New Polymers for Needleless Electrospinning from Low-Toxic Solvents.

Wortmann M, Frese N, Sabantina L, et al. New Polymers for Needleless Electrospinning from Low-Toxic Solvents. Nanomaterials (Basel, Switzerland). 2019;9(1): 52

Entwicklung von Proteinmarkierungsverfahren zur Hochdurchsatzanalyse des murinen embryonalen Stammzellproteoms

Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Mit dem Ziel Kranheitsgene ihren Signalwegen zuzuordnen wurde in dieser Dissertation ein in situ Proteinmarkierungssystem entwickelt, das Hochdurchsatz-proteomik in mES Zellen ermöglicht. Das System beinhaltet die Einführung einerProteinmarkierungskassette in mES Zellen, die konditionale FlipROSAβgeo-Genfal-lenintegrationen in proteinkodierenden Genen enthalten. Weil die Konditionalität der FlipROSAβgeo-Genfallenkassette auf einem sequenzspezifischen Rekombinations-mechanismus beruht, kann diese postinsertionell über Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) durch eine Proteinmarkierungskassette ersetzt werden. Das hierfür entwickelte Konstrukt entspricht einem durch 5’ Spleißakzeptor- und 3’ Spleißdonorsequenzen definierten dizistronischen Exon, in dem ein Hygromyzin-Resistenzgen über eine P2A Polyproteinspaltungssequenz mit einem für das egfp (enhanced green fluorescent protein) kodierenden nLAP-Tag (N-terminal localization and affinity purification) verbunden ist. Eine erste Validierung dieses Exons in einem retroviralen Genfallenansatz ergab, dass sämtliche in Hygromyzin selektierte und auf DNA-Kassettenintegrationen untersuchte Klone nLAP-markierte Proteine exprimierten. Im Folgenden wurden in den GGTC (German Gene Trap Consortium) und EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Project) mES Zellressourcen Genfallenintergationen identifiziert, die sich für eine RMCE vermittelte, N-terminale in situ Proteinmarkierung eignen. Als kompatibel wurden Genfallenklone klassifiziert, die eine FlipROSAβgeo-Integration im ersten Intron eines proteinkodierenden Gens aufweisen, wobei diese Integration sowohl hinter einem ersten nichtkodierenden, als auch hinter einem ersten kodierenden Exon liegen kann. Allerdings darf im letzteren Fall die kodierende Sequenz keine funktionale Domäne enthalten und muss kurz genug sein, um bei Verlust nicht mit der endogenen Proteinfunktion zu interferieren. Auf diesen Kriterien basierend wurden in den GGTC und EUCOMM Ressourcen 25.130 Proteinmarkierungs-kompatible Genfallenklone identifiziert, die 3.695 mutierten Genen entsprechen. Hiervon wurden acht für die Validierung der RMCE-vermittelten Proteinmarkierungsstrategie ausgewählt. In jedem Fall gelang es die Genfallen-kassette mit dem Proteinmarkierungsexon zu ersetzten. Sowohl der Genfallen-, als auch der RMCE-Proteinmarkierungsansatz führte ohne Ausnahme zur Expression nLAP-Tag markierter Proteine, wobei in allen 13 untersuchten Klonen die Größe der markierten Proteine derjenigen der entsprechenden nativen Proteine mit zusätzlichem Marker entsprach. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die physiologische Expression der markierten Proteine sich von denen der Wildtypproteine in der Regel nicht unterscheidet und für Lokalisations- und massenspektrometrische Interaktionsstudien ausreicht. Darüber hinaus spiegelten 90% der hier untersuchten markierten Proteine das subzelluläre Lokalisationsmuster der entsprechenden nativen Proteine wider. Ähnlich verhielt es sich mit den Interaktionspartnern der jeweiligen Proteine, die sich aus bereits bekannten, aber auch noch bisher unbekannten Proteinen zusammensetzen. Insgesamt wurden in dieser Dissertation die Voraussetzungen zu einer Hochdurchsatzproteomanalyse in mES Zellen geschaffen. Während der RMCE-Ansatz die Markierung von über 3.600 Proteinen in mES Zellen ermöglicht, eignet sich der Genfallenansatz neben der Proteinmarkierung in murinen auch für die Markierung von Proteinen in humanen Zellen. In dieser Hinsicht ist die Markierung von Proteinen in humanen ES Zellen und in reprogrammierten Stammzellen (iPS) von Patienten mit unterschiedlichsten Erkrankungen besonders attraktiv, weil damit sowohl Spezies- als auch Krankheitsspezifische Unterschiede im Ablauf individueller Signaltransduktionskaskaden definiert werden können

Does positive MGMT methylation outbalance the limitation of subtotal resection in glioblastoma IDH-wildtype patients?

Background!#!The impact on survival of complete resection (CR) in patients with malignant glioma and MGMT promoter methylation on adjuvant therapy strategies has been proven in the past. However, it is not known whether a MGMT promoter methylation can compensate a subtotal resection. Therefore, we analyzed the progress of postoperative residual tumor tissue depending on the molecular tumor status.!##!Methods!#!We included all glioblastoma, IDH-wildtype (WHO grade IV) patients with postoperative residual tumor tissue, who were treated at our neurooncological department between 2010 and 2018. Correlation of molecular patterns with clinical data and survival times was performed. The results were compared to patients following CR.!##!Results!#!267 patients with glioblastoma, IDH-wildtype (WHO grade IV) received surgery of whom 81 patients with residual tumor were included in the analysis. MGMT promoter was methylated in 31 patients (38.27%). Median OS and PFS were significantly increased in patients with methylated MGMT promoter (mOS: 16 M vs. 13 M, p = 0.009; mPFS: 13 M vs. 5 M, p = 0.003). In comparison to survival of patients following CR, OS was decreased in patients with residual tumor regardless MGMT methylation.!##!Conclusion!#!Our data confirm impact of MGMT promoter methylation in patients with glioblastoma, IDH-wildtype on OS and PFS. However, in comparison to patients after CR, a methylated MGMT promoter cannot compensate the disadvantage due to residual tumor volume. In terms of personalized medicine and quality of life as major goal in oncology, neuro-oncologists have to thoroughly discuss advantages and disadvantages of residual tumor volume versus possible neurological deficits in CR

Growth of Pleurotus Ostreatus on Different Textile Materials for Vertical Farming

The mycelium of the edible mushroom Pleurotus ostreatus can be used for diverse technical applications, such as packaging materials or wastewater treatment, besides the more obvious use for nutrition. While P. ostreatus usually grows on sawdust, wood or similar materials, a former study investigated mycelium growth on different nanofiber mats. Here, we report on growing P. ostreatus on fabrics knitted from different materials, enabling the use of this mushroom in textile-based vertical farming. Our results underline that P. ostreatus grows similar on natural fibers and on synthetic fibers. The agar medium used to provide nutrients was found to support mycelium growth optimally when applied by dip-coating, suggesting that, in this way, P. ostreatus can also be grown on vertically aligned textile fabrics for vertical farming

Comparative Study of <i>Pleurotus ostreatus</i> Mushroom Grown on Modified PAN Nanofiber Mats

Pleurotus ostreatus is a well-known edible mushroom species which shows fast growth. The fungus can be used for medical, nutritional, filter, or packaging purposes. In this study, cultivation experiments were carried out with Pleurotus ostreatus growing on polyacrylonitrile (PAN) nanofiber mats in the presence of saccharose and Lutrol F68. The aim of this study was to find out whether modified PAN nanofiber mats are well suited for the growth of fungal mycelium, to increase growth rates and to affect mycelium fiber morphologies. Our results show that Pleurotus ostreatus mycelium grows on nanofiber mats in different morphologies, depending on the specific substrate, and can be used to produce a composite from fungal mycelium and nanofiber mats for biomedical and biotechnological applications

High-Throughput Crystallography : Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits

Today the identification of lead structures for drug development often starts from small fragment-like molecules raising the chances to find compounds that successfully pass clinical trials. At the heart of the screening for fragments binding to a specific target, crystallography delivers structural information essential for subsequent drug design. While it is common to search for bound ligands in electron densities calculated directly after an initial refinement cycle, we raise the important question whether this strategy is viable for fragments characterized by low affinities. Here, we describe and provide a collection of high-quality diffraction data obtained from 364 protein crystals treated with diverse fragments. Subsequent data analysis showed that ∼25% of all hits would have been missed without further refining the resulting structures. To enable fast and reliable hit identification, we have designed an automated refinement pipeline that will inspire the development of optimized tools facilitating the successful application of fragment-based methods

Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads To Address a Catalytic Dyad

Crystallography is frequently used as follow-up method to validate hits identified by biophysical screening cascades. The capacity of crystallography to directly screen fragment libraries is often underestimated, due to its supposed low-throughput and need for high-quality crystals. We applied crystallographic fragment screening to map the protein-binding site of the aspartic protease endothiapepsin by individual soaking experiments. Here, we report on 41 fragments binding to the catalytic dyad and adjacent specificity pockets. The analysis identifies already known warheads but also reveals hydrazide, pyrazole, or carboxylic acid fragments as novel functional groups binding to the dyad. A remarkable swapping of the S1 and S1′ pocket between structurally related fragments is explained by either steric demand, required displacement of a well-bound water molecule, or changes of trigonal-planar to tetrahedral geometry of an oxygen functional group in a side chain. Some warheads simultaneously occupying both S1 and S1′ are promising starting points for fragment-growing strategies

Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads To Address a Catalytic Dyad

Crystallography is frequently used as follow-up method to validate hits identified by biophysical screening cascades. The capacity of crystallography to directly screen fragment libraries is often underestimated, due to its supposed low-throughput and need for high-quality crystals. We applied crystallographic fragment screening to map the protein-binding site of the aspartic protease endothiapepsin by individual soaking experiments. Here, we report on 41 fragments binding to the catalytic dyad and adjacent specificity pockets. The analysis identifies already known warheads but also reveals hydrazide, pyrazole, or carboxylic acid fragments as novel functional groups binding to the dyad. A remarkable swapping of the S1 and S1′ pocket between structurally related fragments is explained by either steric demand, required displacement of a well-bound water molecule, or changes of trigonal-planar to tetrahedral geometry of an oxygen functional group in a side chain. Some warheads simultaneously occupying both S1 and S1′ are promising starting points for fragment-growing strategies