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    Studien zur Substratspezifität der Linalool Dehydratase-Isomerase mit dem Fokus auf der Dehydratisierung von tertiären Alkoholen

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    Die natürliche Funktion der aus dem Proteobakterium Castellaniella defragrans stammenden Linalool Dehydratase-Isomerase liegt in der Funktionalisierung des Monoterpens Myrcen. Dabei wird im ersten Schritt Myrcen zu Linalool hydratisiert, während im zweiten Schritt die Isomerisierung von Linalool zu Geraniol stattfindet. Im weiteren Verlauf wird Geraniol vermutlich zu Geranial und Geranialsäure weiteroxidiert und kann so über die β-Oxidation abgebaut werden. In dieser Arbeit mit dem Fokus auf der Substratspezifität bezüglich der Dehydratisierung konnte sehr viel mehr über die LDI, vor allem in Hinblick auf den Mechanismus, das Substratspektrum und der weiteren Charakterisierung der LDI, in Erfahrung gebracht werden. So beschränkt sich das Substratspektrum nicht bloß auf die Monoterpene Myrcen, Linalool und Geraniol sondern es werden auch die Diterpene Farnesol und Nerolidol ohne Probleme akzeptiert. Neben diesen konnte auch eine Vielzahl anderer Substrate umgesetzt werden, wobei allen Substraten ein spezifisches Strukturmotiv eigen ist. Alle Substrate bestehen aus einem tertiären α-Methylallylalkohol und einem variierenden Rest. Interessanterweise muss an dem Kohlenstoff der Alkoholfunktion nicht zwingend in α-Stellung eine Methylgruppe liegen. Hier konnte auch gezeigt werden, dass eine Ethylgruppe oder ein Cyclopentanring ebenfalls von der LDI akzeptiert werden. Neben diesen Substraten konnten auch sehr kurze Substrate wie 2-Methyl-3-buten-2-ol 16 umgesetzt werden, aber auch aromatische Substrate 23 oder sehr lange Substrate wie Isophytol 32. Durch Synthesen einer Vielzahl strukturell abgewandelter Derivate des Linalools konnte indes ein guter Überblick über den Mechanismus gewonnen werden. Die Tatsache, dass kein Substrat ohne Vinylgruppe umgesetzt werden konnte, auch wenn diese aus elektronischer Sicht durch eine andere Doppelbindung ersetzt wurde, unterstreicht die Wichtigkeit dieser für die Bindung in das aktive Zentrum. Zudem konnte unter Verwendung von Rotameren mehr über die nähere Umgebung des aktiven Zentrums herausgefunden und gleichzeitig begründet werden, warum einige der synthetisierten Substrate wie 7 und 8 nicht umgesetzt werden konnten. Unter Zuhilfenahme von Deuteriumoxid im Puffer sowie durch den Vergleich der Dehydratisierung von Linalool mit d5-Linalool konnte zudem herausgefunden werden, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt nicht die C-H Bindungsspaltung an dem Methylenkohlenstoff ist, sondern die Protonierung und Abspaltung der Hydroxyfunktion was zur Ausbildung eines Karbokations führt. Dieses Karbokation wird zudem über die Vinylgruppe durch Hyperkonjugation mesomerie-stabilisiert. Im weiteren Verlauf wird ein Proton am α-Methylkohlenstoff abgespalten und es folgt die Ausbildung der C-C Doppelbindung. Dieser Mechanismus konnte erfolgreich gegenüber anderen funktionellen Gruppen getestet werden. Hierbei konnte der Methylether des Linalools ebenfalls erfolgreich eliminiert werden. Aufgrund des etwas niedrigeren pKB-Wertes des Methoxysauerstoffs gegenüber dem des tertiären Alkohols, kann dieser protoniert und Methanol abgespalten werden. Interessant war hierbei, dass sogar die Rückreaktion in 30 % Methanol gelang, wenn auch nur in sehr begrenzten Mengen. Andere Strukturmotive wie die des Esters wurden ebenfalls getestet. Vor allem die Ergebnisse bezüglich Vinylester sind sehr interessant. Leider konnte hierbei keine reine LDI getestet werden, weswegen die Aussagen dieser Ergebnisse nicht als gefestigt angesehen werden sollten. Um die LDI weiter zu charakterisieren, wurden die Reaktionen der Hydratisierung und der Dehydratisierung am Beispiel von Linalool und Myrcen in unterschiedlichen Lösungsmitteln getestet. Interessanterweise führte die Verwendung aller Lösungsmittel zur Inaktivierung der LDI, wobei vor allem auffällt das polar-protische Lösungsmittel wie DMSO, Methanol und Ethanol einen eher geringen Einfluss haben, wohingegen aprotische Lösungsmittel wie Ethylacetat, THF oder Toluol sehr schnell zur Inaktivierung führen. Einzige Ausnahme ist, dass bei der Hydratisierung von Myrcen polar-protische Lösungsmittel ohne Vorinkubation zu einer deutlichen Aktivitätssteigerung in den ersten Minuten führen. Die Möglichkeit Methanol aus Substrat 15 eliminieren zu können, ermöglichte es ein Screening auf Basis der Oxidation von Methanol in Formaldehyd mit Hilfe der Glucose Oxidase zu entwickeln. Das hierbei gebildete Wasserstoffperoxid dient der Meerrettichperoxidase die Kupplungsreaktion von 4-Aminoantipyrin und Vanillinsäure durchzuführen. Während die Reaktion im Eppimaßstab eine rote Färbung des Lysats nach sich führte, war die Differenz zwischen Negativ- und Positivkontrolle in den 96 Well Platten innerhalb der gegebenen Zeit zu gering, um verlässliche Aussagen zu liefern. Das Problem lag hierbei eindeutig in der zur Verfügung stehenden Menge an LDI im Lysat. Das Expressionssystem BL21(DE3) reichte für das Screening nicht aus, um einen nennenswerten Umsatz zu erzielen. Von daher ist es hier sinnvoll, ein neues Expressionssystem zu entwickeln. Erste Ansätze mit einem auf dem T5 Promotor basierenden Expressionssystem sehen vielversprechend aus. Da Dehydratisierungsreaktionen eine immer wichtigere Rolle spielen, was vor allem der Defunktionalisierung von nachwachsenden Rohstoffen und deren Folgeprodukten geschuldet ist, lässt weitere Forschung hinsichtlich enzymatisch vermittelter Reaktionen notwendig erscheinen. Die LDI wird vermutlich in der Defunktionalisierung von Zuckern und Derivaten keine Rolle spielen, da sich ihre Aktivität bisher auf Substrate mit einem spezifischen tertiären Allylalkohol-Motiv beschränkt. Dennoch ist das ermittelte Substratspektrum sehr groß wobei vor allem die Möglichkeit sehr kleine Substrate zu dehydratisieren sowie selektiv tertiäre (R)- und (S)-Alkohole herzustellen, für die Industrie von großem Interesse ist.The increasing interest on dehydration reactions is caused by the large problems which are present nowadays in the degradation of sustainable resources and their derived products. In this light, enzymes like lyases with C-X bond-forming and bond-cleaving ability are getting more and more important. Regarding sustainable resources like sugars or cellulose the role of novel dehydratases with C-O cleaving ability is outstanding. This work is concerned with the linalool dehydratase-isomerase from the β-proteobacteria Castellaniella defragrans. Herein the LDI is involved in the degradation pathway of the monoterpene myrcene through selective hydration of myrcene into (S)-linalool followed by isomerization into geraniol. Further steps in this pathway most probably involve the oxidation into geranial and geranic acid, finally be degraded via β-oxidation. This work mainly employs the problems of the little specified enzyme LDI concerning substrate specificity and further characterization especially of the mechanism. Beginning with expression of the LDI we established a system in E. coli BL21(DE3). Biotransformations with lysate showed highest activity towards dehydration at slightly acidic conditions. For a better understanding about substrate specificity we synthesized a large substrate library including many linalool derivatives. Using this library we discovered a very broad substrate scope of the LDI. In addition to the monoterpenes linalool and derivatives, small to large substrates were accepted. Interestingly nearly all of the substrates converted had a specific tertiary α-methylallyl alcohol motif in common. Further we could identify linalyl amine as potent inactivator for the LDI. Also all accepted substrates showed a high EE resulting in accumulation of the (R)-alcohol regarding dehydration. Experiments using deuterium oxide as well as comparison of d5-linalool with linalool gave further detailed information about a possible mechanism. Herein the results of the specific activities lead to the fact that hydration of the hydroxyl-group is the rate-determining step. Using rotamer structures of non-accepted and converted substrates as well as secondary structure prediction gave first insights into a possible structure model. By making use of the postulated mechanism we found out that besides water also methanol could be eliminated. This reaction could be verified in additional experiments using methanol resulting in nucleophile addition. While using other solvents we could gain further information about the solvent resistence of the LDI. In order to develop a screening system the described reaction about elimination of methanol was successfully endorsed on several coupling assays based on formaldehyde or hydrogen peroxide. Within this set the coupling reaction of 4-aminoantipyrine with vanillic acid appears to be the best one. To conclude the LDI´s role in dehydrating sustainable resources is limited because of the very specific motif needed for dehydration. But the possibility of dehydrating very small substrates as well as the synthesis of enantioselective (R)- and (S)-alcohols is from an industrial point of view very valuable

    Nutzen und Effektivität der intradialytischen parenteralen Erhährung (IDPN) bei mangelernährten Langzeithämodialysepatienten

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    In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der bioelektrischen Impedanzanalyse der Ernährungszustand bei 84 Hämodialysepatienten evaluiert. Unter Zuhilfenahme von Laborparametern (Harnstoff, Kreatinin, Albumin, C-reaktives-Protein u.a.), Ernährungsprotokollen und der klinischen Untersuchung zur Charakterisierung des Ernährungsstatus erfolgte eine 12 wöchige Interventionsphase durch eine IDPN bei 24 Hämodialysepatienten, jeweils in 2 Gruppen randomisiert, zeitversetzt mit einer Vor- und Nachbeobachtungsphase von ebenfalls je 12 Wochen. Es wurden durch eine IDPN Intervention signifikante Anstiege für Albumin, Body Cell Mass und Extracellulär Masse beobachtet, der Erythropoetinbedarf konnte in beiden Gruppen signifikant um durchschnittlich 1000 IE pro Dialysetag (entsprechend 3 Dialysen pro Woche, HD-Zeit mind. 4h) reduziert werden

    FEM simulation of wire drawing

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    The paper deals with the finite element simulation of wire drawing processes with focus on unalloyed carbon steels. Based on the development of suitable material models as a basis for the simulation model, the forming processes are analyzed over several drawing stages for different drawing regimes. The simulation model is validated by comparing the simulation results with measured values. For the description of the forming behavior, the damage developments of the wire during the multi-stage forming are specifically analyzed. Subsequently, forming limits are derived by correlating the calculated damage with mechanical parameters of the wires. The validation of the damage models used is made possible by an FE parameter study, within which a targeted variation of the drawing die geometry takes place at a specific drawing stage. The paper is concluded by the verification of the results obtained theoretically by practical tests on a wire drawing machine using critical drawing die geometries

    Hierarchical Bayesian ANOVA for multivariate and spatial data with application to climate projections

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    Applied statistics as an independent field of study can be said to have been recognized as such roughly a century ago. A large part of this recognition can be attributed to analysis of variance, a method which has been of paramount importance for much of the scientific and industrial progress throughout the 20th century. However, as the complexity of experiments and data has increased during this time, so has the difficulty in carrying out an analysis of variance. Often it is difficult to understand how statistical parameters correspond to real-world quantities; to relate statistical methods to one another; to distinguish between the practical relevance and statistical significance of an analysis; and to recognize the computational demands of a chosen method. The work herein contributes to the field of applied statistics by identifying a methodology that addresses these challenges. This method is then applied to large-scale simulated climate projections in a way that is computationally efficient and that provides clear and intuitive conclusions on what explanatory factors contribute to the overall variability of the data. The work begins with viewing analysis of variance as a more general procedure than it is traditionally considered. By placing it into a more broadly defined hierarchical Bayesian context, the ability to draw connections between fixed and random effects within a single procedure is facilitated. To present results, novel numerical and graphical summaries that communicate practical relevance, as well as the statistical significance, of variance parameters are then developed. Novel summaries for general multivariate cases are also proposed. Existing methods that achieve these goals typically rely on Markov chain Monte Carlo methods. Whereas here a class of conjugate distributions for variance parameters is derived, which allow for a factorization of the posterior distribution and which obviate the need for MCMC methods, thus reducing computational demands. For cases involving spatial geostatistical models, approximation methods that further alleviate computational demands are also developed. These approximations are closely examined, and shown to produce accurate representations of the original quantities. The culmination of these efforts is in the spatial statistical analysis of a set of simulated climate projections. A single simulated climate projection is carried out using a distinct mathematical climate model, and an assumed rate of future greenhouse gas emissions. Thus, the sources of variability examined in the data are the climate model and the emissions scenario, their interaction, both as a constant as well as over decadal time increments. The magnitude of the variability for each source is then estimated, together with the uncertainty of these estimates. While the method is original, the results agree with those found in previous peer-reviewed works
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