Síntesis de compuestos organoselénicos derivados del hidroxitirosol. Determinación de su actividad como antioxidantes

Texto completo descargado desde Teseo1. Introducción Los polifenoles son una amplia familia de compuestos que se encuentran, entre otros alimentos, en la fruta, la verdura, el vino, el té, el cacao y el aceite de oliva virgen extra y que muestran una marcada actividad antioxidante, que se traduce en una contrastada actividad en la prevención de enfermedades cardiovasculares, cáncer, enfermedades neurodegenerativas, diabetes u osteoporosis . Uno de los polifenoles más efectivos como antioxidante y atrapador de radicales libres es el hidroxitirosol (HT), 1, 4-(2-hidroxietil)-1,2-bencenodiol, un fenol simple que predomina en el olivo (Olea europea). La industria del aceite de oliva genera grandes cantidades de residuos (alperujo) que contienen una variedad de polifenoles entre los que destaca el HT. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha desarrollado bajo patente un sistema para su purificación a escala semiindustrial, que permite obtenerlo con un alto grado de pureza (95%-99%) y a bajo coste. Un inconveniente importante es que el hidroxitirosol es químicamente inestable, a menos que se preserve seco en ausencia de aire y luz, por lo que la eficiencia de esta molécula añadida en su forma nativa a matrices biológicas no se puede garantizar; tampoco se puede añadir a preparados lipofílicos debido a su relativa polaridad. En base a estas consideraciones, sería útil producir derivados del hidroxitirosol más estables y que conservaran sus diversas propiedades biológicas, utilizando como materia prima el HT aislado del alperujo. Los compuestos que incluyen selenio en su estructura son objeto de controversia. Se ha demostrado el envenenamiento de animales por plantas acumuladoras de selenio en suelos seleníferos. Sin embargo, a mediados de los años 50 se consideró un nutriente esencial presente en algunas selenoproteínas como glutatión peroxidasa, implicada en un mecanismo de autodefensa contra el estrés oxidativo. Estudios epidemiológicos y clínicos en humanos, así como ensayos de laboratorio, apoyan el papel protector del selenio frente al desarrollo del cáncer. A lo largo del periodo de disfrute de la beca se ha desarrollado una amplia investigación que se puede englobar en los siguientes apartados: - Síntesis de dopamina a partir de hidorxitirosol. Síntesis de gluco y galactoderivados de dopamina. - Síntesis de selenoureas y selenuros de hidroxitirosol. - Síntesis de tioureas derivadas de hidroxitirosol y reacciones de oxidación de las mismas con dicloro-diciano-quinona (DDQ). - Reacciones de aldehídos catalizadas por el sistema CeCl3.7H2O-NaI-SiO2 - Evaluación de las propiedades biológicas in vitro y ex vivo de los compuestos sintetizados. 2. Resultados y discusión 2.1. Síntesis de dopamina y derivados glicosilados de dopamina 2.1.1. Síntesis de dopamina a partir de hidroxitirosol La síntesis de dopamina partiendo del hidroxitirosol (1) se ha abordado por dos vías diferentes: a) Por una parte, con objeto de evitar reacciones secundarias debida a las reactividad del fragmento de catecol, fácilmente oxidable, hemos llevado a cabo la protección de los hidroxilos aromáticos por reacción con ¿,¿-dicloro-o-xilileno para dar 2. Por tratamiento de 2 con tetrabromuro de carbono y trifenilfosfina se obtuvo el derivado bromado 3, que es fácilmente convertido en el azido derivado 4 por tratamiento con azida sódica en DMF. Por hidrogenación catalítica a temperatura ambiente, en presencia de ácido clorhídrico, se consigue la reducción del grupo azido y la eliminación simultanea del grupo protector (Esquema 1), obteniéndose así el hidrocloruro de dopamina (5), que se aísla por precipitación en etanol-éter. Esquema 1 b) Por otra parte, hemos obtenido el clorhidrato de la dopamina (5) en solo tres pasos y según se indica en el esquema 2, añadiendo al medio de reacción ascorbato sódico que evita la oxidación del fragmento de catecol. Los rendimientos obtenidos por ambos procedimientos son similares, aunque en este segundo procedimiento hay una etapa menos. Esquema 2 2.1.2. Síntesis de glicósidos de la dopamina A partir del hidroxitirosol (1), por tratamiento con cloruro de tosilo en piridina se obtuvo el compuesto tri-O-tosilado 8. De los tres grupos tosiloxi, sólo el que está sobre la cadena lateral se desplaza por el grupo azido para dar 9. El tratamiento de 9 con potasa metanólica rindió una mezcla de los regioisómeros 10 y 11 al 50%, según se deduce de los espectros de RMN, no separables cromatográficamente. (Esquema 3) Esquema 3 La preparación de los glicosilderivados de 10 y 11 se realizó por tratamiento de la mezcla de 10 y 11 con el bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-¿-D-glucopiranosilo, que rindió los ¿-D-glucopiranosil derivados 12 y 13, y el bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-¿-D-galactopiranosilo, que rindió los derivados 14 y 15. La des-O-acetilación y des-O-tosilación de estos compuestos se produce simultáneamente por tratamiento con potasa metanólica. La reducción catalítica en medio ácido de los glicosil derivados desprotegidos conduce a la formación de los glicosil derivados de dopamina 20-23, donde la presencia del azúcar pudiera ejercer una acción moduladora de la actividad biológica de la dopamina (Esquema 4). Esquema 4 2.2. Selenoderivados de hidroxitirosol 2.2.1. Selenoureas derivadas de hidroxitirosol Con objeto de combinar las propiedades antioxidantes del fragmento de catecol del hidroxitirosol con las que presentan los compuestos organoselénicos, hemos preparado selenoureas O-protegidas y no protegidas derivadas de la dopamina. Para las protegidas se partió de un derivado comercial del hidroxitirosol, el bromuro de 2-(3,4-dimetoxifenil)etilo 24, que fue convertido en el correspondiente azido derivado 25. La hidrogenación catalítica de 25 condujo a la formación de la dopamina di-O-metilada 26, y de un producto secundario con la estructura dimérica 27. (Esquema 5) Esquema 5 La amina protegida 26 o la dopamina 5 reaccionaron con los isoselenocianatos 28, 29 y 30, sintetizados previamente a partir de sus correspondientes arilaminas según un procedimiento desarrollado previamente por nuestro grupo de investigación. De esta manera hemos preparado las selenoureas 31-36, con rendimientos casi cuantitativos (Esquema 6) Esquema 6 La misma reación, llevada a cabo con el diisoselenocianato 37 condujo a la obtención las diselenoureas 38 y 39 (Esquema 7). Esquema 7 2.2.2. Síntesis de selenuros y diselenuros del hidoxitirosol. También hemos sintetizado selenuros y diselenuros derivados del hidroxitirosol. Para ello, hemos preparado previamente selenuro sódico (Na2Se) y diselenuro sódico (Na2Se2) a partir del selenio elemental según el método descrito por Milton y col. Por reacción del bromuro de 3,4-dihidroxifeniletilo 24 con selenuro sódico y diselenuro sódico se obtuvieron respectivamente el selenuro 40 y el diselenuro 41. La desprotección con tribromuro de boro según el tratamiento descrito por Thahanovsky y col. de 41 rindió el selenuro 43, pero en el caso del monoselenuro 40 en lugar del monoselenuro correspondiente, se obtuvo un compuesto inesperado, al que en base a datos espectroscópicos se ha asignado la estructura del selenonio 42. (Esquema 8) Esquema 8 Una ruta alternativa para la obtención del diselenuro 43 consiste en la acetilación de los grupos hidroxilo de catecol en el bromoderivado 6, seguida de tratamiento con la sal de selenio y posterior desacetilación mediante catálisis básica con carbonato potásico. (Esquema 9) Esquema 9 Reacciones análogas se llevaron a cabo utilizando como grupo protector de los hidroxilos aromáticos el xilileno. Así, la reacción del compuesto 3 con selenuro y diselenuro sódico condujo a la formación de los selenuro y diselenuro O-protegidos 46 y 47 respectivamente. Todos los intentos de eliminación del grupo protector en 46 y 47 han sido hasta el momento infructuosos. (Esquema 10) Esquema 10 2.3. Síntesis de tioureas derivadas de la dopamina De forma análoga a la descrita en el apartado 2.2.1., hemos llevado a cabo la preparación de las tioureas 53-57, que portan el fragmento de catecol, por reacción del hidrocloruro de dopamina con los isotiocianatos 48-52. (Esquema 11) Esquema 11 El tratamiento de las tioureas 53-57 con DDQ (58), según el método propuesto por Land condujo a la formación de los derivados de 8,9-dihidro-5-tia-7-azo-benzocicloheptano 59-63, según se indica en el Esquema 12: Esquema 12 La oxidación de las tioureas 53-57 con DDQ dio como subproducto el difenol 61, que mostró la misma movilidad cromatográfica que las tiacepinas 59-63, por lo que su separación y purificación no fue factible. Para solventar ese problema, la mezcla de reacción se acetiló con anhídrido acético y piridina, obteniéndose los compuestos 65-69 y el diacetil-dicloro-difenil benceno 70. Los acetil derivados 65-69 pudieron ser así separados cromatográficamente del subproducto 70. La desacetilación con carbonato potásico de 65-69 produjo la eliminación selectiva de los acetatos unidos a los oxígenos aromáticos, pero no la del grupo acetilo unido al nitrógeno ureídico, obteniéndose así los derivados 71-75. (Esquema 13) Esquema 13 2.4. Reacciones de aldehídos catalizadas por el sistema CeCl3.7H2O-NaI-SiO2 Con objeto de aplicar como reactivo la combinación de CeCl3-NaI-SiO2, desarollado por Marcantoni y col., en la preparación de derivados del hidroxitirosol en ausencia de disolvente (Química verde), se ha llevado a cabo en colaboración con dicho profesor, un estudio del empleo de este catalizado en diferentes reacciones. Concretamente, a partir de derivados del benzaldehído y de nitroacetato de etilo se ha podido llegar en un solo paso y en ausencia de disolvente a los isoxazoles 74 y 75. (Esquema 14) Esquema 14 2.5. Ensayos de capacidad antioxidante El objetivo principal de los ensayos de antioxidación es estudiar la actividad antioxidante de las estructuras derivadas del hidroxitirosol anteriormente descritas, obtenidas vía sintética. También se estudió por primera vez el efecto del hidroxitirosol sobre la enzima tirosinasa y su comparación con los derivados de hidroxitirosol que incluyen selenio en su molécula. La actividad inhibidora de otros derivados con selenio (carbohidratos conteniendo selenio, derivados de selenoureas,¿) había sido ya demostrada por otros autores. Para investigar la actividad antioxidante de los compuestos se han seguido las recomendaciones que existen hoy en día de utilizar al menos dos diferentes tipos de ensayos y también de combinar ensayos como el poder reductor o el de secuestro de radicales libres, tales como DPPH y ABTS, y ensayos que están asociados a la peroxidación de lípidos. En relación a estos últimos se han seguido los primeros estadíos de la peroxidación de lípidos mediante el método del tiocianato férrico y el estado final de la peroxidación mediante el método del ácido tiobarbitúrico (TBA). Se realizaron también ensayos ex vivo midiendo la capacidad de los nuevos productos sintéticos para inhibir la peroxidación lipídica en microsomas de hígados de ratas alimentadas con una dieta deficiente en vitamina E. 2.5.1. Ensayos in vitro Se evaluaron las actividades antioxidantes de los compuestos obtenidos por síntesis orgánica a partir del hidroxitirosol (1). Dentro de los selenoderivados se estudiaron tres derivados selenoureídos 34, 35 y 36, el diselenuro 43 y el selenonio 42 En los análisis llevados estos compuestos se comparan con las vitamina E (81) y vitamina C (82), ampliamente usadas por sus características antioxidantes y de origen natural. También con el hidroxitirosol (1) y 3,4-dihidroxifenil glicol (83), recuperados de los alperujos y con una importante actividad antioxidante; con el trolox (84), análogo a la vitamina E soluble en agua, que se utiliza como estándar, que se utiliza en muchos de los ensayos como referencia a la hora de expresar los resultado en términos de ¿Capacidad Antioxidante Equivalente al Trolox¿ (CAET). Y con la dopamina (5), compuesto de estructura similar al hidroxitirosol en el que el grupo hidroxilo se ha sustituido por un grupo amino, que posee una marcada importancia biológica como neurotransmisor (Esquema 15). Esquema 1 Además se probaron también las tioureas no comerciales 53-57. Se prepararon disoluciones madre de los compuestos a ensayar y a partir de ellas los distintos patrones de ensayo, cuyas concentraciones varían en función del experimento, si bien el hidroxitirosol, el 3,4-dihidroxifenilglicol y la dopamina se disolvieron en agua, la vitamina C, la vitamina E, las selenoureas 34, 35 y 36 y el selenonio 42, en metanol, y el resto en agua-metanol en proporción 1:1. Para investigar la actividad antioxidante de los compuestos se han seguido las recomendaciones que existen hoy en día de utilizar al menos dos diferentes tipos de ensayos y también de combinar ensayos como el poder reductor o el de secuestro de radicales libres, tales como DPPH y ABTS, y ensayos que están asociados a la peroxidación de lípidos. En relación a estos últimos se han seguido los primeros estadíos de la peroxidación de lípidos mediante el método del tiocianato férrico y el estado final de la peroxidación mediante el método del ácido tiobarbitúrico (TBA). Poder reductor La capacidad reductora de un compuesto puede ser un buen indicador de su potencial antioxidante. Con este ensayo se muestra la capacidad de donar hidrógeno o electrones de cada uno de los compuestos anteriores. El fundamento de este método es la reacción redox mediante la cual el Fe (III) se reduce a Fe (II) a expensas de un reductor, y el estudio colorimétrico del complejo formado por el Fe (II) con bipiridilo que absorbe a 490 nm. Para expresar los resultados se establece una curva de calibración con cantidades conocidas de trolox y el poder reductor de los compuestos se expresa en equivalentes Trolox (mM). Las líneas dosis-respuesta de todos los compuestos se ajustan a un modelo lineal con un r ¿ 0.90, siendo calculado el poder reductor por su ecuación de regresión individual. En Figura 1 se comparan los valores absolutos de poder reductor que se obtuvieron en los ensayos. El hidroxitirosol (1) mostró un poder reductor de 1.11 mM trolox, similar al glicol (1.18 mM trolox), y a la vitamina C (1.01 mM trolox). Los valores que presentaron las selenoureas 34, 35 y 36 fueron 2.5, 1.8 y 2.1 veces superiores al hidroxitirosol respectivamente, aunque en este sentido más interesantes fueron los selenoderivados 43 (5.0) y 42 (3.7). (Tabla 1) Actividad antirradical, captación de radicales DPPH y ABTS La capacidad de secuestro de radicales libres, los cuales inician o propagan la peroxidación de lípidos, también es un importante mecanismo antioxidante. El método del DPPH (1,1-difenil-2-pricrilhidrazil) es un método simple y altamente sensible que está basado en que el DPPH*, radical estable en disolución, acepta átomos de hidrógeno procedente de los antioxidantes neutralizando su carácter de radical libre. El efecto antioxidante es proporcional a la desaparición del DPPH* en los compuestos ensayados. La correlación entre concentración de antioxidante y descenso en DPPH* fue alta en todos los casos r ¿ 0.90. Los resultados se pueden expresar en comparando las pendientes de las rectas obtenidas con la correspondiente al Trolox (TEAC). Los mayores valores se obtuvieron para el diselenuro 43, el selenonio 12 y la selenourea 35. También puede representarse la EC50, la concentración efectiva (mM) de los compuestos ensayados necesaria para disminuir en un 50% la concentración inicial del radical DPPH* (Figura 2). En todos los casos la actividad antiradical de los derivados (valores de EC50 más bajo indican mayor actividad antioxidante) superan ampliamente a la de la vitamina E (81), son del orden del hidroxitirosol (1), siendo la actividad más importante la de la dopamina (5). (Tabla 2). Más notable es la diferencia de actividad antirradical en el caso del radical catión estable ABTS*+ que se obtiene por reacción del 2,2'-azinobis-(ácido 3-etilbenzotiazolin 6- sulfónico) con K2S2O8. En este caso la actividad antioxidante de los productos se determina por la decoloración del ABTS*+ que producen. Los resultados se pueden expresar igual en equivalentes Trolox (TEAC) o en EC50. Ambos ensayos de captación de radicales libres DPPH y ABTS se evalúan frente a soluciones estándar de trolox 30¿250 µM. El procedimiento en el caso del ABTS consistió en crear primero tres rectas patrón para el trolox (84) a tres longitudes de onda diferentes, 415 nm, 655 nm y 750 nm. Las pendientes de las rectas obtenidas se utilizaron para calcular los equivalente de trolox (TEAC) (Pendiente antioxidante/Pendiente trolox), y expresando el resultado como una media del valor a esas tres longitudes de onda. La capacidad antioxidante total del compuesto que está bajo estudio es expresada en equivalentes trolox (TEAC), que es definido como la concentración de un antioxidante que da el mismo porcentaje de cambio de absorbancia para DPPH o ABTS que 1 mM de trolox. La capacidad de captación de estos radicales por parte de los antioxidantes obtenidos por vía sintética es mayor que en el caso de vitamina E (81) e hidroxitirosol (1). Además de 42 y 43, también la selenourea 36 y la tiourea 56 superan en 5 veces la capacidad de captación de radicales ABTS del trolox (84). El resto de derivados sintéticos del hidroxitirosol muestran un TEAC entre 2 y 3.5 veces superior a 84, lo que pone de manifiesto el elevado poder antirradical de estas moléculas. Los valores más bajos obtenidos por los compuestos en los ensayos DPPH frente al método ABTS refleja la baja fuerza oxidante del radical DPPH. El radical ABTS parece más reactivo que el radical DPPH* y mientras que la reacción con DPPH* incluye una transferencia de átomos de hidrógeno, en el caso de la reacción con ABTS esta incluye un proceso de transferencia de electrones. Peroxidación de lípidos y productos de oxidación secundarios en los ensayos de actividad antioxidantes Ensayo del tiocianato férrico (TCF) En este ensayo se inicia la reacción de oxidación de un ácido graso insaturado como es el ácido linoléico en emulsión mediante la adición de 2,2'-azo-bis(2-amidinopropano) (ABAP), que produce radicales libres del tipo peroxilos de forma constante hasta formar hidroxiperóxidos durante el estado inicial de oxidación. Al añadir antioxidantes al medio, éstos competirán por los radicales, protegiendo al linoleico. La reacción determina los niveles de hidroxiperóxido lipídico de forma indirecta mediante un método colorimétrico. Al añadir tiocianato amónico y cloruro ferroso, el Fe(II) reacciona con los hidroperóxidos que se forman en la oxidación del ácido linoléico, pasando a Fe(III), que forma un complejo coloreado con los iones tiocianato. A menor formación de hidroperóxidos menos color, y por tanto menor absorbancia, siguiendo una curva del tipo y = a + b¿x para todos los compuestos ensayados con un r ¿ 0.90. De la ecuación de esa curva puede extraerse el EC50, es decir, la concentración mM de antioxidante que habría que añadir para inhibir la oxidación de linoleico un 50%. Valores bajos del EC50 indican una elevada capacidad para disminuir la oxidación del ácido linoleico. Los selenoderivados 42 y 43 vuelven a ser los más significativos, pues inhiben esta reacción con una concentración hasta diez veces menor que el hidroxitirosol. No obstante, los estándares vitamina E (81) y trolox (84) testados aportaron importantes valores en este ensayo. El diselenuro 43 inhibe la oxidación primaria hasta en un 80%, situándose las selenoureas 34-36, y las tioureas 53-57 entre el 30 y 50%, superando el 20% que inhibe el hidroxitirosol. (Tabla 4) Inhibición de la oxidación secundaria por el método del linoleico/TBA Al igual que en el caso anterior, las propiedades antioxidantes de los compuestos son probados en presencia de un inductor de la peroxidación. El ácido linoleico es oxidado con ABAP en un calentamiento prolongado a 50 ºC durante 24 horas y los productos finales o secundarios de esta reacción, como el malonaldehído, se hacen reaccionar con ácido tiobarbitúrico formando un compuesto coloreado, que puede ser detectado espectrofotométricamente. El grado de coloración indica la actividad del antioxidante que se mide por el descenso de absorción a 540 nm. El análisis de regresión de las curvas dosis-respuesta para los compuestos ensayados confirma que no es un modelo lineal sino que se ajusta a y = a + b¿x, con un r ¿ 0.90, de la que se extraen, igual que anteriormente, los valores de EC50. En este caso se necesitan concentraciones menores para evitar las reacciones de oxidación secundaria. En este menor rango de concentraciones el comportamiento de los antioxidantes es análogo a la inhibición de la oxidación primaria, siendo la concentración necesaria en torno a cuatro veces menor que la del hidroxitirosol. 2.5.2. Efecto sobre la actividad de la tirosinasa de hongos in vitro Se estudiaron las características inhibidoras sobre la tirosinasa de hongo de los compuestos sintetizados, conteniendo átomos de selenio en su molécula (42 y 43) y se compararon con las del hidroxitirosol natural de donde proceden. Este enzima cataliza las primeras dos reacciones de la síntesis de la melanina, la hidroxilación de la L-tirosina para dar 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y la oxidación de la L-DOPA a dopaquinona. Esta quinona es altamente reactiva y puede polimerizar espontáneamente a melanina. Los efectos de los compuestos 42 y 43, sobre las actividades de monofenolasa, utilizando L-tirosina como sustrato y de difenolasa sobre L-DOPA, se siguieron mediante la inhibición de la formación del dopacromo mediante medidas espectrofotométricas. Cuando la reacción enzimática se lleva a cabo con L-

Choline chloride derivative-based deep eutectic liquids as novel green alternative solvents for extraction of phenolic compounds from olive leaf

In the presented study, a new methodology based on the use of deep eutectic solvents (DESs) and microwave-assisted extraction (MAE) and subsequent analysis by HPLC-DAD-ESITOF- MS was proposed for the extraction of phenolic compounds from olive leaf. Nine different DESs, using choline chloride as hydrogen bond acceptor in combination with different hydrogen bond donors (four polyalcohols, three organic acids, one sugar and urea), were firstly scanned. A total of 48 phenolic compounds were identified in the olive leaf using HPLC-DAD-ESI-TOF-MS. Experimental results and multivariate data analysis pointed to choline chloride-ethyleneglycol as being the most effective within the tested DESs, showing extraction yields similar to those exhibited by conventional solvents. A Box-Behnken Design and response surface methodology were applied with the aim to optimize the main parameters involved in the extraction process. The optimal extraction conditions were 79.6 ºC of temperature, 43.3% of water and 16.7 min of irradiation time. Correlation coefficients (R2> 0.98) indicated a good relationship between experimental data and the fitted quadratic term models. Results indicated that DESs could be a sustainable alternative to traditional solvents for the extraction of bioactive compounds among many other applications.Thanks to the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) (AGL2015-67995-C3-2-R) and the Andalusian Regional Government Council (P11-CTS-7625). M.E. Alañón also thanks to Ministry of Education and Competitiveness for the postdoctoral contract Juan de la Cierva-Incorporación (IJCI-2014-21664)

A Box-Behnken Design for Optimal Green Extraction of Compounds from Olive Leaves That Potentially Activate the AMPK Pathway

The author B.M.-G. is grateful to the National Youth Guarantee System for the grant for young research personnel. Also, the authors are grateful to the University of Granada for a “Contrato Puente” postdoctoral contract (S.P.-M.).Olive leaves contain bioactive compounds that have been shown to activate AMP-activated protein kinase (AMPK), which decreases intracellular lipid accumulation. Microwave-assisted extraction (MAE) is a green extraction technique that is frequently used in the recovery of phenolic compounds from plants. Thus, in this study, a Box-Behnken design was used to optimize MAE conditions such as temperature, percentage of ethanol and extraction time to obtain the maximum content of total compounds and compounds that activate AMPK. To this end, all extracts were characterized by High-Performance Liquid Chromatography Coupled to Electrospray Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (HPLC-ESI-TOF-MS). The optimum conditions to obtain the highest content of total compounds were 123 ◦C, 100% of ethanol/water (v/v) and 23 min, whereas the optimum conditions for the highest amount of compounds that activate AMPK were 111 ◦C, 42% of ethanol/water (v/v) and 23 min. Thus, a multi-analysis by desirability was carried out to establish MAE optimal conditions for both responses. The optimum conditions were 111 ◦C, 100% EtOH and 23 min with a desirability of 0.97, which means that the responses are close to their individual optimal values. As a result, the olive leaf extract obtained at these optimal MAE conditions has great potential to be effective in the treatment of obesity.Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) AGL2015-67995-C3-2Ministry of Science, Innovation and Universities RTI2018-096724-B-C22Ministry of Economy, Knowledge, Business and University of the Junta de Andalucia B-AGR-466-UGR1

Determination of Polar Compounds in Guava Leaves Infusions and Ultrasound Aqueous Extract by HPLC-ESI-MS

Literature lacks publications about polar compounds content in infusion or guava leaves tea. Because of that, a comparison between different times of infusion and a conventional ultrasound aqueous extract was carried out. Several polar compounds have been identified by HPLC-ESI-MS and their antioxidant activity was evaluated by FRAP and ABTS assays. Four different classes of phenolic compounds (gallic and ellagic acid derivatives, flavonols, flavanones, and flavan-3-ols) and some benzophenones were determined. The quantification results reported that the order, in terms of concentration of the classes of polar compounds in all samples, was flavonols > flavan-3-ols > gallic and ellagic acid derivatives > benzophenones > flavanones. As expected, the aqueous extract obtained by sonication showed the highest content in the compounds studied. Significative differences were noticed about the different times of infusion and five minutes was the optimal time to obtain the highest content in polar compounds using this culinary method. All the identified compounds, except HHDP isomers and naringenin, were positively correlated with antioxidant activity.This work was funded by the Project cofinanced by FEDER-Andalucía 2007–2013 (Cod. 461100) and Andalusian Regional Government Council of Innovation and Science (P11-CTS-7625). The author Elixabet Díaz-de-Cerio also would like to thank the CEIBiotic for the “Ayudas a la Enseñanza Práctica” Grant (CADP2-71). Ana María Gómez-Caravaca and Vito Verardo thank the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) for “Juan de la Cierva” postdoctoral contract

From Olive Fruits to Olive Oil: Phenolic Compound Transfer in Six Different Olive Cultivars Grown under the Same Agronomical Conditions

Phenolic compounds are responsible of the nutritional and sensory quality of extra-virgin olive oil (EVOO). The composition of phenolic compounds in EVOO is related to the initial content of phenolic compounds in the olive-fruit tissues and the activity of enzymes acting on these compounds during the industrial process to produce the oil. In this work, the phenolic composition was studied in six major cultivars grown in the same orchard under the same agronomical and environmental conditions in an effort to test the effects of cultivars on phenolic composition in fruits and oils as well as on transfer between matrices. The phenolic fractions were identified and quantified using high-performance liquid chromatography-diode array detector-time-of-flight-mass spectrometry. A total of 33 phenolic compounds were determined in the fruit samples and a total of 20 compounds in their corresponding oils. Qualitative and quantitative differences in phenolic composition were found among cultivars in both matrices, as well as regarding the transfer rate of phenolic compounds from fruits to oil. The results also varied according to the different phenolic groups evaluated, with secoiridoids registering the highest transfer rates from fruits to oils. Moreover, wide-ranging differences have been noticed between cultivars for the transfer rates of secoiridoids (4.36%–65.63% of total transfer rate) and for flavonoids (0.18%–0.67% of total transfer rate). ‘Picual’ was the cultivar that transferred secoiridoids to oil at the highest rate, whereas ‘Changlot Real’ was the cultivar that transferred flavonoids at the highest rates instead. Principal-component analysis confirmed a strong genetic effect on the basis of the phenolic profile both in the olive fruits and in the oils.This research was partly funded by project P11-AGR-7301 of the Andalusian Regional Government Council of Innovation and Science and the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness. The analytical part was financially supported by Spanish Ministry of Education and Science (AGL2015-67995-C3) and the Andalusian Regional Government Council of Innovation and Science (P10-FQM-6563, P11-CTS-7625). The authors thank the International Olive Oil Council (IOC) for the grant (Ref.: T1 6-Doct 1/12) and the Ministry of Education and Competitiveness for the postdoctoral contract Juan de la Cierva (JCI-2012-12566)

Comparison of Two Stationary Phases for the Determination of Phytosterols and Tocopherols in Mango and Its By-Products by GC-QTOF-MS

Two different gas chromatography coupled to quadrupole-time of flight mass spectrometry (GC-QTOF-MS) methodologies were carried out for the analysis of phytosterols and tocopherols in the flesh of three mango cultivars and their by-products (pulp, peel, and seed). To that end, a non-polar column ((5%-phenyl)-methylpolysiloxane (HP-5ms)) and a mid-polar column (crossbond trifluoropropylmethyl polysiloxane (RTX-200MS)) were used. The analysis time for RTX-200MS was much lower than the one obtained with HP-5ms. Furthermore, the optimized method for the RTX-200MS column had a higher sensibility and precision of peak area than the HP-5ms methodology. However, RTX-200MS produced an overlapping between β-sitosterol and Δ5-avenasterol. Four phytosterols and two tocopherols were identified in mango samples. As far as we are concerned, this is the first time that phytosterols have been studied in mango peel and that Δ5-avenasterol has been reported in mango pulp. α- and γ-tocopherol were determined in peel, and α-tocopherol was the major tocopherol in this fraction (up to 81.2%); however, only α-tocopherol was determined in the pulp and seed. The peel was the fraction with the highest total concentration of phytosterols followed by seed and pulp, and “Sensación” was the cultivar with the highest concentration of total phytosterols in most cases. There were no significant differences between quantification of tocopherols with both columns. However, in most cases, quantification of phytosterols was higher with RTX-200MS than with HP-5ms column

Arteria coronaria derecha anómala que nace del tronco coronario izquierdo con curso entre los grandes vasos: manejo quirúrgico de un caso y revisión

ResumenLas anomalías de las arterias coronarias son alteraciones congénitas raras que en algunos casos, debido a su trayecto anómalo, pueden producir síntomas como la angina, síncopes o incluso la muerte súbita. Además, su manejo terapéutico no está bien establecido. Presentamos el caso de un varón de 64 años con clínica de dolor torácico y síncopes de repetición en el que se descubre una arteria coronaria única con una arteria coronaria derecha que nace del tronco coronario izquierdo y que discurre entre las grandes arterias. La compresión que ejercen estas estructuras justifica la clínica del paciente, por lo que se decide una actitud quirúrgica como terapia más adecuada consistente en la translocación de la arteria coronaria derecha a su seno de Valsalva correspondiente, evitando así la compresión producida por las grandes arterias y sobre todo la necesidad de realizar un bypass coronario. A los 7 meses de la intervención el paciente permanece asintomático.El manejo quirúrgico de las anomalías coronarias sintomáticas puede ser una alternativa segura sobre todo en los casos donde la anatomía coronaria permita evitar el bypass.AbstractAnomalies of the coronary arteries are rare congenital disorders that because of their anomalous course can produce symptoms in some cases, such as angina, syncope or even sudden death. Furthermore, their therapeutic management is not well established. The case is presented of a 64 year-old male with symptoms of chest pain and repeated syncope, in which a single coronary artery is discovered with a right coronary artery that originates from the left main coronary artery and runs between the great arteries. The compression exercised by these structures is responsible for the patient's clinical condition, thus a more appropriate therapy is decided, such as a surgical approach involving the translocation of the right coronary artery to the corresponding sinus of Valsalva. This prevents the compression produced by the great arteries, as well as the need for coronary bypass surgery. The patient is asymptomatic at seven months after surgery.The surgical management of symptomatic coronary anomalies can be a safe alternative, especially in cases in which the coronary anatomy helps to avoid a bypass

Exploratory Characterization of Phenolic Compounds with Demonstrated Anti-Diabetic Activity in Guava Leaves at Different Oxidation States

Psidium guajava L. is widely used like food and in folk medicine all around the world. Many studies have demonstrated that guava leaves have anti-hyperglycemic and anti-hyperlipidemic activities, among others, and that these activities belong mainly to phenolic compounds, although it is known that phenolic composition in guava tree varies throughout seasonal changes. Andalusia is one of the regions in Europe where guava is grown, thus, the aim of this work was to study the phenolic compounds present in Andalusian guava leaves at different oxidation states (low, medium, and high). The phenolic compounds in guava leaves were determined by HPLC-DAD-ESI-QTOF-MS. The results obtained by chromatographic analysis reported that guava leaves with low degree of oxidation had a higher content of flavonols, gallic, and ellagic derivatives compared to the other two guava leaf samples. Contrary, high oxidation state guava leaves reported the highest content of cyanidin-glucoside that was 2.6 and 15 times higher than guava leaves with medium and low oxidation state, respectively. The QTOF platform permitted the determination of several phenolic compounds with anti-diabetic properties and provided new information about guava leaf phenolic composition that could be useful for nutraceutical production