Increased Memory Conversion of Naïve CD8 T Cells Activated during Late Phases of Acute Virus Infection Due to Decreased Cumulative Antigen Exposure

Background: Memory CD8 T cells form an essential part of protective immunity against viral infections. Antigenic load, costimulation, CD4-help, cytokines and chemokines fluctuate during the course of an antiviral immune response thus affecting CD8 T cell activation and memory conversion. Methodology/Principal Findings: In the present study, naïve TCR transgenic LCMV-specific P14 CD8 T cells engaged at a late stage during the acute antiviral LCMV response showed reduced expansion kinetics but greater memory conversion in the spleen. Such late activated cells displayed a memory precursor effector phenotype already at the peak of the systemic antiviral response, suggesting that the environment determined their fate during antigen encounter. In the spleen, the majority of late transferred cells exhibited a central memory phenotype compared to the effector memory displayed by the early transferred cells. Increasing the inflammatory response by exogenous administration of IFNc, PolyI:C or CpG did not affect memory conversion in the late transferred group, suggesting that the diverging antigen load early versus later during acute infection had determined their fate. In agreement, reduction in the LCMV antigenic load after ribavirin treatment enhanced the contribution of early transferred cells to the long lasting memory pool. Conclusions/Significance: Our results show that naïve CD8 cells, exposed to reduced duration or concentration of antigen during viral infection convert into memory more efficiently, an observation that could have significant implications fo

Thymic Epithelium Abnormalities in DiGeorge and Down Syndrome Patients Contribute to Dysregulation in T Cell Development

The thymus plays a fundamental role in establishing and maintaining central and peripheral tolerance and defects in thymic architecture or AIRE expression result in the development of autoreactive lymphocytes. Patients with partial DiGeorge Syndrome (pDGS) and Down Syndrome (DS) present alterations in size and architecture of the thymus and higher risk to develop autoimmunity. We sought to evaluate thymic architecture and thymocyte development in DGS and DS patients and to determine the extent to which thymic defects result in immune dysregulation and T cell homeostasis perturbation in these patients. Thymi from pediatric patients and age-matched controls were obtained to evaluate cortex and medullary compartments, AIRE expression and thymocyte development. In the same patients we also characterized immunophenotype of peripheral T cells. Phenotypic and functional characterization of thymic and peripheral regulatory T (Treg) cells was finally assessed. Histologic analysis revealed peculiar alterations in thymic medulla size and maturation in DGS and DS patients. Perturbed distribution of thymocytes and altered thymic output was also observed. DGS patients showed lower mature CD4+ and CD8+ T cell frequency, associated with reduced proportion and function of Tregs both in thymus and peripheral blood. DS patients showed increased frequency of single positive (SP) thymocytes and thymic Treg cells. However, Tregs isolated both from thymus and peripheral blood of DS patients showed reduced suppressive ability. Our results provide novel insights on thymic defects associated with DGS and DS and their impact on peripheral immune dysregulation. Indeed, thymic abnormalities and defect in thymocyte development, in particular in Treg cell number and function could contribute in the pathogenesis of the immunodysregulation present in pDGS and in DS patients

Targeted NGS Platforms for Genetic Screening and Gene Discovery in Primary Immunodeficiencies

Background: Primary Immunodeficiencies (PIDs) are a heterogeneous group of genetic immune disorders. While some PIDs can manifest with more than one phenotype, signs, and symptoms of various PIDs overlap considerably. Recently, novel defects in immune-related genes and additional variants in previously reported genes responsible for PIDs have been successfully identified by Next Generation Sequencing (NGS), allowing the recognition of a broad spectrum of disorders.Objective: To evaluate the strength and weakness of targeted NGS sequencing using custom-made Ion Torrent and Haloplex (Agilent) panels for diagnostics and research purposes.Methods: Five different panels including known and candidate genes were used to screen 105 patients with distinct PID features divided in three main PID categories: T cell defects, Humoral defects and Other PIDs. The Ion Torrent sequencing platform was used in 73 patients. Among these, 18 selected patients without a molecular diagnosis and 32 additional patients were analyzed by Haloplex enrichment technology.Results: The complementary use of the two custom-made targeted sequencing approaches allowed the identification of causative variants in 28.6% (n = 30) of patients. Twenty-two out of 73 (34.6%) patients were diagnosed by Ion Torrent. In this group 20 were included in the SCID/CID category. Eight out of 50 (16%) patients were diagnosed by Haloplex workflow. Ion Torrent method was highly successful for those cases with well-defined phenotypes for immunological and clinical presentation. The Haloplex approach was able to diagnose 4 SCID/CID patients and 4 additional patients with complex and extended phenotypes, embracing all three PID categories in which this approach was more efficient. Both technologies showed good gene coverage.Conclusions: NGS technology represents a powerful approach in the complex field of rare disorders but its different application should be weighted. A relatively small NGS target panel can be successfully applied for a robust diagnostic suspicion, while when the spectrum of clinical phenotypes overlaps more than one PID an in-depth NGS analysis is required, including also whole exome/genome sequencing to identify the causative gene

Studies on immunological tolerance of CD8 T lymphocytes in a new TCR (T cell receptor)/antigen transgenic mouse model

The goal of this work was to investigate how the systemic absence of TNF affects CD8 T cell tolerance to a defined autoantigen. Since TNF is known to have pleiotropic effects (pro-inflammatory, pro-apoptotic, modulation of APCs and Tregs), understanding the balance of these mechanisms in vivo is very important. To establish a suitable experimental system, we generated a novel transgenic mouse expressing influenza-NP under the pdx-1 promoter and crossed these to NP-TCR transgenic mice (F5) and TNF/Rag1-deficient backgrounds. One transgenic line, pNP31, expressed the NP and was used for all further studies. These mice expressed NP in multiple organs, notably in the pancreas, thymus, spleen and brain (RT-PCR). Initially, we began to attempt to break self-tolerance in such mice by transferring activated and non activated TcR (F5) transgenic cells recognizing the NP peptide, also in Rag1-/- and TNF-/- backgrounds. Only 2 out of more than 100 recipients developed overt diabetes and impaired glucose tolerance was seen in some mice, more in males than in females. Therefore, new double transgenic mice were generated by directly crossing the pdx1-NP (pNP31) mice with the F5 TCR transgenics. The outcome was interesting and encouraging, since approximately 40% of such double transgenics (F5/pNP31/Rag1-/-) developed diabetes when TNF was absent, whereas their TNF-expressing counterparts remained tolerant with only one out of more than 60 mice developing diabetes. Thus, the experimental model system was well suited to investigate CD8 tolerance in the absence of TNF in direct relevance to the development of autoimmune disease (type 1 diabetes). Those TNF-deficient mice with diabetes also exhibited profound insulitis, as one would expect. The fact that not all mice developed clinical disease is of interest and reminiscent of another spontaneous diabetes model, the NOD mouse. Likely environmental factors, for example inter-individual differences in gut flora and pathogen encounters, will play a role. In addition, minor inter-individual variations in background genes through the sophisticated breeding scheme will also be responsible for the fact, that disease penetrance is not 100%. This feature lends the model more realism for a human disease. Tolerance in F5/pNP31/Rag1-/- double transgenic mice was achieved by peripheral deletion and anergy of autoreactive F5 T cells, characterized by upregulation of CD44, CD69, CD25, downregulation of CD62L and inability to produce interferon-γ upon in vitro challenge with the NP antigen. These observations indicated that anergy of F5 cells was preceded by their initial activation, likely after encountering the NP antigen in the periphery, for example also in lymphoid organs. Thus the presence of NP, but not the absence of TNF lead to activation of T cells. Tolerance was achieved by T cell loss, likely thorough activation-induced cell death (AICD) as well as induction of anergy in the remaining F5 T cells. We next wanted to test, whether NP-antigen specific reactivity was affected in those cells that had not been deleted in pNP31 mice, when TNF was absent. To this purpose, spleenocytes were isolated and their proliferation was tested in the presence of various concentrations of NP peptide in vitro. Interestingly, proliferative capacity was enhanced selectively in the fraction of diabetic TNF deficient mice. We then analyzed the capacity to produce interferon-γ (by FACS) after NP peptide stimulation. In F5/pNP31/Rag1-/-/TNF+/+ mice this capacity is greatly impaired (functional anergy of remaining CD8 cells). In contrast, in F5/pNP31/Rag1-/-/TNF-/- mice, IFN-γ production was restored to levels usually seen in F5/Rag1-/-/TNF+/+ mice. Thus, in the absence of TNF, functional anergy of CD8 T cells is reversed. We also tested the in vivo cytotoxic capacity of CD8 cells by injecting NP-peptide coated CFSE labeled target cells in vivo. In accordance with the findings for proliferation and interferon-γ production, the results show enhanced cytotoxicity (significant) in TNF-deficient F5/pNP31/Rag1-/- mice compared to TNF+/+ counterparts. It is of interest to note, that F5/Rag1-/-/TNF-/- mice exhibited a strong amount of cytotoxicity that was NP specific, which shows that even in the absence of a cognate autoantigen (NP), spontaneous T cell activation of TCR transgenic NP-specific T cells can occur in the absence of TNF, possibly through crossreactivity with gut antigens. Autoimmunity did not result in F5/Rag1-/-/TNF-/-, because the self-antigen was not expressed, of course. Last, we wished to test the hypothesis, whether the absence of TNF from birth would lead to lesser degrees of apoptosis in diabetic F5/pNP31/Rag1-/-/TNF-/- mice, which could account for increased CD8 T cell numbers and lesser degrees of T cell deletion. Indeed, apoptosis was reduced in the diabetic mice, which provides a mechanistic explanation for the increased cellularity in these mice and explains in a quantitative way, why tolerance is lost. Conclusions: NP expression leads to activation of CD8 T cells in F5/pNP31/Rag1-/- mice. These cells usually apoptose in the presence of TNF resulting in reduced cellularity and self-tolerance by deletion. In the absence of TNF, activation-induced cell death is reduced, resulting in lesser apoptosis, lesser deletion and T1D in a significant proportion of animals, if NP is expressed. Interindividual variation correlates interestingly with disease development. Rag1-/- is required for autoimmune disease penetrance, possibly because it is known that lymphopenia can drive autoimmunity. In addition, functional anergy of CD8 cells that were not deleted in the presence of TNF is reversed in the absence of TNF. Thus, TNF is an important checkpoint for maintenance of self-tolerance influencing cellular apoptosis (AICD-deletion) and cellular functional anergy. Collectively, my data show that endogenous TNF can be essential for the induction and maintenance of peripheral CD8 T cell tolerance, and in its absence, organ-specific autoimmunity can occur.Προκειμένου να μελετήσουμε πώς η απώλεια του ενδογενούς TNF επιδρά στην ανοχή των CD8+ Τ λεμφοκυττάρων, χρησιμοποιήσαμε ένα καλά χαρακτηρισμένο διαγονιδιακό για τον υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (TCR) ποντίκι, το F5. Τα κύτταρα που φέρουν τον F5 υποδοχέα αναγνωρίζουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο, το ΝΡ, που προέρχεται από την νουκλεοπρωτεΐνη του ιού της γρίππης. Στο εργαστήριο δημιουργήσαμε μία νέα διαγονιδιακή σειρά για το αντιγόνο ΝΡ, την pNP31. Η σειρά αυτή κατασκευάστηκε με κλωνοποίηση του υποκινητή pdx-1 μπροστά από το γονίδιο ΝΡ. Έλεγχος με RT-PCR έδειξε ότι το αντιγόνο ΝΡ εκφράζεται σε όλους τους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του παγκρεατικού. Τα δύο πρώτα χρόνια της διδακτορικής μου διατριβής πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοχής χρησιμοποιώντας το πειραματικό σύστημα στης ενδοφλέβιας μεταφοράς F5 κυττάρων σε ποντίκια-αποδέκτες pNP31. Δοκιμάστηκαν διάφορες συνθήκες μεταφοράς και τα εργαλεία που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της λειτουργικής κατάστασης του παγκρέατος των ζώων ήταν η καμπύλη ανοχής στη γλυκόζη και ο ιστολογικός έλεγχος. Απώλεια ανοχής στη γλυκόζη παρατηρήθηκε περισσότερο στα αρσενικά και λιγότερο στα θηλυκά και πραγματοποιήθηκαν τόσο στο Rag1+/+ όσο και στο knockout υπόβαθρο. Σε δύο από περισσότερες από 100 μεταφορές του τύπου: F5/TNF-/- ή F5->pNP31/TNF-/- που παρακολουθήθηκαν συστηματικά εμφάνισαν διαβήτη, αριθμός μικρός, για να μπορέσει να χρησιμοποιηθεί αυτή η πειραματική προσέγγιση περαιτέρω για την προαγωγή διαβήτη και τη μελέτη του ρόλου του TNF στην απώλεια της ανοχής των Τ λεμφοκυττάρων. Παράλληλα, νέα διπλά διαγονιδιακά ποντίκια δημιουργήθηκαν με την απευθείας διασταύρωση των pNP31 ποντικών με τα F5 TCR διαγονιδιακά, τα οποία υπήρχαν σε Rag1 και TNF knockout γενετικά υπόβαθρα. Το αποτέλεσμα ήταν ενδιαφέρον, καθώς περίπου 40% των ποντικών στα οποία απουσίαζε ο ενδογενής TNF ανέπτυξαν διαβήτη, ενώ τα αντίστοιχα στα οποία ο TNF ήταν παρόν μόνο 1 από περισσότερα από 60 που ελέγχθηκαν παρέμειναν σε κατάσταση ανοχής. Επομένως το πειραματικό σύστημα ήταν κατάλληλο για τη μελέτη της ανοχής των CD8+ T λεμφοκυττάρων απουσία του ενδογενούς TNF, με άμεση συνάφεια με την ανάπτυξη αντοάνοσης πάθησης (διαβήτη τύπου 1). Τα ποντίκια με εμφανή διαβήτη επίσης εμφάνιζαν έντονη διήθηση του παγκρεατικού ιστού. Η απώλεια ανοχής στα F5/pNP31/TNF-/- διαβητικά ποντίκια συνοδεύτηκε με αύξηση των συνολικών CD8+ Τ κυττάρων. Επομένως ένα σημαντικό μέρος των F5/pNP31/TNF-/- ποντικών ανέπτυξε διαβήτη. Το γεγονός ότι όχι όλα τα ποντίκια ανέπτυξαν ασθένεια είναι ενδιαφέρον και θυμίζει άλλα μοντέλα inbred ποντικών που εμφανίζουν αυτόματα διαβήτη, όπως το NOD. Πιθανόν περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως για παράδειγμα διαφορές στη μικροχλωρίδα του εντέρου ή επαφές με διαφορετικά ανοσογόνα ανά ποντικό, παίζουν ρόλο. Επιπρόσθετα, μικρές διαφορές στα γενετικά υπόβαθρα ανά άτομο εξαιτίας του τρόπου διασταύρωσης που ακολουθήθηκε για την παραγωγή της τετραπλά διαγονιδιακής σειράς, μπορεί να οφείλονται για το γεγονός που η διεσδυτικότητα της νόσου δεν είναι 100%. Ωστόσο, αυτό το δεδομένο φέρνει το μοντέλο κοντά στα τρέχοντα δεδομένα για την ανάπτυξη διαβήτη και άλλων αυτοάνοσων ασθενειών στον άνθρωπο. Μία έντονη διαφορά που παρατηρήσαμε αρχικά στα F5/pNP31 ποντίκια στα οποία ο ενδογενής TNF ήταν παρόν, ήταν ότι είχαν σχεδόν 3 φορές μείωση του αριθμού των συνολικών CD8+ Τ λεμφοκυττάρων τους στο σπλήνα. Αυτή η ανοχή μέσω απαλοιφής χάθηκε σε μεγάλο βαθμό στα ποντίκια στα οποία ο ενδογενής TNF απουσίαζε και είχαν αναπτύξει εμφανή διαβήτη. Αυτόματη ενεργοποίηση των CD8+ T λεμφοκυττάρων παρουσία του αυτο-αντιγόνου ΝΡ. Αρχικά θέλαμε να κατανοήσουμε αν τα CD8+ T λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται στα F5/pNP31 ποντίκια και αν υπάρχουν διαφορές μεταξύ των ποντικών που ανέπτυξαν διαβήτη απουσία του TNF ή όχι. Για αυτό το σκοπό απομονώσαμε κύτταρα από τους παγκρεατικούς λεμφαδένες και τους σπλήνες από όλες τις κατηγορίες ποντικών: F5, F5/TNF-/-, F5/pNP31, F5/pNP31/TNF-/- (και διαβητικά) και τα αναλύσαμε για τους κυτταρικούς μάρτυρες ενεργοποίησης: CD25, CD44, CD69, και CD62L. Βρήκαμε ότι τα CD8+ T κύτταρα προερχόμενα είτε από ΤΝF+/+ είτε από TNF-/- F5/pNP31 ποντίκια, εμφάνισαν σημαντική αύξηση των CD44, CD69 μαρτύρων, πολύ μικρότερη του CD25, και μείωση της έκφρασης του CD62L. Επομένως, η παρουσία του αντιγόνου ΝΡ οδηγεί στη αυτόματη ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Αναστροφή της ανέργειας των F5 Τ κυττάρων απουσία του ενδογενούς TNF. Στη συνέχεια, θελήσαμε να μελετήσουμε αν η ειδική για το αντιγόνο ΝΡ δραστικότητα των κυττάρων που δεν είχαν απαλειφθεί στα F5/pNP31 ποντίκια είχε επηρεαστεί απουσία του ενδογενούς TNF. Για αυτό το σκοπό απομονώθηκαν κύτταρα από το σπλήνα των ποντικών και η ικανότητα τους πολλαπλασιασμού σε επανα-πρόκληση στο αντιγόνο μελετήθηκε in vitro. Βρήκαμε ότι η πολλαπλασιαστική ικανότητα είχε αυξηθεί ειδικά σε αυτό το τμήμα των ποντικών που ήταν TNF knockout και εμφάνιζαν διαβήτη. Επίσης αναλύσαμε την ικανότητα των κυττάρων να παράγουν IFNγ (με FACS) κατόπιν ΝΡ επανα-διέγερσης. Στα F5/pNP31 ποντίκια η ικανότητα αυτή είχε σχεδόν χαθεί εντελώς (είχαν περιέλθει σε κατάσταση ανέργειας τα εναπομείναντα CD8+ T λεμφοκύτταρα). Στα F5/pNP31/ΤNF-/- ποντίκια, τα κύτταρα που προέρχονταν τόσο από τους σπλήνες, όσο και από τους παγκρεατικούς λεμφαδένες, η παραγωγή της IFNγ ήταν πολύ υψηλή. Τα δεδομένα είναι σημαντικά, όπως βεβαιώθηκαν μέσω στατιστικής ανάλυσης. Επομένως, απουσία του ενδογενούς TNF η ανέργεια των CD8+ T λεμφοκυττάρων αναστράφηκε. Τέλος, μελετήσαμε την in vivo ικανότητα των CD8+ T λεμφοκυττάρων να σκοτώνουν κύτταρα προερχόμενα από C57Bl/10 ποντίκια βαμμένα με τη χρωστική CFSE και φορτωμένα με το ΝΡ αντιγόνο. Σε συμφωνία με τα δεδομένα του πολλαπλασιασμού και της παραγωγής IFNγ, τα αποτελέσματα δείχνουν αυξημένη και σημαντική κυτταροτοξικότητα στα F5/pNP31/ΤNF-/- ποντίκια σε σύγκριση με τα TNF+/+. Είναι ενδιαφέρον να παρατηρήσουμε ότι και τα F5/ΤNF-/- παρουσίασαν σημαντικό βαθμό κυτταροτοξικότητας η οποία ήταν ειδική για το αντιγόνο ΝΡ. Μικρότερος βαθμός απόπτωσης στα διαβητικά F5/pNP31/ΤNF-/- ποντίκια. Τέλος, θελήσαμε να μελετήσουμε την υπόθεση, αν η απουσία του ενδογενούς TNF από τη γέννηση των ποντικών, θα μπορούσε να οδηγήσει σε μικρότερο βαθμό απόπτωσης στα ποντίκια που εκφράζουν το ΝΡ αντιγόνο, το οποίο θα μπορούσε μαζί με τα δεδομένα της δοκιμασίας πολλαπλασιασμού να ερμηνεύσει τους αυξημένους αριθμούς των CD8+ T κυττάρων και το μικρότερο βαθμό απαλοιφής σε αυτά τα ποντίκια. Πράγματι, η απόπτωση ήταν μειωμένη στα διαβητικά F5/pNP31/ΤNF-/- ποντίκια, το οποίο προσδίδει στο σύστημα μία μηχανιστική εξήγηση γιατί υπάρχουν αυξημένοι αριθμοί κυττάρων στα διαβητικά και ίσως γιατί η ανοχή χάθηκε σε αυτά τα ποντίκια: είχαν μειωμένο θάνατο μετά από ενεργοποίηση in vivo. Συμπεράσματα. Η έκφραση του αντιγόνου ΝΡ οδηγεί σε αυθόρμητη ενεργοποίηση των CD8+ T κυττάρων στα F5/pNP31 διαγονδιακά ποντίκια. Τα κύτταρα συναντώντας το αντιγόνο για το οποίο είναι ειδικά πεθαίνουν μέσω απόπτωσης παρουσία TNF, με αποτέλεσμα ο συνολικός τους αριθμός να είναι μειωμένος (ανοχή μέσω απαλοιφής). Απουσία TNF, o θάνατος μετά από ενεργοποίηση είναι μειωμένος, οδηγώντας σε λιγότερη απόπτωση, λιγότερη απαλοιφή και εμφάνιση διαβήτη τύπου 1 σε ένα σημαντικό τμήμα ποντικών, παρουσία του αντιγόνου ΝΡ. Διακυμάνσεις στα δεδομένα μεταξύ των ποντικών φαίνεται να συνδέονται με την ανάπτυξη της ασθένειας. Η ύπαρξη του Rag1-/- γενετικού υποβάθρου είναι απαραίτητη για την διεισδυτικότητα της νόσου, πιθανόν γιατί είναι γνωστό ότι λεμφοπενία μπορεί να οδηγήσει στην αυτοανοσία. Επιπρόσθετα, η ανέργεια των CD8+ T κυττάρων τα οποία δεν είχαν απαλειφθεί, αντιστράφηκε απουσία του ενδογενούς TNF, μια και ακόμα και τα μη διαβητικά F5/pNP31/ΤNF-/- ποντίκια είχαν αυξημένη ικανότητα παραγωγής IFNγ. Επομένως, ο TNF αποτελεί ένα σημαντικό ρυθμιστή της ανοχής σε αντιγόνα εαυτού, επιδρώντας στο θάνατο που προάγεται από την ενεργοποίηση και ακόμα πιο σημαντικά στη διατήρηση της ανέργειας των CD8+ T κυττάρων

Μελέτη του Ανοσορρυθμιστικού ρόλου του TNF στις αποκρίσεις των Τ κυττάρων

Ο TNF είναι μία κυτοκίνη που συμμετέχει στη ρύθμιση της ανάπτυξης και της λειτουργίας του ανοσοποιητικού συστήματος και λαμβάνει ενεργά μέρος στις αποκρίσεις των Τ κυττάρων. Η σημασία του TNF αποκορυφώθηκε όταν ταυτοποιήθηκε ως μόριο με δισχιδή δράση: προφλεγμονώδη έναντι προ-ανοσοκατασταλτικής. Η ενοχοποίηση του συστήματος του ΤΝF σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις φλεγμονωδών και αυτοάνοσων νοσημάτων όπως στη ρευματοειδή αρθρίτιδα, την ασθένεια του Crohn, τη σκλήρυνση κατά πλάκας και το διαβήτη (Douni E. 1995, Probert L. 1995, Kassiotis 2001α), η ευεργετική επίδραση της αντι-TNF θεραπείας σε κάποιες από αυτές σε αντιδιαστολή με την επιδείνωση που προκαλεί σε κάποιες άλλες καθώς και αποτελέσματα μελετών με knockout ζώα προτείνουν ότι ο TNF εμπλέκεται στην ανοσορρύθμιση των Τ κυττάρων και πιο πρόσφατα των αυτοδραστικών (Kassiotis G. 2001β, Balkwill F. 2000). Οι συγκεκριμένοι ανοσορρυθμιστικοί μηχανισμοί δράσης του TNF παραμένουν σε σημαντικό βαθμό αδιευκρίνιστοι μέχρι σήμερα. Σε αυτήν την εργασία προσεγγίστηκαν πειραματικά δύο βασικοί στόχοι. Στον πρώτο πραγματοποιήθηκε μελέτη και σύγκριση της ικανότητας επιβίωσης των T κυττάρων που δεν εκφράζουν τον TNF in vivo. Στο δεύτερο, χρησιμοποιώντας in vitro κυτταρικές στρατηγικές, μελετήθηκε ο ρόλος του TNF σε δύο άλλες λειτουργίες των Τ κυττάρων, την ενεργοποίηση και την ανοχή. Η πραγματοποίηση των πειραμάτων αυτών μας οδήγησε σε σημαντικές πληροφορίες για το μηχανισμό δράσης του TNF. Συγκεκριμένα, η επιβίωση των F5 CD8+ θυμοκυττάρων βρέθηκε σε σημαντικό βαθμό μειωμένη απουσία TNF, ενώ η δραστικότητα των F5TNF-/- και η ανέργεια των F5ΝΡTNF-/- περιφερικών λεμφοκυττάρων σε σημαντικό βαθμό αλλοιωμένη. Τα αποτελέσματά μας αποκόμισαν νέες πληροφορίες για τη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης από τον TNF, οδηγώντας μας σε νέα ερωτήματα και δραστηριοποιώντας το ενδιαφέρον μας για βαθύτερη σπουδή

A mechanistic study of peripheral CD8 T cell tolerance in a new TCR / antigen transgenic mouse model

The goal of this work was to investigate how the systemic absence of TNF affects CD8 T cell tolerance to a defined autoantigen. Since TNF is known to have pleiotropic effects (pro-inflammatory, pro-apoptotic, modulation of APCs and Tregs), understanding the balance of these mechanisms in vivo is very important. To establish a suitable experimental system, we generated a novel transgenic mouse expressing influenza-NP under the pdx-1 promoter and crossed these to NP-TCR transgenic mice (F5) and TNF/Rag1-deficient backgrounds. One transgenic line, pNP31, expressed the NP and was used for all further studies. These mice expressed NP in multiple organs, notably in the pancreas, thymus, spleen and brain (RT-PCR). Initially, we began to attempt to break self-tolerance in such mice by transferring activated and non activated TcR (F5) transgenic cells recognizing the NP peptide, also in Rag1-/- and TNF-/- backgrounds. Only 2 out of more than 100 recipients developed overt diabetes and impaired glucose tolerance was seen in some mice, more in males than in females. Therefore, new double transgenic mice were generated by directly crossing the pdx1-NP (pNP31) mice with the F5 TCR transgenics. The outcome was interesting and encouraging, since approximately 40% of such double transgenics (F5/pNP31/Rag1-/-) developed diabetes when TNF was absent, whereas their TNF-expressing counterparts remained tolerant with only one out of more than 60 mice developing diabetes. Thus, the experimental model system was well suited to investigate CD8 tolerance in the absence of TNF in direct relevance to the development of autoimmune disease (type 1 diabetes). Those TNF-deficient mice with diabetes also exhibited profound insulitis, as one would expect. The fact that not all mice developed clinical disease is of interest and reminiscent of another spontaneous diabetes model, the NOD mouse.increased cellularity in these mice and explains in a quantitative way, why tolerance is lost.Προκειμένου να μελετήσουμε πώς η απώλεια του ενδογενούς TNF επιδρά στην ανοχή των CD8+ Τ λεμφοκυττάρων, χρησιμοποιήσαμε ένα καλά χαρακτηρισμένο διαγονιδιακό για τον υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (TCR) ποντίκι, το F5. Τα κύτταρα που φέρουν τον F5 υποδοχέα αναγνωρίζουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο, το ΝΡ, που προέρχεται από την νουκλεοπρωτεΐνη του ιού της γρίππης. Στο εργαστήριο δημιουργήσαμε μία νέα διαγονιδιακή σειρά για το αντιγόνο ΝΡ, την pNP31. Η σειρά αυτή κατασκευάστηκε με κλωνοποίηση του υποκινητή pdx-1 μπροστά από το γονίδιο ΝΡ. Έλεγχος με RT-PCR έδειξε ότι το αντιγόνο ΝΡ εκφράζεται σε όλους τους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του παγκρεατικού. Τα δύο πρώτα χρόνια της διδακτορικής μου διατριβής πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοχής χρησιμοποιώντας το πειραματικό σύστημα στης ενδοφλέβιας μεταφοράς F5 κυττάρων σε ποντίκια-αποδέκτες pNP31. Δοκιμάστηκαν διάφορες συνθήκες μεταφοράς και τα εργαλεία που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της λειτουργικής κατάστασης του παγκρέατος των ζώων ήταν η καμπύλη ανοχής στη γλυκόζη και ο ιστολογικός έλεγχος. Απώλεια ανοχής στη γλυκόζη παρατηρήθηκε περισσότερο στα αρσενικά και λιγότερο στα θηλυκά και πραγματοποιήθηκαν τόσο στο Rag1+/+ όσο και στο knockout υπόβαθρο. Σε δύο από περισσότερες από 100 μεταφορές του τύπου: F5/TNF-/- ή F5->pNP31/TNF-/- που παρακολουθήθηκαν συστηματικά εμφάνισαν διαβήτη, αριθμός μικρός, για να μπορέσει να χρησιμοποιηθεί αυτή η πειραματική προσέγγιση περαιτέρω για την προαγωγή διαβήτη και τη μελέτη του ρόλου του TNF στην απώλεια της ανοχής των Τ λεμφοκυττάρων. Παράλληλα, νέα διπλά διαγονιδιακά ποντίκια δημιουργήθηκαν με την απευθείας διασταύρωση των pNP31 ποντικών με τα F5 TCR διαγονιδιακά, τα οποία υπήρχαν σε Rag1 και TNF knockout γενετικά υπόβαθρα. τα ποντίκια: είχαν μειωμένο θάνατο μετά από ενεργοποίηση in vivo

Viral Infections and Autoimmune Disease: Roles of LCMV in Delineating Mechanisms of Immune Tolerance

Viral infections are a natural part of our existence. They can affect us in many ways that are the result of the interaction between the viral pathogen and our immune system. Most times, the resulting immune response is beneficial for the host. The pathogen is cleared, thus protecting our vital organs with no other consequences. Conversely, the reaction of our immune system against the pathogen can cause organ damage (immunopathology) or lead to autoimmune disease. To date, there are several mechanisms for virus-induced autoimmune disease, including molecular mimicry and bystander activation, in support of the “fertile field” hypothesis (terms defined in our review). In contrast, viral infections have been associated with protection from autoimmunity through mechanisms that include Treg invigoration and immune deviation, in support of the “hygiene hypothesis”, also defined here. Infection with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) is one of the prototypes showing that the interaction of our immune system with viruses can either accelerate or prevent autoimmunity. Studies using mouse models of LCMV have helped conceive and establish several concepts that we now know and use to explain how viruses can lead to autoimmune activation or induce tolerance. Some of the most important mechanisms established during the course of LCMV infection are described in this short review