AvrPphB, AvrPphF: Μελέτες δύο μολυσματικών παραγόντων από την Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

Gram negative bacteria use a highly sophisticated secretion system for protein delivery into the eukaryotic host cells, the type III secretion system. The strategy they use is conserved among plant and animal pathogens. In this thesis the studies of the type III effectors AvrPphB and AvrPphF from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola are demonstrated. The proteins were cloned to expression vectors carrying a 6-His tag and purification experiments took place. The two sitedirected mutants of AvrPphB G63A and G63E show proteolytic cleavage like the wild type protein. In the case of AvrPphF, the two open reading frames that constitute its operon suggest the common strategy of animal pathogens of a type III chaperone and its cognate effector. In silico studies predict a type III chaperon like secondary structure for ORF1 and produce a homology model based on CesT template (type III chaperone from EPEC E.coli). Co- purification experiments also suggest interaction between ORF1 and the aminoterminal part of ORF2.Τα gram αρνητικά βακτήρια χρησιμοποιούν ένα εξειδικευμένο σύστημα μεταφοράς των μολυσματικών πρωτεϊνών τους με στόχο τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το σύστημα αυτό έχει ονομαστεί Τύπου ΙΙΙ. Η στρατηγική των βακτηρίων είναι κοινή είτε στοχεύουν φυτικά είτε ζωικά κύτταρα. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή μελετήθηκαν οι μολυσματικoί παράγοντες AvrPphB και AvrPphF από την Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Οι πρωτεϊνες κλωνοποιήθηκαν σε φορέα έκφρασης με ετικέτα έξι ιστιδινών και έγιναν προσπάθειες καθαρισμού τους. Στην περίπτωση της AvrPphB τα δύο σημειακά μεταλλάγματα G63A και G63E που μελετήθηκαν έδειξαν ότι πρωτεολύονται όπως και η αγρίου τύπου πρωτεϊνη. Στην περίπτωση του μολυσματικού παράγοντα AvrPphF, τα δύο ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης του οπερονίου του θυμίζουν την στρατηγική τσαπερόνης- μολυσματικής πρωτεϊνης που χρησιμοποιούν κατά κανόνα τα ζωικά παθογόνα βακτήρια. In silico μελέτες προβλέπουν όμοια δευτεροταγή δομή του ORF1 με τις τσαπερόνες του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ, ενώ κατασκευάζεται ομόλογο μοντέλο στον χώρο με βάση την μήτρα της CesT (type III chaperone από την EPEC E.coli). Από την άλλη, πειράματα συνκαθαρισμού δείχνουν το ORF1 να αλληλεπιδρά με το αμινοτελικό άκρο του ORF2, υποστηρίζοντας επίσης αυτή τη θεώρηση

AvrPphB, AvrPphF: Μελέτες δύο μολυσματικών παραγόντων από την Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

Gram negative bacteria use a highly sophisticated secretion system for protein delivery into the eukaryotic host cells, the type III secretion system. The strategy they use is conserved among plant and animal pathogens. In this thesis the studies of the type III effectors AvrPphB and AvrPphF from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola are demonstrated. The proteins were cloned to expression vectors carrying a 6-His tag and purification experiments took place. The two sitedirected mutants of AvrPphB G63A and G63E show proteolytic cleavage like the wild type protein. In the case of AvrPphF, the two open reading frames that constitute its operon suggest the common strategy of animal pathogens of a type III chaperone and its cognate effector. In silico studies predict a type III chaperon like secondary structure for ORF1 and produce a homology model based on CesT template (type III chaperone from EPEC E.coli). Co- purification experiments also suggest interaction between ORF1 and the aminoterminal part of ORF2.Τα gram αρνητικά βακτήρια χρησιμοποιούν ένα εξειδικευμένο σύστημα μεταφοράς των μολυσματικών πρωτεϊνών τους με στόχο τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το σύστημα αυτό έχει ονομαστεί Τύπου ΙΙΙ. Η στρατηγική των βακτηρίων είναι κοινή είτε στοχεύουν φυτικά είτε ζωικά κύτταρα. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή μελετήθηκαν οι μολυσματικoί παράγοντες AvrPphB και AvrPphF από την Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Οι πρωτεϊνες κλωνοποιήθηκαν σε φορέα έκφρασης με ετικέτα έξι ιστιδινών και έγιναν προσπάθειες καθαρισμού τους. Στην περίπτωση της AvrPphB τα δύο σημειακά μεταλλάγματα G63A και G63E που μελετήθηκαν έδειξαν ότι πρωτεολύονται όπως και η αγρίου τύπου πρωτεϊνη. Στην περίπτωση του μολυσματικού παράγοντα AvrPphF, τα δύο ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης του οπερονίου του θυμίζουν την στρατηγική τσαπερόνης- μολυσματικής πρωτεϊνης που χρησιμοποιούν κατά κανόνα τα ζωικά παθογόνα βακτήρια. In silico μελέτες προβλέπουν όμοια δευτεροταγή δομή του ORF1 με τις τσαπερόνες του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ, ενώ κατασκευάζεται ομόλογο μοντέλο στον χώρο με βάση την μήτρα της CesT (type III chaperone από την EPEC E.coli). Από την άλλη, πειράματα συνκαθαρισμού δείχνουν το ORF1 να αλληλεπιδρά με το αμινοτελικό άκρο του ORF2, υποστηρίζοντας επίσης αυτή τη θεώρηση

Phylogenetic analysis of a gene cluster encoding an additional, rhizobial-like type III secretion system that is narrowly distributed among <it>Pseudomonas syringae</it> strains

Abstract Background The central role of Type III secretion systems (T3SS) in bacteria-plant interactions is well established, yet unexpected findings are being uncovered through bacterial genome sequencing. Some Pseudomonas syringae strains possess an uncharacterized cluster of genes encoding putative components of a second T3SS (T3SS-2) in addition to the well characterized Hrc1 T3SS which is associated with disease lesions in host plants and with the triggering of hypersensitive response in non-host plants. The aim of this study is to perform an in silico analysis of T3SS-2, and to compare it with other known T3SSs. Results Based on phylogenetic analysis and gene organization comparisons, the T3SS-2 cluster of the P. syringae pv. phaseolicola strain is grouped with a second T3SS found in the pNGR234b plasmid of Rhizobium sp. These additional T3SS gene clusters define a subgroup within the Rhizobium T3SS family. Although, T3SS-2 is not distributed as widely as the Hrc1 T3SS in P. syringae strains, it was found to be constitutively expressed in P. syringae pv phaseolicola through RT-PCR experiments. Conclusions The relatedness of the P. syringae T3SS-2 to a second T3SS from the pNGR234b plasmid of Rhizobium sp., member of subgroup II of the rhizobial T3SS family, indicates common ancestry and/or possible horizontal transfer events between these species. Functional analysis and genome sequencing of more rhizobia and P. syringae pathovars may shed light into why these bacteria maintain a second T3SS gene cluster in their genome.</p

Purification, crystallization and preliminary characterization of a putative LmbE-like deacetylase from Bacillus cereus

The BC1534 protein from B. cereus was purified and crystallized and a native X-ray diffraction data set was collected to 2.5 Å using synchrotron radiation

Migration of Type III Secretion System Transcriptional Regulators Links Gene Expression to Secretion

Many plant-pathogenic bacteria of considerable economic importance rely on type III secretion systems (T3SSs) of the Hrc-Hrp 1 family to subvert their plant hosts. T3SS gene expression is regulated through the HrpG and HrpV proteins, while secretion is controlled by the gatekeeper HrpJ. A link between the two mechanisms was so far unknown. Here, we show that a mechanistic coupling exists between the expression and secretion cascades through the direct binding of the HrpG/HrpV heterodimer, acting as a T3SS chaperone, to HrpJ. The ternary complex is docked to the cytoplasmic side of the inner bacterial membrane and orchestrates intermediate substrate secretion, without affecting early substrate secretion. The anchoring of the ternary complex to the membranes potentially keeps HrpG/HrpV away from DNA. In their multiple roles as transcriptional regulators and gatekeeper chaperones, HrpV/HrpG provide along with HrpJ potentially attractive targets for antibacterial strategies.On the basis of scientific/economic importance, Pseudomonas syringae and Erwinia amylovora are considered among the top 10 plant-pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Both employ type III secretion systems (T3SSs) of the Hrc-Hrp 1 family to subvert their plant hosts. For Hrc-Hrp 1, no functional link was known between the key processes of T3SS gene expression and secretion. Here, we show that a mechanistic coupling exists between expression and secretion cascades, through formation of a ternary complex involving the T3SS proteins HrpG, HrpV, and HrpJ. Our results highlight the functional and structural properties of a hitherto-unknown complex which orchestrates intermediate T3SS substrate secretion and may lead to better pathogen control through novel targets for antibacterial strategies