Functional characterization of a xyloglucan galactosyltransferase of Eucalyptus grandis and a rhamnose synthase of Arabidopsis thaliana: Effects upon the structure and composition of the primary cell wall

A parede celular vegetal tem sido associada a várias funções biológicas importantes. Ela delimita o corpo da planta, protegendo-o contra injúrias mecânicas, estresses bióticos e abióticos. Além disso, a parede celular determina a forma e as taxas de crescimento celular. Os principais constituintes da parede celular vegetal são: celulose, hemicelulose, pectina, lignina e proteínas, os quais variam de acordo com o tipo celular, idade e condições do ambiente. Para avaliar o impacto de genes envolvidos no metabolismo da parede celular, uma estratégia comum consiste em super-expressar ou silenciar genes candidatos em plantas modelo ou na espécie de interesse. Em seguida, analisa-se a parede celular para se determinar o impacto da manipulação gênica sobre os constituintes da parede celular. O objetivo deste trabalho foi caracterizar funcionalmente genes de Eucalyptus grandis e Arabidopsis thaliana envolvidos no metabolismo de parede celular. No primeiro capítulo, a clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma xiloglucano galactosiltransferase de E. grandis (EgMUR3) é descrita. O gene complementou a mutação mur3 em A. thaliana, restaurando os padrões de fucosilação e galactosilação ausentes no mutante mur3. No segundo capítulo, mostrou-se que o gene UER1, que codifica uma enzima bifuncional (3, 5-epimerase e 4-ceto redutase), é requerido para o desenvolvimento normal dos grãos de pólen em A. thaliana. Como esse gene apresenta alta homologia de seqüência com os genes RHM (ramnose sintases), o conteúdo dos compostos pécticos foi investigado em grãos de pólen. Análises citoquímicas mostraram uma redução no conteúdo de compostos pécticos em grãos de pólen uer1. Grãos de pólen mutantes apresentam uma morfologia alterada e são inviáveis. Dois modelos são apresentados para se explicar o papel de UER1 durante o desenvolvimento dos grãos de pólen em A. thaliana.The plant cell wall has been associated with several important biological functions. It surrounds the plant, protecting it against mechanical injuries, biotic and abiotic stresses. In addition, plant cell walls determine cell shape and growth rates. The main constituents of plant cell walls are: cellulose, hemicellulose, pectine, lignin and proteins, which vary according to cell type, age and environmental conditions. To evaluate the impact of genes involved in cell wall metabolism, a common strategy consists in overexpressing or silencing candidate genes in plant models or in the species of interest. Afterwards, a cell wall analysis is performed to determine the impact of the gene manipulation in the cell wall constituents. The aim of this work was to functionally characterize genes from Eucalyptus grandis and Arabidopsis thaliana involved in cell wall metabolism. In the first chapter, the cloning and characterization of a xyloglucan galactosyltransferase gene of E. grandis (EgMUR3) is described. The gene successfully complemented the mur3 mutation in A. thaliana, restoring the missing galactosylation and fucosylation in the xyloglucan component of mur3 mutant. In the second chapter, the gene UER1 encoding a bifunctional enzyme (3, 5-epimerase and 4-keto reductase) was shown to be required for the normal pollen grain development in A. thaliana. UER1 exhibits high degree of homology with RHM (rhamnose synthase) genes, and therefore, the content of pectic compounds was investigated in pollen grains from UER1/uer1 heterozygotes. Cytochemical analysis showed a reduction of pectic compounds in uer1 pollen. Mutant pollens also exhibited an altered morphology and were unviable, suggesting that UER1 plays an important role in pollen grain development in A. thaliana. Two models are proposed to explain why UER1 mutant pollen grains become unviable during the pollen grain development in A. thaliana.Universidade Federal de Viços

Restriction enzyme improves the efficiency of genetic transformations in Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’ broom disease in Theobroma cacao

The presence of restriction enzymes in the transformation mixture improved the efficiency of transformation in Moniliophthora perniciosa. The influence of the vector shape (linear or circular), the patterns of plasmid integration in genomic sites and the influence of the promoter used to express the gene marker were also analyzed. The addition of BamHI or NotI increased the number of transformants by 3-10-fold and 3-fold, respectively, over the control without added enzyme. The use of pre-linearized plasmid did not increase the transformation efficiency in comparison with the circular plasmid. However, the frequency of multi-copy transformants increased significantly. The transformation procedure here reported resulted in better production of protoplasts and transformation efficiency. In addition, the time necessary for the detection of the first transformants and the number of insertions were reduced.A presença de enzima de restrição na mistura de transformação aumentou a eficiência da transformação em Moniliophthora perniciosa. A influência da forma do vetor (linear ou circular), o padrão de integração do plasmídeo nos sítios genômicos e a influência do promotor usado para expressar o gene marcador foram também analisados. A adição de BamHI ou NotI aumentou o número de transformantes 3-10 vezes e 3 vezes, respectivamente, em relação ao controle sem a adição da enzima. O uso de plasmídeos pré-linearizados não aumentou a eficiência da transformação quando comparado à eficiência obtida com plasmídeos circulares. No entanto, a freqüência de transformantes multi-cópias aumentou significativamente. Juntos os procedimentos reportados aqui resultaram em processos mais eficientes de produção de protoplastos e transformação, onde o tempo necessário para o aparecimento dos transformantes e o número de inserções múltiplas foi reduzido