Mecanismos de regulación de la respuesta de las plantas a compuestos volátiles de origen microbiano

La tutora es Inmaculada Farrán Blanch.Las plantas son metaorganismos que regulan su desarrollo y metabolismo en respuesta a diferentes estímulos externos. Conviven con microorganismos emisores de compuestos que difunden a través del suelo tales como azúcares, proteínas, exopolisacáridos, sideróforos, ácidos grasos, ácidos orgánicos, aminoácidos y hormonas que modifican la fotosíntesis, el metabolismo y el crecimiento de las plantas (Philippot et al., 2013; De-la-Peña and Loyola-Vargas, 2014; Backer et al., 2018). Los microorganismos beneficiosos también emiten compuestos volátiles (VCs) que fomentan el crecimiento, la captación de nutrientes y la fotosíntesis, modulan la arquitectura de la raíz, activan la respuesta de defensa de la planta e incrementan su resistencia al estrés salino y la sequía (Ryu et al., 2003; Zhang et al., 2008; Splivallo et al., 2009; Zhang et al., 2009; Gutiérrez-Luna et al., 2010; Kanchiswamy et al., 2015; Park et al., 2015; Ledger et al., 2016). Estudios llevados a cabo por el grupo de investigación en el que he realizado mi tesis doctoral demostraron que las bacterias y los hongos fitopatógenos también emiten VCs con propiedades bioestimulantes (Sánchez-López et al., 2016b). Cambios en el crecimiento, la fotosíntesis, el desarrollo y el metabolismo de la planta inducidos por VCs microbianos están asociados a grandes variaciones en el transcriptoma, el proteoma y el redox-proteoma de la planta (Sánchez- López et al., 2016b; Ameztoy et al., 2019, 2021). Tales variaciones sugieren que la respuesta de la planta a los VCs microbianos está regulada tanto a nivel transcripcional como no-transcripcional. Con el fin de profundizar en los mecanismos que median la relación entre la planta y los microorganismos, en este trabajo investigué el papel que juega el transportador de hexosas fosfato plastidial (GPT2) inducible por VCs en la respuesta de la planta modelo de laboratorio Arabidopsis thaliana a VCs emitidos por el hongo fitopatógeno Altenaria alternata. Además, investigué el papel que juega en dicha respuesta el residuo de cisteína 95 de la fructosa bifosfatasa plastidial (cFBP1), un enzima del ciclo de Calvin-Benson cuya actividad está sujeta a cambios en el estado redox inducibles por la luz. En el capítulo 1 de esta tesis presento los resultados de mi investigación sobre el papel que juega GPT2 en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. Para realizar esta investigación, analicé y comparé el crecimiento, la fotosíntesis y el proteoma de plantas wild type (WT), mutantes carentes GPT2 (gpt2-1), mutantes carentes PGI1 (pgi1-2) y doble mutante pgi1-2gpt2-1 cultivadas en presencia o ausencia de VCs fúngicos. Además, caractericé la respuesta a estos compuestos de plantas pgi1-2/gpt2-1 que expresan GPT2 bajo el control de un promotor específico de haces vasculares. Finalmente, caractericé el patrón de expresión de GPT2 en plantas que expresan el gen reportero GUS bajo la acción de la secuencia promotora de GPT2. Los resultados obtenidos mostraron que, de manera similar a lo que ocurre en plantas WT, los VCs fomentan el crecimiento, la fotosíntesis y la acumulación de citoquininas activas y almidón en plantas pgi1-2 y gpt2-1. Tal respuesta fue reducida en plantas pgi1-2gpt2-1 y se revirtió a WT al expresar GPT2 en haces vasculares. Estudios comparativos de los proteomas de plantas pgi1-2 y pgi1-2gpt2-1 mostraron que GPT2 regula la expresión de proteínas relacionadas con la fotosíntesis. Es más, los estudios de expresión mostraron que GPT2 se expresa en haces vasculares y está sujeto a complejos mecanismos de regulación. Globalmente, los resultados presentados en este capítulo indican que en condiciones en las cuales la actividad de PGI está reducida, la respuesta de la planta a VCs microbianos conlleva una regulación de la expresión de proteínas relacionadas con la fotosíntesis a través de mecanismos en los que GPT2 juega un papel importante en la provisión de sustrato necesario para la producción de citoquininas en haces vasculares. Trabajos llevados a cabo en el grupo de investigación en el que he realizado este mi tesis mostraron que la exposición a VCs microbianos conlleva cambios globales en el redox-proteoma de las plantas (Ameztoy et al., 2019). Tales cambios incluían la reducción de residuos de cisteína altamente conservados a lo largo de la evolución de enzimas del ciclo de Calvin-Benson. En el capítulo 2 presento los resultados de mi investigación sobre el papel que juega el residuo de cisteína 95 de la cFBP1 en su actividad, en la fotosíntesis y en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. Para realizar esta investigación, comparé las propiedades electroforéticas y cinéticas de cFBP1 WT y una forma mutada en la que el residuo de cisteína 95 fue sustituido por un residuo de serina (C95S). Además, comparé la fotosíntesis y el crecimiento de plantas de Arabidopsis cfbp1 carentes de cFBP1 endógena que expresan ectópicamente formas WT o C95S de cFBP1. Los resultados mostraron que el residuo de cisteína 95 juega un papel importante en la actividad de cFBP1 y en la fotosíntesis, pero no en el crecimiento de Arabidopsis.Beca predoctoral de la Universidad Pública de Navarra; Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN) y Agencia Estatal de Investigación (AEI)/10.13039/501100011033/(proyectos BIO2016-78747-P y PID2019-104685GB-100).Programa de Doctorado en Biotecnología (RD 99/2011)Bioteknologiako Doktoretza Programa (ED 99/2011

Enhanced yield of pepper plants promoted by soil application of volatiles from cell-free fungal culture filtrates is associated with activation of the beneficial soil microbiota

Plants communicate with microorganisms by exchanging chemical signals throughout the phytosphere. Such interactions are important not only for plant productivity and fitness, but also for terrestrial ecosystem functioning. It is known that beneficial microorganisms emit diffusible substances including volatile organic compounds (VOCs) that promote growth. Consistently, soil application of cell-free culture filtrates (CF) of beneficial soil and plant-associated microorganisms enhances plant growth and yield. However, how this treatment acts in plants and whether it alters the resident soil microbiota, are largely unknown. In this work we characterized the responses of pepper (Capsicum annuum L.) plants cultured under both greenhouse and open field conditions and of soil microbiota to soil application of CFs of beneficial and phytopathogenic fungi. To evaluate the contribution of VOCs occurring in the CFs to these responses, we characterized the responses of plants and of soil microbiota to application of distillates (DE) of the fungal CFs. CFs and their respective DEs contained the same potentially biogenic VOCs, and application of these extracts enhanced root growth and fruit yield, and altered the nutritional characteristics of fruits. High-throughput amplicon sequencing of bacterial 16S and fungal ITS rRNA genes of the soil microbiota revealed that the CF and DE treatments altered the microbial community compositions, and led to strong enrichment of the populations of the same beneficial bacterial and fungal taxa. Our findings show that CFs of both beneficial and phytopathogenic fungi can be used as biostimulants, and provide evidence that VOCs occurring in the fungal CFs act as mediators of the plants’ responses to soil application of fungal CFs through stimulation of the beneficial soil microbiota.This work was supported by the Agencia Estatal de Investigación (AEI) and Fondo Europeo de Desarrollo Regional (Spain) (grants BIO2013-49125-C2-1-P, BIO2016-78747-P, and PID2019-104685GB-100), the Government of Navarra (refs. P1044 AGROESTI, P1004 PROMEBIO, and P1046 MICROBIOME), and the project “Plants as a tool for sustainable global development” (registration number: CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827) within the program Research, Development and Education (OP RDE)

Arabidopsis plants lacking plastid phosphoglucose isomerase respond to microbial volatiles through GLUCOSE-6-P/PHOSPHATE TRANSLOCATOR2 action

Resumen del trabajo presentado en la XXIV Reunión de la Sociedad Española de Biología de Plantas - XVII Congreso Hispano-Luso de Biología de Plantas, celebrado online del 7 al 9 de julio de 2021Recent studies have shown that PGI1 is an important determinant of photosynthesis, growth and starch production, likely as a consequence of its involvement in the synthesis of plastidial isoprenoid compounds such as hormones and photosynthetic pigments (Bahaji et al. 2015; Bahaji et al. 2018). We have shown that volatile compounds (VCs) emitted by microbes promote growth, photosynthesis, and accumulation of cytokinins (CK) and starch (Sánchez-Lopez et al. 2016a). This response was PGI1-independent, as fungal VCs exposed PGI1 null pgi1-2 plants grew faster and accumulated exceedingly higher levels of starch and CKs than plants not exposed to VCs (Sánchez-López et al. 2016b). The most up-regulated gene in leaves of fungal VCs exposed plants was At1g61800, encoding the plastidial GPT2 glucose-6-phosphate (G6P)/phosphate translocator. Whether the response of pgi1-2 to fungal VCs could be due to the GPT2-mediated transport of cytosolic G6P into the chloroplast was investigated by characterizing pgi1-2/gpt2-2 PGI1- and GPT2-null double mutants cultured in the presence or absence of VCs emitted by the fungal phytopathogen Alternaria alternata. We found that photosynthesis, active CKs content, growth and leaf starch content in pgi1-2/gpt2-2 plants exposed to fungal VCs were lower than in VCs exposed WT, gpt2-2 and pgi1-2 plants. Proteomic analyses revealed that fungal VCs strongly up-regulate the expression of proteins involved in photosynthesis in WT, gpt2-2 and pgi1-2 plants, but in much lower extent in pgi1-2/gpt2-2 plants. The overall data show that the combined action of PGI1 and GTP2 is an important determinant of the plant´s response to microbial VCs. The possible involvement of these functions in the production of growth- and foliar metabolism-regulating isoprenoid hormones in heterotrophic organs is discussed.This work was supported by the Agencia Estatal de Investigación (AEI) and Fondo Europeo de Desarrollo Regional (Spain) (grants BIO2016-78747-P and PID2019-104685GB-100) and the Ministry of Education, Youth and Sport of the Czech Republic and ERDF project “Plants as a tool for sustainable global development” (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).Peer reviewe

PGI1-mediated vascular pentose phosphate pathway activity determines growth, photosynthesis and metabolism through 2-C-methyl-D-erythritol 4-P pathway action in Arabidopsis

Resumen del trabajo presentado en el XVI Meeting of Plant Molecular Biology, celebrado en Sevilla (España), del 14 al 16 de septiembre de 2022Phosphoglucose isomerase is involved in the early steps of glycolysis and regeneration of glucose-6-phosphate pools in the pentose phosphate pathway (PPP). In Arabidopsis, plastidial phosphoglucose isomerase (PGI1) is an important determinant of growth, metabolism and photosynthesis, probably due to its involvement in the synthesis of 2-C-methyl-D-erythritol 4-P (MEP)-derived hormones in root tips and vascular tissues (Bahaji et al., 2015; Bahaji et al., 2018). To test this hypothesis, we conducted proteomic and metabolic characterization of PGI1-null pgi1-2 plants. We also characterized pgi1-2 plants ectopically expressing PGI1 under the control of a root tip- and vascular tissue-specific promoter. Furthermore, we characterized pfk4/pfk5 knockout plants impaired in the early steps of plastidial glycolysis, and pgl3-1 plants with reduced activity of the plastidial PPP enzyme 6-phosphogluconolactonase 3. The overall data obtained in this work provide strong evidence that root tip and vascular PGI1-mediated plastidial PPP determines growth, development and photosynthesis through MEP pathway action.This work was supported by the Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) and Agencia Estatal de Investigación (AEI) / 10.13039/501100011033/ (grants BIO2016-78747-P, PID2019-104685GB-100) and the Ministry of Education, Youth and Sport of the Czech Republic and ERDF project entitled “Plants as a tool for sustainable global development” (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827)

Vascular and root tip GPT2 expression mediates the PGI1-independent response of Arabidopsis to small microbial volatiles

Resumen del trabajo presentado en el XVI Meeting of Plant Molecular Biology, celebrado en Sevilla (España), del 14 al 16 de septiembre de 2022Microorganisms emit a plethora of volatile compounds (VCs) that promote plant growth and photosynthesis as well as strong developmental and metabolic changes. In Arabidopsis, the plastidial isoform of phosphoglucose isomerase PGI1 mediates photosynthesis, metabolism and development, probably due to its involvement in the synthesis of isoprenoid-derived signals in vascular tissues (Bahaji et al., 2015; Bahaji et al., 2018). Like in wild-type (WT) plants, microbial VCs promote growth and photosynthesis as well as starch and CK accumulation in PGI1-lacking pgi1-2 plants (Sánchez-López et al. 2016). A striking alteration in the transcriptome of leaves of small fungal VC-treated plants involves strong up-regulation of levels of transcripts of GPT2 (At1g61800), a gene that codes for a plastidial G6P/Pi transporter. We hypothesized that the PGI1-independent response to microbial volatile emissions involves GPT2 action. To test this hypothesis, we characterized responses of WT, GPT2-null gpt2-1, PGI1-null pgi1-2 and pgi1- 2gpt2-1 plants to small fungal VCs. In addition, we characterized responses of pgi1-2gpt2-1 plants expressing GPT2 under the control of a vascular tissue- and root tip-specific promoter to small fungal VCs. Results presented in this work provide evidence that, under conditions in which PGI1 activity is reduced, long-distance action of GPT2 plays an important role in the response of plants to small VCs through mechanisms involving resetting of the photosynthesis-related proteome in leaves and complex GPT2 regulation.This work was supported by the Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) and Agencia Estatal de Investigación (AEI) / 10.13039/501100011033/ (grants BIO2016-78747-P, PID2019-104685GB-100 and PID2019-107657RB-C22) and the Ministry of Education, Youth and Sport of the Czech Republic and ERDF project entitled “Plants as a tool for sustainable global development” (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827)

Hongos entomopatógenos: de la agricultura a la conservación del patrimonio histórico

Los métodos tradicionales utilizados en la conservación del patrimonio histórico incluyen principalmente el uso de insecticidas sintéticos, que presentan las desventajas de su toxicidad y de su falta de inocuidad sobre el sustrato a tratar. En este artículo se presenta una alternativa a estos métodos basada en el empleo de sustancias biocidas extraídas o provenientes de hongos entomopatógenos, como son Beauveria bassianay Metarhizium anisopliae. La presente propuesta incluye dos variantes no excluyentes como son el uso de conidios y la aplicación de geles con enzimas y toxinas provenientes de dichas especies. Esta metodología aporta ventajas con respecto a los métodos tradicionales, como la no toxicidad para el manipulador, la aplicabilidad a diferentes sustratos independientemente de su tamaño y localización, y su prácticamente nula reactividad frente al sustrato

Glucose-6-P/phosphate translocator2 mediates the phosphoglucose-isomerase1-independent response to microbial volatiles

In Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), the plastidial isoform of phosphoglucose isomerase (PGI1) mediates photosynthesis, metabolism, and development, probably due to its involvement in the synthesis of isoprenoid-derived signals in vascular tissues. Microbial volatile compounds (VCs) with molecular masses of <45 Da promote photosynthesis, growth, and starch overaccumulation in leaves through PGI1-independent mechanisms. Exposure to these compounds in leaves enhances the levels of GLUCOSE-6-PHOSPHATE/PHOSPHATE TRANSLOCATOR2 (GPT2) transcripts. We hypothesized that the PGI1-independent response to microbial volatile emissions involves GPT2 action. To test this hypothesis, we characterized the responses of wild-type (WT), GPT2-null gpt2-1, PGI1-null pgi1-2, and pgi1-2gpt2-1 plants to small fungal VCs. In addition, we characterized the responses of pgi1-2gpt2-1 plants expressing GPT2 under the control of a vascular tissue- and root tip-specific promoter to small fungal VCs. Fungal VCs promoted increases in growth, starch content, and photosynthesis in WT and gpt2-1 plants. These changes were substantially weaker in VC-exposed pgi1-2gpt2-1 plants but reverted to WT levels with vascular and root tip-specific GPT2 expression. Proteomic analyses did not detect enhanced levels of GPT2 protein in VC-exposed leaves and showed that knocking out GPT2 reduced the expression of photosynthesis-related proteins in pgi1-2 plants. Histochemical analyses of GUS activity in plants expressing GPT2-GUS under the control of the GPT2 promoter showed that GPT2 is mainly expressed in root tips and vascular tissues around hydathodes. Overall, the data indicated that the PGI1-independent response to microbial VCs involves resetting of the photosynthesis-related proteome in leaves through long-distance GPT2 action.This work was supported by the Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) and Agencia Estatal de Investigación (AEI)/10.13039/501100011033/ (grants BIO2016-78747-P, PID2019-104685GB-100 and PID2019-107657RB-C22) and the Ministry of Education, Youth and Sport of the Czech Republic and the European Regional Development Fund (ERDF) project entitled “Plants as a tool for sustainable global development” (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).Peer reviewe

Mecanismos de regulación de la respuesta de las plantas a compuestos volátiles de origen microbiano

Tesis doctoral presentada para lograr el título de Doctor por la Universidad Pública de Navarra, Departamento de Agronomía, Biotecnología y Alimentación, Programa de Doctorado en BiotecnologíaLas plantas son metaorganismos que regulan su desarrollo y metabolismo en respuesta a diferentes estímulos externos. Conviven con microorganismos emisores de compuestos que difunden a través del suelo tales como azúcares, proteínas, exopolisacáridos, sideróforos, ácidos grasos, ácidos orgánicos, aminoácidos y hormonas que modifican la fotosíntesis, el metabolismo y el crecimiento de las plantas (Philippot et al., 2013; De-la-Peña and Loyola-Vargas, 2014; Backer et al., 2018). Los microorganismos beneficiosos también emiten compuestos volátiles (VCs) que fomentan el crecimiento, la captación de nutrientes y la fotosíntesis, modulan la arquitectura de la raíz, activan la respuesta de defensa de la planta e incrementan su resistencia al estrés salino y la sequía (Ryu et al., 2003; Zhang et al., 2008; Splivallo et al., 2009; Zhang et al., 2009; Gutiérrez-Luna et al., 2010; Kanchiswamy et al., 2015; Park et al., 2015; Ledger et al., 2016). Estudios llevados a cabo por el grupo de investigación en el que he realizado mi tesis doctoral demostraron que las bacterias y los hongos fitopatógenos también emiten VCs con propiedades bioestimulantes (Sánchez-López et al., 2016b). Cambios en el crecimiento, la fotosíntesis, el desarrollo y el metabolismo de la planta inducidos por VCs microbianos están asociados a grandes variaciones en el transcriptoma, el proteoma y el redox-proteoma de la planta (Sánchez- López et al., 2016b; Ameztoy et al., 2019, 2021). Tales variaciones sugieren que la respuesta de la planta a los VCs microbianos está regulada tanto a nivel transcripcional como no-transcripcional. Con el fin de profundizar en los mecanismos que median la relación entre la planta y los microorganismos, en este trabajo investigué el papel que juega el transportador de hexosas fosfato plastidial (GPT2) inducible por VCs en la respuesta de la planta modelo de laboratorio Arabidopsis thaliana a VCs emitidos por el hongo fitopatógeno Altenaria alternata. Además, investigué el papel que juega en dicha respuesta el residuo de cisteína 95 de la fructosa bifosfatasa plastidial (cFBP1), un enzima del ciclo de Calvin-Benson cuya actividad está sujeta a cambios en el estado redox inducibles por la luz. En el capítulo 1 de esta tesis presento los resultados de mi investigación sobre el papel que juega GPT2 en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. Para realizar esta investigación, analicé y comparé el crecimiento, la fotosíntesis y el proteoma de plantas wild type (WT), mutantes carentes GPT2 (gpt2-1), mutantes carentes PGI1 (pgi1-2) y doble mutante pgi1-2gpt2-1 cultivadas en presencia o ausencia de VCs fúngicos. Además, caractericé la respuesta a estos compuestos de plantas pgi1-2/gpt2-1 que expresan GPT2 bajo el control de un promotor específico de haces vasculares. Finalmente, caractericé el patrón de expresión de GPT2 en plantas que expresan el gen reportero GUS bajo la acción de la secuencia promotora de GPT2. Los resultados obtenidos mostraron que, de manera similar a lo que ocurre en plantas WT, los VCs fomentan el crecimiento, la fotosíntesis y la acumulación de citoquininas activas y almidón en plantas pgi1-2 y gpt2-1. Tal respuesta fue reducida en plantas pgi1-2gpt2-1 y se revirtió a WT al expresar GPT2 en haces vasculares.Estudios comparativos de los proteomas de plantas pgi1-2 y pgi1-2gpt2-1 mostraron que GPT2 regula la expresión de proteínas relacionadas con la fotosíntesis. Es más, los estudios de expresión mostraron que GPT2 se expresa en haces vasculares y está sujeto a complejos mecanismos de regulación. Globalmente, los resultados presentados en este capítulo indican que en condiciones en las cuales la actividad de PGI está reducida, la respuesta de la planta a VCs microbianos conlleva una regulación de la expresión de proteínas relacionadas con la fotosíntesis a través de mecanismos en los que GPT2 juega un papel importante en la provisión de sustrato necesario para la producción de citoquininas en haces vasculares. Trabajos llevados a cabo en el grupo de investigación en el que he realizado este mi tesis mostraron que la exposición a VCs microbianos conlleva cambios globales en el redox-proteoma de las plantas (Ameztoy et al., 2019). Tales cambios incluían la reducción de residuos de cisteína altamente conservados a lo largo de la evolución de enzimas del ciclo de Calvin-Benson. En el capítulo 2 presento los resultados de mi investigación sobre el papel que juega el residuo de cisteína 95 de la cFBP1 en su actividad, en la fotosíntesis y en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. Para realizar esta investigación, comparé las propiedades electroforéticas y cinéticas de cFBP1 WT y una forma mutada en la que el residuo de cisteína 95 fue sustituido por un residuo de serina (C95S). Además, comparé la fotosíntesis y el crecimiento de plantas de Arabidopsis cfbp1 carentes de cFBP1 endógena que expresan ectópicamente formas WT o C95S de cFBP1. Los resultados mostraron que el residuo de cisteína 95 juega un papel importante en la actividad de cFBP1 y en la fotosíntesis, pero no en el crecimiento de Arabidopsis.Beca predoctoral de la Universidad Pública de Navarra; Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN) y Agencia Estatal de Investigación (AEI)/10.13039/501100011033/(proyectos BIO2016-78747-P y PID2019-104685GB-100)

Action mechanisms of small microbial volatile compounds in plants

Microorganisms communicate with plants by exchanging chemical signals throughout the phytosphere. Before direct contact with plants occurs, beneficial microorganisms emit a plethora of volatile compounds that promote plant growth and photosynthesis as well as developmental, metabolic, transcriptional, and proteomic changes in plants. These compounds can also induce systemic drought tolerance and improve water and nutrient acquisition. Recent studies have shown that this capacity is not restricted to beneficial microbes; it also extends to phytopathogens. Plant responses to microbial volatile compounds have frequently been associated with volatile organic compounds with molecular masses ranging between ~ 45Da and 300Da. However, microorganisms also release a limited number of volatile compounds with molecular masses of less than ~45Da that react with proteins and/or act as signaling molecules. Some of these compounds promote photosynthesis and growth when exogenously applied in low concentrations. Recently, evidence has shown that small volatile compounds are important determinants of plant responses to microbial volatile emissions. However, the regulatory mechanisms involved in these responses remain poorly understood. This review summarizes current knowledge of biochemical and molecular mechanisms involved in plant growth, development, and metabolic responses to small microbial volatile compounds.This work was supported by the Agencia Estatal de Investigación (AEI) and Fondo Europeo de Desarrollo Regional (Spain) (grant PID2019-104685GB-100).Peer reviewe