Adaptable inactivated vaccine for combating Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

(PRRSV) is betrokken bij reproductiestoornissen bij zeugen en beren en bij respiratoire problematiek bij biggen van alle leeftijden, wat resulteert in een grote economische verliezen in de varkensindustrie. Een grote genetische variabiliteit is aangetoond onder de verschillende PRRSV isolaten en dit heeft zijn weerslag op hun virulentie, pathogeniciteit, immunogeniciteit,… Deze diversiteit is een groot probleem betreffende PRRSV preventie en controle. Het gebruik van de huidige commerciële vaccins in diverse vaccinatiestrategieën is de meest voorkomende methode om de klinische en economische impact van PRRSV te onderdrukken. Momenteel is er nood aan nieuwe en veilige vaccins die bescherming kunnen bieden tegen de PRRSV stammen die ontsnappen aan de immuniteit geïnduceerd door de huidige beschikbare commerciële vaccins. De doelstelling van deze thesis was het evalueren van de werkzaamheid van een geïnactiveerd bedrijfsspecifiek PRRSV vaccin - op basis van een eerder geoptimaliseerde virus- inactivatiemethode – en deze te vergelijken met die van commercieel beschikbare geattenueerde / geïnactiveerde PRRSV vaccins in naïeve en PRRSV-immune dieren. Tot op heden is het niet gekend welke voordelen er verbonden zijn aan het gebruik van deze bedrijfsspecifieke vaccins. De eerste studie richtte zich voornamelijk op het vergelijken van de werkzaamheid van de homologe BEI-geïnactiveerde vaccins met heterologe BEIgeïnactiveerde vaccins en commerciële geïnactiveerde en geattenueerde vaccins na een homologe of heterologe challenge. De homologe BEIgeïnactiveerde vaccins zorgden na infectie voor een significante reductie in viremie. Ondanks de twijfel betreffende de werkzaamheid van de commercieel geattenueerde vaccins - die ook worden gebruikt op de bedrijven waar de PRRSV-isolaten vandaan komen – hadden de commerciële geattenueerde vaccins toch een invloed op de duur van de viremie na infectie. De heterologe BEI-geïnactiveerde en commercieel geïnactiveerde vaccins daarentegen hadden geen of beperkte invloed op de viremie. In een tweede luik werden de BEI-geïnactiveerde bedrijfsspecifieke vaccins vergeleken met commercieel beschikbare geattenueerde / geïnactiveerde vaccins in PRRSV-immune zeugen qua boosten van de humorale immuniteit tegen huidig circulerende PRRSV isolaten. In een eerste deel van deze studie werd de PRRSVspecifieke antistoffenrespons na booster vaccinatie met commerciële vaccins en BEI-geïnactiveerde bedrijfsspecifieke vaccins geëvalueerd in niet drachtige reforme zeugen van 3 bedrijven met PRRS-problemen ondanks vaccinatie van zeugen en gelten. Een boost in virus-neutraliserende antistoffen tegen de bedrijfsspecifieke PRRSV isolaten werd opgemerkt bij alle zeugen die werden gevaccineerd met het respectievelijke geïnactiveerde bedrijfsspecifieke vaccin. De commerciële geattenueerde en geïnactiveerde vaccins gaven gemengde resultaten qua boosten van neutraliserende antistoffen tegen het bedrijfsspecifieke isolaat. In het tweede deel van de studie werd een veldproef uitgevoerd op 1 van bovenvermelde bedrijven om het booster effect van het BEI-geïnactiveerd bedrijfsspecifiek vaccin en het commercieel geattenueerd EU-type vaccin bij PRRSVimmune zeugen op 60 dagen dracht te evalueren. De impact van deze vaccinatie op de maternale immuniteit en op het PRRSV infectiepatroon bij de biggen gedurende hun eerste levensweken werd geëvalueerd. Na vaccinatie met het bedrijfsspecifieke vaccin werd een sterke stijging in bedrijfsspecifieke virusneutraliserende antistoffen opgemerkt bij alle zeugen. Tot 5 weken na de geboorte werden virusneutraliserende antistoffen gevonden in het bloed van biggen afkomstig van deze zeugen. Niet alle zeugen gevaccineerd met het commercieel geattenueerd EUtype vaccin toonden een stijging in bedrijfsspecifieke virus-neutraliserende antistoffen en de biggen afkomstig van deze zeugen hadden in het algemeen minder virus-neutraliserende antistoffen. Het aantal viremische biggen was significant lager bij biggen van beide gevaccineerde zeugengroepen dan bij biggen afkomstig van de controle zeugen en dit bleef zo tot op 9 weken na hun geboorte. In een laatste studie werd de werkzaamheid van het BEI-geïnactiveerd vaccin virus geproduceerd op de nieuwe gevoelige cellijn PK15Sn-CD163 vergeleken met het BEI-geïnactiveerd vaccin virus geproduceerd op MARC-145 cellen in een homologe en heterologe situatie bij niet-immune biggen. In de homologe PK15Sn-CD163 gegroeide en MARC-145 gegroeide BEIgeïnactiveerde vaccins, was na infectie de duur van de viremie significant gereduceerd met gemiddeld een tweetal weken. Een gelijkaardige resultaat werd bekomen met het heteroloog PK15Sn-CD163 gegroeide vaccin. Geen significante reductie in viremie werd geobserveerd met het heteroloog MARC-145 gegroeid vaccin na heterologe infectie. Finaal worden in de thesis de belangrijkste bevindingen samengevat en bediscussieerd en wordt het potentieel van bedrijfsspecifieke geïnactiveerde vaccins besproken

Characterization of a circulating PRRSV strain by means of random PCR cloning and full genome sequencing

RS is a pig disease of major economic importance that causes respiratory and reproductive problems in pigs. Over the last years it has become clear that PRRSV heterogeneity is increasing. Consequently, this has a potential impact on diagnosis and strategies to counter this disease. The use of sequence-independent PCR techniques for the detection and characterization of PRRSV could be useful to bypass problems associated with the heterogeneity of this virus. A random PCR cloning approach was tested for the characterization of PRRSV strain 07V063 of unknown genetic background that circulated on a Belgian farm. By using this approach, 7305 bp of sequence data were obtained, distributed randomly across the genome. Using RT-PCR with strain-specific primers, the full length sequence (15014 nt) was obtained. Phylogenetic relationships using ORF5 and ORF1a (NSP2) sequences showed that 07V063 was classified in type 1 subtype 1 and that 07V063 was genetically different from prototype Lelystad Virus (LV). 07V063 showed 87-93% aa identity with LV ORFs coding for structural proteins. Most variation (compared to LV) was noticed in Nsp2 (81% identity) with a deletion of 28 aa. This deletion was different from other known deletions in this ORF. In conclusion, it is shown that this random PCR cloning approach can be used for the characterization of new PRRSV strains of unknown genetic background

Development of an experimental inactivated PRRSV vaccine that induces virus-neutralizing antibodies

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) can induce reproductive disorders and is involved in the porcine respiratory disease complex, causing tremendous economic losses to the swine industry. Inactivated PRRSV vaccines are preferred over attenuated vaccines because of their safety and flexibility towards emerging virus strains, but the efficacy of current inactivated PRRSV vaccines is questionable. In this study, experimental inactivated PRRSV vaccines were developed, based on two formerly optimized inactivation procedures: UV irradiation and treatment with binary ethylenimine (BEI). In a first experiment, it was shown that vaccination with UV- or BEI-inactivated virus in combination with Incomplete Freund's Adjuvant induced virus-specific antibodies and strongly primed the virus-neutralizing (VN) antibody response. Subsequently, the influence of adjuvants on the immunogenicity of neutralizing epitopes on the inactivated virus was investigated. It was shown that vaccination with BEI-inactivated virus in combination with a commercial oil-in-water adjuvant induced high titers (3.4 log(2)) of VN antibodies in 6/6 pigs, instead of only priming the neutralizing antibody response. After challenge, neutralizing antibody titers in these vaccinated animals rose to a mean value of 5.5 log(2), and the duration of the viremia was reduced to an average of 1 week. This study shows that, by the use of an optimized inactivation procedure and a suitable adjuvant, inactivated PRRSV vaccines can be developed that induce VN antibodies and offer partial protection upon challenge

Pathogenesis and antigenic characterization of a new East European subtype 3 porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate

Background: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is divided into a European and North American genotype. East European PRRSV isolates have been found to be of the European genotype, but form different subtypes. In the present study, PRRSV was isolated from a Belarusian farm with reproductive and respiratory failure and designated "Lena". Analyses revealed that Lena is a new East European subtype 3 PRRSV isolate. The main purpose of this investigation was to study the pathogenesis and antigenic characteristics of PRRSV (Lena). Results: Obvious clinical and virological differences were observed between the animals inoculated with a recent European subtype 1 PRRSV isolate (Belgium A) and animals inoculated with PRRSV (Lena). Three out of six pigs inoculated with PRRSV (Belgium A) had anorexia and low fever at 3, 4 and 5 days post-inoculation (dpi). High fever, anorexia and depression were prominent signs in most pigs inoculated with PRRSV (Lena) between 2 and 28 dpi. Four pigs out of ten died during the experiment. Arcanobacterium pyogenes was isolated from lungs of one animal that died, and Streptococcus suis was isolated from lungs of one animal that was euthanized. The difference in viral titres in sera from PRRSV (Belgium A) and PRRSV (Lena)-infected pigs was statistically significant (p < 0.05) at 7, 10, 14 and 21 dpi. The highest viral titres in sera ranged from 10(4.8) to 10(6.1) TCID50/ml for PRRSV (Lena) whereas they ranged from 10(3.1) to 10(4.8) TCID50/ml for PRRSV (Belgium A). The replication of PRRSV (Lena) was further studied in depth. Viral titres ranged from 10(2.5) TCID50/100 mg to 10(5.6) TCID50/100 mg in nasal secretions between 3 and 14 dpi and from 10(2.8) TCID50/100 mg to 10(4.6) TCID50/100 mg in tonsillar scrapings between 3 and 21 dpi. High viral titres were detected in lungs (10(2.3)-10(7.7) TCID50/g tissue), tonsils (10(2.0)-10(6.2) TCID50/g tissue) and inguinal lymph nodes (10(2.2)-10(6.6) TCID50/g tissue) until 35, 28 and 35 dpi, respectively. To examine the antigenic heterogeneity between the East European subtype 3 isolate Lena, the European subtype 1 strain Lelystad and the North American strain US5, sets of monospecific polyclonal antisera were tested in immunoperoxidase monolayer assays (IPMAs) with homologous and heterologous viral antigens. Heterologous antibody titres were significantly lower than homologous titres (p = 0.01-0.03) for antisera against PRRSV (Lena) at all sampling time points. For antisera against PRRSV (Lelystad) and PRRSV (US5), heterologous antibody titres were significantly lower than homologous titres at 14 and 21 dpi (p = 0.01-0.03) and at 10 and 14 dpi (p = 0.04), respectively. Conclusions: Lena is a highly pathogenic East European subtype 3 PRRSV, which differs from European subtype 1 Lelystad and North American US5 strains at both the genetic and antigenic level