Strukturelle und funktionelle Charakterisierung eines neuartigen bakteriellen Cryptochroms sowie Analysen von mikrobiellen Photolyasen

Cryptochrome und Photolyasen sind eine Gruppe ubiquitärer, FAD bindender, blaulichtabhängiger Signalproteine bzw. Enzyme, welche zusammen die Photolyase/Cryptochrom-Superfamilie (PCSf) bilden. Während Photolyasen UV-induzierte DNA-Läsionen zwischen benachbarten Pyrimidinbasen, nämlich die Cyclobutanpyrimidindimere (CPD) und die (6-4)-Pyrimidin-pyrimidon-Photoprodukte ((6-4)), erkennen und blaulichtabhängig reparieren, üben Cryptochrome regulatorische Funktionen in vivo aus. Die pflanzlichen Vertreter sind in der Antwort auf Blaulichtreize involviert und nehmen Einfluss auf Wachstum, Entwicklung und die circadiane Uhr von Pflanzen. In Tieren partizipieren Cryptochrome in der circadianen Uhr als Blaulichtsensensor (Typ-I), oder lichtunabhängig als Teil des zentralen Oszillators (Typ-II). Cryptochrome aus Bakterien sind weniger gut untersucht, der bestcharakterisierte Vertreter aus Synechocystis sp. PCC6803 gehört zur CryDASH-Familie, deren genaue biologische Funktion noch immer unklar ist. In dieser Arbeit erfolgte eine funktionelle und die erste strukturelle Charakterisierung eines echten bakteriellen Cryptochroms, des Cryptochroms B aus Rhodobacter sphaeroides (RsCryB). RsCryB zeigt keine DNA-Reparaturaktivität und reguliert die Photosynthese von R. sphaeroides auf dem Transkriptlevel sauerstoff- und blaulichtabhängig. RsCryB definiert eine neue, überwiegend in Proteobakterien auftretende Proteinfamilie in der PCSf, die proteobakteriellen Cryptochrome (CryPro). Trotz geringer Sequenzidentitäten zu anderen Vertretern der PCSf ist die Struktur der CryPro-Familie homolog zur konservierten Überstruktur der Superfamilie. Überraschenderweise konnte in RsCryB ein [4Fe-4S]-Cluster identifiziert werden, der neben dem katalytischen Kofaktor FAD das bestimmende Element der C-terminalen Domäne ist. Dieser Cluster ist strukturell und chemisch verwandt mit bekannten Clustern aus eukaryotischen Primaseuntereinheiten, wie durch EPR-Experimente gezeigt werden konnte. Daneben wurde in RsCryB mit 6,7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin, ein für die PCSf neuer Antennenchromophor identifiziert. Diese Studien werden ergänzt durch eine Analyse der DNA-Bindung der Klasse II CPD-Photolyasen aus Methanosarcina mazei (MmCPDII), sowie durch die Analyse des vollständig reduzierten Zustandes der MmCPDII mittels Ultrakurzzeitspektroskopie. In einem dritten Teilprojekt konnte der Antennenchromophor der (6-4)-Photolyase aus Dunaliella salina als 8-Hydroxy-5-deazaflavin identifiziert und die in vitro Reparatur des (6-4)-Schadens durch das Enzym demonstriert werden

Strukturelle und funktionelle Charakterisierung eines neuartigen bakteriellen Cryptochroms sowie Analysen von mikrobiellen Photolyasen

Cryptochrome und Photolyasen sind eine Gruppe ubiquitärer, FAD bindender, blaulichtabhängiger Signalproteine bzw. Enzyme, welche zusammen die Photolyase/Cryptochrom-Superfamilie (PCSf) bilden. Während Photolyasen UV-induzierte DNA-Läsionen zwischen benachbarten Pyrimidinbasen, nämlich die Cyclobutanpyrimidindimere (CPD) und die (6-4)-Pyrimidin-pyrimidon-Photoprodukte ((6-4)), erkennen und blaulichtabhängig reparieren, üben Cryptochrome regulatorische Funktionen in vivo aus. Die pflanzlichen Vertreter sind in der Antwort auf Blaulichtreize involviert und nehmen Einfluss auf Wachstum, Entwicklung und die circadiane Uhr von Pflanzen. In Tieren partizipieren Cryptochrome in der circadianen Uhr als Blaulichtsensensor (Typ-I), oder lichtunabhängig als Teil des zentralen Oszillators (Typ-II). Cryptochrome aus Bakterien sind weniger gut untersucht, der bestcharakterisierte Vertreter aus Synechocystis sp. PCC6803 gehört zur CryDASH-Familie, deren genaue biologische Funktion noch immer unklar ist. In dieser Arbeit erfolgte eine funktionelle und die erste strukturelle Charakterisierung eines echten bakteriellen Cryptochroms, des Cryptochroms B aus Rhodobacter sphaeroides (RsCryB). RsCryB zeigt keine DNA-Reparaturaktivität und reguliert die Photosynthese von R. sphaeroides auf dem Transkriptlevel sauerstoff- und blaulichtabhängig. RsCryB definiert eine neue, überwiegend in Proteobakterien auftretende Proteinfamilie in der PCSf, die proteobakteriellen Cryptochrome (CryPro). Trotz geringer Sequenzidentitäten zu anderen Vertretern der PCSf ist die Struktur der CryPro-Familie homolog zur konservierten Überstruktur der Superfamilie. Überraschenderweise konnte in RsCryB ein [4Fe-4S]-Cluster identifiziert werden, der neben dem katalytischen Kofaktor FAD das bestimmende Element der C-terminalen Domäne ist. Dieser Cluster ist strukturell und chemisch verwandt mit bekannten Clustern aus eukaryotischen Primaseuntereinheiten, wie durch EPR-Experimente gezeigt werden konnte. Daneben wurde in RsCryB mit 6,7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin, ein für die PCSf neuer Antennenchromophor identifiziert. Diese Studien werden ergänzt durch eine Analyse der DNA-Bindung der Klasse II CPD-Photolyasen aus Methanosarcina mazei (MmCPDII), sowie durch die Analyse des vollständig reduzierten Zustandes der MmCPDII mittels Ultrakurzzeitspektroskopie. In einem dritten Teilprojekt konnte der Antennenchromophor der (6-4)-Photolyase aus Dunaliella salina als 8-Hydroxy-5-deazaflavin identifiziert und die in vitro Reparatur des (6-4)-Schadens durch das Enzym demonstriert werden

Bioactive cyclometalated phthalimides: design, synthesis and kinase inhibition

National Institutes of Health USA [CA114046]; German Research Foundation (DFG); Fonds der Chemischen IndustrieThe regioselective cyclometalation of 4-(pyridin-2-yl)phthalimide was exploited for the economical design of organometallic protein kinase inhibitors. 4-(Pyridin-2-yl)phthalimide can be prepared from inexpensive 4-bromophthalimide in just three steps including one Pd-catalyzed Stille cross-coupling. The versatility of this new ligand was demonstrated with the synthesis of ruthenium(II) half-sandwich as well as octahedral ruthenium(II) and iridium(III) complexes. The regioselectivity of the C-H activation in the course of the cyclometalation can be influenced by the reaction conditions and the steric demand of the introduced metal complex fragment. The biological activity of this new class of metalated phthalimides was evaluated by profiling two representative members against a large panel of human protein kinases. A cocrystal structure of one metallo-phthalimide with the protein kinase Pim1 confirmed an ATP-competitive binding with the intended hydrogen bonding between the phthalimide moiety and the hinge region of the ATP-binding site

Photoreduction of the Folate Cofactor in Members of the Photolyase Family*

Cryptochromes and DNA photolyases are related flavoproteins with flavin adenine dinucleotide as the common cofactor. Whereas photolyases repair DNA lesions caused by UV radiation, cryptochromes generally lack repair activity but act as UV-A/blue light photoreceptors. Two distinct electron transfer (ET) pathways have been identified in DNA photolyases. One pathway uses within its catalytic cycle, light-driven electron transfer from FADH−* to the DNA lesion and electron back-transfer to semireduced FADHo after photoproduct cleavage. This cyclic ET pathway seems to be unique for the photolyase subfamily. The second ET pathway mediates photoreduction of semireduced or fully oxidized FAD via a triad of aromatic residues that is conserved in photolyases and cryptochromes. The 5,10-methenyltetrahydrofolate (5,10-methenylTHF) antenna cofactor in members of the photolyase family is bleached upon light excitation. This process has been described as photodecomposition of 5,10-methenylTHF. We show that photobleaching of 5,10-methenylTHF in Arabidopsis cry3, a member of the cryptochrome DASH family, with repair activity for cyclobutane pyrimidine dimer lesions in single-stranded DNA and in Escherichia coli photolyase results from reduction of 5,10-methenylTHF to 5,10-methyleneTHF that requires the intact tryptophan triad. Thus, a third ET pathway exists in members of the photolyase family that remained undiscovered so far

Structurally Sophisticated Octahedral Metal Complexes as Highly Selective Protein Kinase Inhibitors

The generation of synthetic compounds with exclusive target specificity is an extraordinary challenge of molecular recognition and demands novel design strategies, in particular for large and homologous protein families such as protein kinases with more than 500 members. Simple organic molecules often do not reach the necessary sophistication to fulfill this task. Here, we present six carefully tailored, stable metal-containing compounds in which unique and defined molecular geometries with natural-product-like structural complexity are constructed around octahedral ruthenium(II) or iridium(III) metal centers. Each of the six reported metal compounds displays high selectivity for an individual protein kinase, namely GSK3α, PAK1, PIM1, DAPK1, MLCK, and FLT4. Although being conventional ATP-competitive inhibitors, the combination of the unusual globular shape and rigidity characteristics, of these compounds facilitates the design of highly selective protein kinase inhibitors. Unique structural features of the octahedral coordination geometry allow novel interactions with the glycine-rich loop, which contribute significantly to binding potencies and selectivities. The sensitive correlation between metal coordination sphere and inhibition properties suggests that in this design, the metal is located at a "hot spot" within the ATP binding pocket, not too close to the hinge region where globular space is unavailable, and at the same time not too far out toward the solvent where the octahedral coordination sphere would not have a significant impact on potency and selectivity. This study thus demonstrates that inert (stable) octahedral metal complexes are sophisticated structural scaffolds for the design of highly selective chemical probes.