, les résultats sont globalement comparables à ceux obtenus avec le tissu frais. La différence porte essentiellement sur le stroma qui semble moins résistant à la congélation que les follicules. En conclusion, le cortex entourant les kystes bénins de l'ovaire est adapté pour développer des études in vivo et in vitro permettant d'explorer les mécanismes mis en jeu au cours de la croissance folliculaire et d'évaluer les effets de la congélation.The aim of this study was to investigate the folliculogenesis in an original human ovarian tissue model (cortex surrounding benign ovarian cysts) and the efficiency of a cryopreservation protocol using a chemically defined medium, containing propanediol as a cryoprotective agent, and a faster freezing rate than usually used. Analyses of ovarian tissue were performed before and after freezing/thawing. Survival and follicular growth were assessed after 80 days of xenografting into SCID mice or 28 days of in vitro culture. This model of tissue (dermoid cysts are of particular interest) is similar to normal ovarian cortex in follicular density and quality. After xenografting or in vitro culture, follicular maturation was observed (up to antral follicles in some cases) and atresia was high in vitro (90% and 84% after in vitro culture for 4 weeks in fresh and frozen/thawed tissue respectively). Functional follicles were demonstrated by estradiol measures in mice serum and immunohistochemistry staining of specific ovocyte (GDF-9) and granulosa cells (AMH) proteins. Differences were observed for stromal tissue which appeared more sensitive to the cryopreservation procedure than the follicles. Cortex surrounding benign ovarian cysts is of particular interest in in vivo and in vitro studies to investigate the mechanisms involved in the follicular growth and the effects of the cryopreservation procedure.CLERMONT FD-BCIU-Santé (631132104) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Apoptose du spermatozoïde et fertilité masculine

Pour mieux comprendre la signification des marqueurs d'apoptose dans les spermatozoïdes éjaculés humains, l'objectif de notre étude était de mesurer ces marqueurs dans les spermatozoïdes prélevés à différents niveaux du tractus génital masculin dans différentes situations physiopathologiques. Pour évaluer la qualité fonctionnelle de ces spermatozoïdes, des relations ont été recherchées entre l'expression de ces marqueurs et les résultats obtenus en assistance médicale à la procréation. Les marqueurs analysés sont des facteurs mis en jeu dans l'initiation et l'activation de l'apoptose (poly-caspases, caspase-3, -8 ou -9 activée(s)), et des signes précoces (externalisation de la phosphatidylsérine, PS) ou tardifs (fragmentation de l'ADN) de l'apoptose. Pour certains échantillons, une analyse ultrastructurale des spermatozoïdes a aussi été réalisée. la mesure de l'expression des caspases activées a fait l'objet d'une mise au point compte-tenu de l'hétérogénéité des populations spermatiques et de la faible quantité de spermatozoïdes disponibles. Finalement, nous avons retenu une mesure par double marquage associant un inhibiteur fluorescent vert des caspases activées et un colorant fluorescent rouge (Propidium Iodide) avec une détection soit en cytométrie en flux soit en microscopie à fluorescence selon la nature des spermatozoïdes analysés. Chez des patients présentant une agénésie bilatérale des canaux déférents, la proportion de spermatozoïdes vivants ou morts exprimant des caspases activées est plus élevée dans les spermatozoïdes testiculaires que dans les spermatozoïdes épididymaires suggérant une initiation du processus apoptique dans les testicules et une incapacité des spermatozoïdes épididymaires à initier l'apoptose. Dans ces conditions, en ICSI, le risque d'injecter un spermatozoïde apoptique dans un ovocyte est plus élevé avec les spermatozoïdes testiculaires et pourrait expliquer pour une part, les résultats de moins bonne qualité avec ces spermatozoïdes testiculaires qu'avec les spermatozoïdes épididymaires. Chez des patients infertiles, porteurs d'une translocation chromosomique réciproque ou Robertsonienne autosomique, il existe une expression plus importante des modifications ultrastructurales et des marqueurs biochimiques d'apoptose (caspases activées, fragmentation de l'ADN, externalisation de la PS) associée à des signes d'immaturité ultrastructurale, comparé aux spermatozoïdes d'hommes fertiles. Ces résultats pourraient expliquer que dans l'éjaculat de ces patients, il existe une prédominance de gamètes équilibrés sur le plan chromosomique. En effet, les gamètes présentant un déséquilibre auraient été éliminées préférentiellement par apoptose. En conclusion, les marqueurs d'apoptose exprimés par les spermatozoïdes éjaculés seraient le reflet d'une altération de la spermatogenèse avec une apoptose initiée et avortée dans le testicule associée à des anomalies de maturation et différentiation. La mesure des marqueurs d'apoptose dans les spermatozoïdes apporterait une aide dans la compréhension et la prise en charge de l'infertilité masculine, en particulier en assistance médicale à la procréation.In order to have a better insight into the implications of apoptosis markers in human ejaculated spermatozoa, the aim of our study was to measure these markers in the spermatozoa collected at different levels in the male genital tract in various physiopathological situations. To analyse the functional quality of these spermatozoa, the analysis of relationships between the expression of these markers and the results obtained after assisted reproductive technology was assessed. The markers analysed are factors that are involved in the initiation and activation of apoptosis (activated poly-caspases, caspases-3, -8, -9) and early (externalisation of phosphatidylsérine, PS), or late (DNA fragmentation) signs of apoptosis. Ultrastuctural analysis of the spermatozoa was also carried out for some samples. Measurement of the expression of activated caspases was subject of adjustment given the heterogeneity of the sperm samples and the low quantity of spermatozoa available. Finally, we decided on measurement using a double staining associating a green fluorescent inhibitor for the activated caspases and a red fluorescen vital staining (Propidium Iodide), with detection either by flow cytometry or by fluorescent microscopy depending on the type of spermatozoa to be analysed. In patients presenting congenital bilateral absence of vas deferens, the proportion of living or dead spermatozoa expressing activated caspases was higher in the testicular spermatozoa than in the epididymal spermatozoa suggesting that the apoptotic process started in the testicles and that epididymal spermatozoa were incapable of initiating apoptosis. Under these conditions, in case of ICSI, the risk of injecting an apoptotic spermatozoa into an ovocyte is higher with the testicular spermatozoa and could explain, in part, the different and inferior results obtained with these testicular spermatozoa, compared with epididymal spermatozoa. In the ejaculated spermatozoa of infertile reciprocal or Robertsonian autosomal translocation carriers, the expression of ultrastructural modifications and biochemical markers of apoptosis (activated caspases, DNA fragmentation, PS externalisation) associated with signs of ultrastructural immaturity was higher than in spermatozoa of fertile men. These results could explain that in the ejaculate of these patients, there is a predominance of chromosomal balanced spermatozoa. The gametes presenting an imbalance would have been preferentially eliminated by apoptosis. In conclusion, the apoptosis markers expressed by ejaculated spermatozoa would reflect the impairment of spermatogenesis with apoptosis initiated and aborted in the testicle associated with maturation and differentiation abnormalities. So measurement of apoptosis markers in spermatozoa could be helpful for the understanding of male infertility, particularly to predict the outcome of assisted reproductive technologies.CLERMONT FD-BCIU-Santé (631132104) / SudocSudocFranceF

Evolutions des gonadotropines et de la testostérone plasmatiques et des récepteurs testiculaires à la lutropine chez le rat normal et cryptorchide

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