Functional distinction of the TAp73 isoforms in carcinogenesis

The p73 gene encodes the tumor suppressive full-length TAp73 and N-terminal-truncated DNp73 isoforms that act as dominant negative inhibitors of TAp73. The overall effect of p73 in oncogenesis is thought to depend on the TAp73 to DNp73 isoforms’ ratio. TAp73 isoforms include a number of C-terminal variants (namely TAp73α, TAp73β, TAp73γ, TAp73δ, TAp73ε, TAp73ζ and TAp73η) as a result of alternative splicing in 3′-end. TAp73 isoforms differ in their transcriptional activities, as estimated by their transactivation efficiency on typical p53 targets, such as the p21Waf 1/Cip1, a key component of cell cycle regulation. Each TAp73 isoform not only activates the same targets to a different extend, but it also seems to have distinct gene targets. Data on the most studied TAp73α and TAp73β isoforms clearly highlight that, at least these isoforms, have opposing effects on the same target genes and they can also transactivate different targets. A number of recent studies highlight physical properties, as well as specific functional domains and residues of C-terminal tail of TAp73 isoforms that enhance or impair their transcriptional activity and apoptotic efficiency. These are: a) The C-terminal electrostatic charge, b) the Glu/Pro-rich and Pro-rich regions, c) the PPPPY motif d) the SAM domain and extreme C terminus (17). Oncogenesis includes well defined steps, through which “successful” genetic changes offer a growth advantage to normal cells, leading to their progressive transformation into cancer cells, in a process analogous to Darwinian evolution. In 2000, Hanahan et al. reported six steps (or hallmarks) in this process, i.e. sustaining proliferative signaling, evading growth suppressors, activating invasion and metastasis, enabling replicative immortality, inducing angiogenesis and resisting cell death. In 2011, Hanahan et al. (1) added two more hallmarks in this crucial list, i.e. reprogramming of energy metabolism and evading immune destruction, as well as two enabling characteristics, i.e. tumor-promoting inflammation and genome instability. Strikingly, TAp73 isoforms inhibit all these hallmarks and enabling characteristics, thus drastically influencing processes that underlie cancer promotion, progression and metastasis.The discovery of microRNAs (miRNAs) and their link with cancer has opened a new era in cancer therapeutics. Approximately, 19 - 25 nucleotides long, miRNAs can up-regulate or down-regulate gene expression in many cancer types and are respectively categorized as oncogenes (oncomirs) or tumor suppressors. Expression proles of miRNAs with biomarker potential can be used for the classication, diagnosis, therapeutic treatment, and prognosis of different cancer types. miRNA mimics and miRNA antagonists are the two main approaches to miRNA-based cancer therapies. The aim of this study is the functional distinction of the TAp73 isoforms in carcinogenesis. The TAp73α, TAp73β and TAp73γ isoforms were evaluated for their ability to induce specific miRNA signatures and to elucidate the underlying mechanisms of the inhibition of cell proliferation, cell migration and cell invasion. p53 family members, such as p53 and p63, antagonize epithelial to mesenchymal transition (EMT) processes through crucial microRNAs (miRNAs) that down-regulate EMT markers. However, to date, there are no published reports on p73-induced miRNAs that suppress EMT. In this study we examined which miRNAs are directly induced by the TAp73α, TAp73β and TAp73γ isoforms and inhibit the hallmarks and enabling characteristics of cancer.Using wound healing assays and Western blot, we showed that TAp73 isoforms differentially inhibit cell migration in vitro and alter levels of prometastatic EMT markers. To test whether this effect is also miRNA-mediated, we searched for miRNAs that are directly upregulated upon TAp73 induction, using high-throughput approaches (miRNA Micro Arrays). We found that TAp73 isoforms transactivate miRNAs with putative EMT-related targets, namely the well-studied TAp73 target miR-34a-5p and the still uncharacterized miR-3158-5p. miR-3158-5p was further identified as a direct TAp73 target, using ChIP and luciferase assays. It also down-regulates the EMT marker vimentin and inhibits cancer cell proliferation, migration and invasiveness in vitro. miR-3158-5p is under-expressed in breast cancer cell lines with high proliferation and invasive potential compared to breast cancer cell lines with low proliferation and invasive potential. MDA-MB-231 and MDA-MB-468 stably transfected clones expressing MIR3158 were constructed. These breast cancer cell lines are highly invasive. The inhibition of cell proliferation, colony formation, migration and invasion in these expressing MIR3158 clones was established by proliferation assay, colony formation assay, wound healing assay and invasion assay, respectively. In vivo zenografts were performed in SCID mice using MDA-MB-231 and MDA-MB-468 stably transfected clones and the anti-proliferative effect of MIR3158 was evaluated by measuring the volumes of the tumors that were formed during the experiment compared to the corresponding negative control mock clones. Furthermore, using bioinformatics tools we managed to identify and characterize the homologous mouse MIR3158 gene. This so called mmu-miR-3158Like gene was cloned into an expression vector and A5 skin cancer mouse cells we transiently transfected. We managed to identify two novel mouse mature miRNAs, namely mmu-miR-3158L-1 and mmu-miR-3158L-2. Finally, using bioinformatics tools we managed to predict that these mature mouse miRNAs directly target the mRNA of mouse vimentin and we showed that the expression levels of mouse vimentin were diminished upon the expression of the novel mouse MIR3158Like gene.Το γονίδιο p73, μαζί με το p63, ανήκει στην οικογένεια του γονιδίου p53. Συνθέτει μια πληθώρα ισομορφών, οι οποίες κατατάσσονται σε δυο ομάδες, τις ογκοκατασταλτικές ΤΑ ισομορφές που επάγονται από τον P1 υποκινητή και περιλαμβάνουν την ΤΑ περιοχή, και τις ογκογόνες DN ισομορφές οι οποίες επάγονται από τον εσωτερικό P2 υποκινητή. Η ισορροπία μεταξύ των ισομορφών αυτών μπορεί να καθορίσει και την μοίρα του κυττάρου. Οι ισομορφές ΤΑp73 περιλαμβάνουν ένα αριθμό παραλλαγών (TAp73α, TAp73β, TAp73γ, TAp73δ, TAp73ε, TAp73ζ and TAp73η) που παράγονται λόγω του εναλλακτικού ματίσματος στο καρβοξυτελικό άκρο. Οι ισομορφές ΤΑp73 διαφέρουν ως προς την μεταγραφική τους δραστηριότητα, όπως προκύπτει από την αποτελεσματικότητά τους να ενεργοποιούν ένα κλασσικό στόχο του γονιδίου p53, το p21Waf 1/Cip1, που αποτελεί έναν σημαντικό στοιχείο της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου. Κάθε μία από τις ισομορφές ΤΑp73 όχι μόνο ενεργοποιεί σε διαφορετικό βαθμό τα ίδια γονίδια, αλλά φαίνεται να διαθέτουν διακριτούς μεταγραφικούς στόχους. Στοιχεία για τις πιο μελετημένες ισομορφές (TAp73α και TAp73β) τονίζουν σαφώς ότι, τουλάχιστον αυτές οι ισομορφές, έχουν αντίθετες επιδράσεις στα ίδια γονίδια-στόχους και μπορούν επίσης να ενεργοποιούν μεταγραφικά διαφορετικούς στόχους. Μια σειρά πρόσφατων μελετών τονίζουν φυσικές ιδιότητες, καθώς και συγκεκριμένες λειτουργικές περιοχές και τα αμινοξικά κατάλοιπα της καρβοξυτελικής ουράς των TAp73 ισομορφών που ενισχύουν ή εμποδίζουν την μεταγραφική δραστηριότητα και την αποπτωτική αποτελεσματικότητά τους. Αυτές οι α) το ηλεκτροστατικό φορτίο της καρβοξυτελικής περιοχής, β) οι περιοχές πλούσιες σε Pro και Glu/Pro, γ) το μοτίβο PPPPY και δ) η περιοχή SAM και η έσχατη καρβοξυτελική περιοχή (17).Η ογκογένεση περιλαμβάνει σαφώς καθορισμένα στάδια, μέσω των οποίων «επιτυχημένες» γενετικές αλλαγές προσφέρουν πλεονέκτημα ανάπτυξης σε φυσιολογικά κύτταρα, οδηγώντας τα στην προοδευτική μετατροπή τους σε καρκινικά κύτταρα. Το 2000, οι Hanahan και Weinberg ανέφεραν ορόσημα σε αυτή τη διαδικασία, δηλαδή τη διατήρηση πολλαπλασιαστικής σηματοδότησης, την καταστρατήγηση αναστολέων ανάπτυξης, την ενεργοποίηση της διείσδυσης και της μετάστασης, την απόκτηση ικανότητας αθανατοποιημένου διπλασιασμού, την επαγωγή της αγγειογέννεσης και την αντίσταση στον κυτταρικό θάνατο. Το 2011, οι ίδιοι επιστήμονες προσέθεσαν δύο ακόμη ορόσημα σε αυτή την σημαντική λίστα, δηλαδή τον επαναπρογραμματισμό του ενεργειακού μεταβολισμού και την καταστρατήγηση της καταστροφής από το ανοσοποιητικό σύστημα, καθώς και δύο νέα χαρακτηριστικά, δηλαδή την φλεγμονή που προάγει δημιουργία όγκου και τη γονιδιωματική αστάθεια. Είναι εντυπωσιακό ότι, οι ισομορφές TAp73 αναστέλλουν όλα αυτά τα ορόσημα και χαρακτηριστικά γνωρίσματα του καρκίνου, επηρεάζοντας δραστικά τις διαδικασίες που διέπουν την προώθηση του καρκίνου, την εξέλιξη και τη μετάσταση.Η ανακάλυψη των microRNAs (miRNAs) και της σχέσης τους με τον καρκίνο έχει ανοίξει μια νέα εποχή στη θεραπευτική προσέγγιση του καρκίνου. Τα miRNAs είναι μια ομάδα μικρών, μονόκλωνων στην ώριμη μορφή τους, μορίων RNAs μήκους 16-25 νουκλεοτίδια και συμμετέχουν στην αρνητική ρύθμιση πολλών γονιδίων. Πρότυπα έκφρασης των miRNAs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για την ταξινόμηση, τη διάγνωση, τη θεραπευτική αγωγή, και την πρόγνωση των διαφορετικών τύπων του καρκίνου του ανθρώπου. Χρήση των μιμητικών μορίων miRNA και ανταγωνιστών των miRNA είναι οι δύο κύριες προσεγγίσεις για θεραπεία του καρκίνου με βάση τα miRNAs. Ο σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της λειτουργικής διάκρισης των ισομορφών TAp73 του γονιδίου p73 κατά την ογκογένεση. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτός ο στόχος μελετήθηκαν οι ισομορφές TAp73α, TAp73β και TAp73γ ως προς: τις διαφορές στις λειτουργικές περιοχές και τα λειτουργικά κατάλοιπα που περιλαμβάνει η κάθε μία ισομορφή, το μεταγραφικό πρότυπο έκφρασης των miRNAs που επάγουν και την ικανότητά τους, καθώς και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται, να αναστέλλουν ορισμένα ορόσημα του καρκίνου όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ) και η κυτταρική κινητικότητα και διείσδυση. Έχει εκτενώς αναφερθεί στην βιβλιογραφία ότι τα δυο άλλα μέλη της οικογένειας του p53 επάγουν ορισμένα miRNAs, τα οποία με τη σειρά τους αναστέλλουν γονίδια σχετιζόμενα με το ΕΜΤ. Ο σκοπός της μελέτης ήταν να εντοπίσουμε, να ταυτοποιήσουμε και να χαρακτηρίσουμε αντίστοιχα miRNAs για το τρίτο μέλος της οικογένειας, το p73.Κάνοντας χρήση της δοκιμασίας επούλωσης πληγής και της ανοσοστύπωσης κατά Western, παρατηρήσαμε ότι οι ισομορφές TAp73 αναστέλλουν διαφορικά την μετανάστευση των κυττάρων in vitro και ρυθμίζουν αρνητικά πρωτεϊνικούς δείκτες σχετιζόμενους με την ΕΜΤ, όπως η zeb1, snail και η βιμεντίνη. Προκειμένου να ελεγχθεί αν αυτή η επίδραση είναι miRNA διαμεσολαβούμενη, αναζητήσαμε miRNAs που υπερεκφράζονται άμεσα μετά από επαγωγή των ισομορφών TAp73 κάνοντας χρήση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχειών των miRNAs. Αποκαλύψαμε ότι οι ισομορφές TAp73 ενεργοποιούν μεταγραφικά miRNAs τα οποία δυνητικά στοχεύουν παράγοντες σχετιζόμενους με την ΕΜΤ, το ευρέως μελετημένο miR-34a-5p και το, έως τώρα, αχαρακτήριστο miR-3158-5p. Το miR-3158-5p περαιτέρω ταυτοποιήθηκε ως άμεσος στόχος των ισομορφών TAp73 κάνοντας χρήση της δοκιμασίας της ανοσοκατακρύμνισης χρωματίνης (ChIP assay) και της δοκιμασίας λουσιφεράσης. Επιπλέον, ρυθμίζει αρνητικά την βιμεντίνη, έναν σημαντικό δείκτη της ΕΜΤ, και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου, τη μετανάστευση και διεισδυτικότητα in vitro. Το miR-3158-5p είναι υπό-εκφρασμένο σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού με υψηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού και διείσδυσης σε σύγκριση με καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού με χαμηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού και διείσδυσης. Κατασκευάστηκαν σταθερά διαμολυμένοι κλώνοι των κυτταρικών σειρών MDA-MB-231 και MDA-MB-468 οι οποίοι εξέφραζαν σταθερά το γονίδιο του MIR3158. Αυτές οι κυτταρικές σειρές του καρκίνου του μαστού είναι ιδιαίτερα διεισδυτικές. Σε όλους τους κλώνους και των δυο κυτταρικών σειρών που εξέφραζαν το MIR3158 παρατηρήσαμε πτώση στην ικανότητα πολλαπλασιασμού και την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κλώνων, συγκριτικά με τους αντίστοιχους αρνητικούς μάρτυρες. Ομοίως, σε in vivo πειράματα παρατηρήθηκε η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του γονιδίου MIR3158 σε όλους τους κλώνους και των δυο κυτταρικών σειρών, μετά από 11 βδομάδες που διήρκησε η πειραματική διαδικασία. Επιπλέον, κάνοντας χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής, καταφέραμε να προσδιορίσουμε και να χαρακτηρίσουμε το ομόλογο γονίδιο MIR3158 στο ποντίκι. Ονομάσαμε το γονίδιο αυτό MIR3158Like, το οποίο και κλωνοποιήσαμε σε έναν φορέα έκφρασης και διαμολύναμε κύτταρα καρκινικής σειράς Α5 του ποντικού. Καταφέραμε να προσδιορίσουμε δύο νέα ώριμης μορφής miRNAs στο ποντίκι, δηλαδή mmu-miR-3158L-1 και mmu -miR-3158L-2. Τέλος, με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής καταφέραμε να προβλέψουμε ότι αυτά τα ώριμα miRNAs του ποντικού στοχεύουν άμεσα το mRNA της βιμεντίνης ποντικιού και δείξαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης της βιμεντίνης του ποντικού μειώθηκαν μετά την έκφραση του νέου γονιδίου MIR3158Like του ποντικού

Functions, divergence and clinical value of TAp73 isoforms in cancer.

The p73 gene encodes the tumour suppressive full-length TAp73 and N-terminal-truncated DNp73 isoforms that act as dominant negative inhibitors of TAp73. The overall effect of p73 in oncogenesis is thought to depend on the TAp73 to DNp73 isoforms' ratio. TAp73 isoforms include a number of C-terminal variants as a result of alternative splicing in 3'-end. TAp73 isoforms protect cells from oncogenic alterations in a multifaceted way since they are implicated in the suppression of all demonstrated hallmarks and enabling characteristics of cancer. Their best established role is in apoptosis, a process which seems to be differently affected by each TAp73 C-terminal variant. Based on previous findings and our thorough bioinformatics analysis, we highlight that TAp73 variants are functionally non-equivalent, since they present major differences in their transactivation efficiencies, protein interactions, response to DNA damage and apoptotic effects that are attributable to the primary structure of their C terminus. In this review, we summarise these differences and we unveil the link between crucial C-terminal motifs/residues and the oncosuppressive potential of TAp73 isoforms, emphasising on the importance of considering C terminus during the development of p73-based anticancer biologics

ZEB1/miR-200c/AGR2: A New Regulatory Loop Modulating the Epithelial-Mesenchymal Transition in Lung Adenocarcinomas

Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a process involved not only in morphogenesis and embryonic development, but also in cancer progression, whereby tumor cells obtain a more aggressive metastatic phenotype. Anterior gradient protein 2 (AGR2) maintains the epithelial phenotype and blocks the induction of EMT, thus playing an undeniable role in tumor progression. However, the mechanism through which AGR2 expression is regulated, not only during EMT, but also in the early stages of cancer development, remains to be elucidated. In the present study, we show an inverse correlation of AGR2 with ZEB1 (zinc finger enhancer binding protein, EF1) that was verified by analysis of several independent clinical data sets of lung adenocarcinomas. We also identified the ZEB1 binding site within the AGR2 promoter region and confirmed AGR2 as a novel molecular target of ZEB1. The overexpression of ZEB1 decreased the promoter activity of the AGR2 gene, which resulted in reduced AGR2 protein level and the acquisition of a more invasive phenotype of these lung cancer cells. Conversely, silencing of ZEB1 led not only to increased levels of AGR2 protein, but also attenuated the invasiveness of tumor cells. The AGR2 knockout, vice versa, increased ZEB1 expression, indicating that the ZEB1/AGR2 regulatory axis may function in a double negative feedback loop. In conclusion, we revealed for the first time that ZEB1 regulates AGR2 at the transcriptional level, while AGR2 presence contributes to ZEB1 mRNA degradation. Thus, our data identify a new regulatory mechanism between AGR2 and ZEB1, two rivals in the EMT process, tightly associated with the development of metastasis

Unravelling a p73-regulated network: The role of a novel p73-dependent target, MIR3158, in cancer cell migration and invasiveness

The transcription factor p73 is homologous to the well-known tumor-suppressor p53. The p73-regulated networks are of significant clinical interest, because they may substitute for impaired p53-regulated networks which are commonly perturbed in cancer. Herein, we aimed to characterize a p73-regulated network that mediates cell migration and restores anti-oncogenic responses in p53-mutant cancer cells. In this study, we demonstrate that p73 regulates a network underlying cell migration, which consists of MIR34A/MIR3158/vimentin/β-catenin/lef1. The p73 isoforms transactivate the miRNA components (MIR34A/MIR3158) of this network, which in turn, downregulate their EMT-related mRNA co-targets (vimentin/β-catenin/lef1) to decrease cell-migration. Modulation of this network, by increasing the level of the novel p73-dependent target MIR3158, was found to induce anti-oncogenic/anti-invasive responses in p53-mutant cancer cells. Taken together, a p73-regulated, MIR3158-containing, network restores anti-invasive phenotypes in p53-mutant cancer cells; this property could be exploited towards the development of anticancer therapeutics. © 2016 Elsevier Ireland Lt

ΔNp63α expression induces loss of cell adhesion in triple-negative breast cancer cells

Background: p63, a member of the p53 protein family, plays key roles in epithelial development and carcinogenesis. In breast cancer, p63 expression has been found predominantly in basal-A (epithelial-type) triple-negative breast carcinomas (TNBC). To investigate the functional role of p63 in basal-A TNBC, we created MDA-MB-468 cell lines with inducible expression of the two major N-terminal p63 isoforms, TAp63α and ΔNp63α. Results: TAp63α did not have significant effect on gene expression profile and cell phenotype, whilst the main effect of ΔNp63α was reduction of cell adhesion. Gene expression profiling revealed genes involved in cell adhesion and migration whose expression relies on overexpression of ΔNp63α. Reduced cell adhesion also led to decreased cell proliferation in vitro and in vivo. Similar data were obtained in another basal-A cell line, BT-20, but not in BT-549 basal-B (mesenchymal-like) TNBC cells. Conclusions: In basal-A TNBC cells, ΔNp63α has much stronger effects on gene expression than TAp63α. Although p63 is mentioned mostly in connection with breast cell differentiation and stem cell regulation, we showed that a major effect of p63 is regulation of cell adhesion, a process important in metastasis and invasion of tumour cells. That this effect is not seen in mesenchymal-type TNBC cells suggests lineage-dependent functions, mirroring the expression of ΔNp63α in primary human breast cancers. © 2016 The Author(s)

Regulated in development and DNA damage responses 1 (REDD1) links stress with IL-1β-mediated familial Mediterranean fever attack through autophagy-driven neutrophil extracellular traps

Background: Familial Mediterranean fever (FMF) is an IL-1β-dependent autoinflammatory disease caused by mutations of Mediterranean fever (MEFV) encoding pyrin and characterized by inflammatory attacks induced by physical or psychological stress. Objective: We investigated the underlying mechanism that links stress-induced inflammatory attacks with neutrophil activation and release of IL-1β-bearing neutrophil extracellular traps (NETs) in patients with FMF. Methods: RNA sequencing was performed in peripheral neutrophils from 3 patients with FMF isolated both during attacks and remission, 8 patients in remission, and 8 healthy subjects. NET formation and proteins were analyzed by using confocal immunofluorescence microscopy, immunoblotting, myeloperoxidase-DNA complex ELISA, and flow cytometry. Samples from patients with Still's disease and bacterial infections were used also. Results: The stress-related protein regulated in development and DNA damage responses 1 (REDD1) is significantly overexpressed during FMF attacks. Neutrophils from patients with FMF during remission are resistant to autophagy-mediated NET release, which can be overcome through REDD1 induction. Stress-related mediators (eg, epinephrine) decrease this threshold, leading to autophagy-driven NET release, whereas the synchronous inflammatory environment of FMF attack leads to intracellular production of IL-1β and its release through NETs. REDD1 in autolysosomes colocalizes with pyrin and nucleotide-binding domain, leucine-rich repeat/pyrin domain-containing 3. Mutated pyrin prohibits this colocalization, leading to higher IL-1β levels on NETs. Conclusions: This study provides a link between stress and initiation of inflammatory attacks in patients with FMF. REDD1 emerges as a regulator of neutrophil function upstream to pyrin, is involved in NET release and regulation of IL-1β, and might constitute an important piece in the IL-1β-mediated inflammation puzzle. © 2017 American Academy of Allergy, Asthma & Immunology