Regeneração de plantas de laranja 'Pêra' via organogênese in vitro Regeneration of 'Pera' sweet orange plants through in vitro organogenesis

O objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo eficiente de regeneração de plantas in vitro, via organogênese em explante juvenil de laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck), para atender futuros trabalhos de transformação genética. Segmentos de epicótilo utilizados como explantes foram introduzidos em meio de cultura MT. A fim de maximizar a regeneração de plantas in vitro, foram realizados experimentos para avaliar as concentrações de BAP no meio de cultivo (0, 1, 2, 3 ou 4 mg L-1), tamanho (0,25, 0,5 ou 1 cm), polaridade (basal, medial e apical), posição (horizontal ou vertical), condições de luminosidade (fotoperíodo de 16 horas e escuro por 30 dias) e seccionamento nas extremidades dos explantes, bem como melhores condições para garantir plantas enraizadas (meio MT, MT/2, com ou sem auxina e microenxertia). A combinação de 3 mg L-1 de BAP com segmentos de 0,25 cm de comprimento foi eficiente na resposta organogenética. Segmentos apicais e mediais apresentaram melhores resultados do que os basais. O cultivo dos segmentos na posição horizontal, em fotoperíodo de 16 horas, foi mais eficiente do que na posição vertical. Não houve melhora na indução da organogênese in vitro, quando foram seccionadas as extremidades dos explantes. A microenxertia assegurou 100% de brotos enraizados.<br>The objective of this work was to establish an efficient protocol for in vitro regeneration of plants through organogenesis of sweet orange 'Pera' (Citrus sinensis L. Osbeck) juvenile explants, in order to give support for future studies of genetic transformation. Epicotyl segments used as explants were introduced in MT culture media. To maximize the regeneration of in vitro plants, experiments were performed to evaluate different concentrations of BAP in the culture media (0, 1, 2, 3 or 4 mg L-1), size (0.25, 0.5 or 1 cm), polarity (basal, medium, and apical), position (horizontal or vertical), luminosity conditions (photoperiod of 16 hours, and darkness for 30 days), and incision of the segment ends. In addition, better conditions for obtaining rooted plants (culture media MT, MT/2, with and without auxin and micrografting) were studied. The combination of 3 mg L-1 BAP with segments of 0.25 cm length was efficient for the organogenetic response. Segment apices and mediums were more efficient comparing to the basal parts. Culturing the segments in the horizontal position, with a photoperiod of 16 hours, was more efficient than in the vertical position. There was no improvement in the induction of in vitro organogenesis, when the explant ends were incised. Micrografting assured 100% of rooted shoots

Agrobacterium-mediated transformation of Citrus sinensis and Citrus limonia epicotyl segments Transformação genética em Citrus sinensis e Citrus limonia mediada por Agrobacterium tumefaciens a partir de segmentos de epicótilo

Genetic transformation allows the release of improved cultivars with desirable characteristics in a shorter period of time and therefore may be useful in citrus breeding programs. The objective of this research was to establish a protocol for genetic transformation of Valencia and Natal sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck). Epicotyl segments of germinated in vitro plantlets (three weeks in darkness and two weeks in a 16-h photoperiod) were used as explants. These were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA-105 and different experiments were done to evaluate the transformation efficiency: explants were co-cultivated with Agrobacterium for one, three or five days; explants were incubated with Agrobacterium suspension for 5, 10, 20 or 40 minutes; co-cultivation medium was supplemented with acetosyringone at 0, 100 or 200 &micro;mol L-1; Explants ends had a longitudinal terminal incision (2-3 mm); co-cultivation temperatures of 19, 23 or 27&deg;C were imposed. The experimental design was completely randomized in all experiments with five replications, each consisted of a Petri dish (100 x 15 mm) with 30 explants and resulted in a total of 150 explants per treatment. Longitudinal terminal incision in the explant ends did not improve shoot regeneration. However, transgenic plants of all three cultivars were confirmed from explants that had been subjected to inoculation time of 20 minutes, co-culture of three days at 23-27&deg;C, in the absence of acetosyringone.<br>A transformação genética permite produzir cultivares com características específicas e pode, dessa forma ser associada a programas de melhoramento de citros. O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos de transformação genética para as laranjas doce 'Valência' e 'Natal' (Citrus sinensis L. Osbeck), bem como para o limão 'Cravo'(Citrus limonia L. Osbeck). Segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro (três semanas no escuro e duas semanas sob fotoperíodo de 16h) foram utilizados como explantes. Estes foram co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105), realizando-se vários experimentos para avaliar a eficiência do processo de transformação genética: explantes co-cultivados por um, três e cinco dias; tempo de inoculação com a bactéria de 5, 10, 20 e 40 minutos; co-cultivo em meio de cultura contendo 0, 100 e 200 mimol L-1 de acetoseringona; Incisão longitudinal (2-3 mm) nas extremidades do explante; temperatura de co-cultivo 19, 23 e 27&deg;C. Todos os experimentos consistiram de cinco repetições por tratamento, sendo cada repetição representada por uma placa de Petri contendo 30 explantes, perfazendo um total de 150 explantes por tratamento. Plântulas transgênicas dos três cultivares foram obtidas utilizando-se tempo de inoculação de 20 minutos, co-cultivo com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105) por três dias, na ausência de acetoseringona no meio de cultura de co-cultivo e temperatura de co-cultivo de 23-27&deg;C. A incisão longitudinal na extremidade do explante favoreceu à organogênese in vitro, mas quando co-cultivado com Agrobacterium não houve regeneração de brotações