Messa a punto di metodiche molecolari per la ricerca e l’identificazione di agenti patogeni trasmessi da zecche in Ixodes ricinus e nell’uomo

2007/2008La zecca Ixodes ricinus, molto diffusa in Friuli Venezia Giulia, rappresenta il vettore principale responsabile della trasmissione del morbo di Lyme (Borrelia burgdorferi), anaplasmosi (Anaplasma phagocytophilum), rickettiosi (Rickettsia spp.), babesiosi (Babesia spp.) e del virus dell’encefalite TBE (tick-borne encephalitis). La regione Friuli Venezia Giulia è stata già dichiarata zona endemica per la borreliosi di Lyme; di recente cinque casi clinici di anaplasmosi sono stati descritti nell’alto Friuli, mentre negli ultimi anni si è rilevato un incremento costante dei casi di encefalite TBE. Vari casi di rickettiosi e babesiosi sono stati registrati di recente in Europa, compresi in territori confinanti con la nostra regione. Lo scopo di questo lavoro di dottorato è stato quello di creare una mappa del territorio regionale che identifichi le zone a rischio per tutti e cinque gli agenti patogeni al fine di ridurre i casi d’infezione e facilitare la diagnosi considerando anche la possibilità di contrarre co-infezioni. La ricerca di sequenze genomiche dei patogeni di interesse è stata effettuata impiegando varie tecniche di biologia molecolare. Sono state analizzate le zecche raccolte in 38 stazioni della regione FVG durante il biennio 2005-2006. La prevalenza di B. burgdorferi è stata valutata amplificando lo spazio intergenico 5S-23S e i campioni positivi sono stati genotipizzati tramite un nuovo sistema PCR-RFLP diretto verso il gene plasmidico ospA ideato nel nostro laboratorio. La presenza del virus TBE è stata dimostrata applicando la tecnica nested-RT-PCR specifica per la regione non codificante all’estremità 5’ dell’RNA virale, seguita da sequenziamento per l’identificazione del sottotipo. Per la ricerca di A.phagocytophilum sono stati scelti dei primer specifici per il gene epank1, mentre la presenza di Rickettsia spp. è stata constatata amplificando il gene per la subunità 16S ribosomiale; i campioni positivi sono stati sequenziati per identificare le specie. La presenza di Babesia spp. è stato condotto su campioni di zecche provenienti dalla zona del Carso raccolti negli anni 2006-2007. Lo screening è stato effettuato applicando una nested-PCR specifica per il gene per la -tubulina associato ad una PCR specifica per il gene 18S rRNA. I positivi sono stati identificati tramite sequenziamento seguito da analisi dell’omologia ed elaborazione di due alberi filogenetici. La prevalenza d’infezione annuale di B. burgdorferi è stata del 23,3 % nell’anno 2005 e 22,9 % nell’anno 2006; la zona fitoclimatica a più alto rischio d’infezione è risultata l’area del Carso. La genotipizzazione ha dimostrato la prevalenza di B. afzelii (54.9%) rispetto a B. garinii (31.7%) e B. burgdorferi s. s. (6%) e il 3.6% di una specie denominata pattern P1. Il virus TBE è stato rilevato in gran parte delle stazioni campionate nel 2005 con punte di presenza anche del 70%, soprattutto nelle stazioni situate ad altitudini più elevate (area alpina). Questa è la prima dimostrazione della presenza del virus in FVG. L’analisi di sequenza lo ha identificato come appartenente al sottotipo Western European TBE. L’analisi per la presenza di A. phagocytophilum ha evidenziato una prevalenza annuale del 1,6% nell’anno 2005 e 0,7 % nel 2006, con una distribuzione disomogenea sul territorio. Il sequenziamento dei positivi ha confermato la specie. La media annuale di infezione per Rickettsia spp. è stata del 4% nell’anno 2005; nel 2006 è stata riscontrata una distribuzione sul territorio paragonabile a quella dell’anno precedente, con una incremento della prevalenza annuale al 6,1%. I picchi di prevalenza sono stati riscontrati nella parte centrale della regione FVG, a cavallo delle aree alpina e prealpina. L’analisi di sequenza ha evidenziato, per la prima volta in regione FVG, la presenza delle specie R. helvetica e R. monacensis, entrambe patogene per l’uomo; in un campione proveniente dall’area alpina è stata rilevata una specie omologa a R. limoniae. La prevalenza media di infezione di Babesia spp. è risultata del 0.8% nel 2006 e 1.1% nel 2007. Tramite l’analisi di omologia e la creazione di alberi filogenetici sono state identificate la specie patogena Babesia EU1 e una specie altamente omologa al gruppo B. divergens/B. capreoli, potenzialmente patogena. Questi dati dimostrano per la prima volta la diffusione di Babesia spp. anche sul versante italiano dell’area transfrontaliera. Inoltre, sono state individuate zecche coinfette da due o tre agenti patogeni, soprattutto dal virus TBE e B. burgdorferi, il che suggerisce una possibile trasmissione simultanea all’uomo di patologie diverse con una probabile complicazione del quadro clinico. Gli screening basati su grandi numeri necessitano di tecniche rapide come l’uso di una multiplex PCR che favorisce la tempestività dei risultati, sia nell’analisi del vettore, sia in campo diagnostico, così come riportato in letteratura per la diagnosi di infezioni miste. L’ ultima parte di questo studio ha riguardato, perciò, la progettazione di un sistema di multiplex PCR in grado di rilevare la co-presenza del DNA di Borrelia, Rickettsia, Anaplasma e Babesia con un’unica amplificazione. Questo sistema ha dimostrato di essere uno strumento rapido e specifico nell’individuare le coinfezione di agenti patogeni trasmessi da zecche in I. ricinus e in campioni biologici di pazienti con presunta pluriinfezione. In conclusione possiamo affermare che questa indagine ha permesso di valutare il rischio di malattie trasmesse da I. ricinus, in regione FVG e area transfrontaliera slovena fornendo un quadro più chiaro della situazione epidemiologica, soprattutto in base all’identificazione delle specie circolanti, alcune rilevate per la prima volta in queste aree. I risultati di questo studio sono pubblicati sul sito del laboratorio “Rischio d’infezione per borreliosi di Lyme ed altre malattie trasmesse da zecca: creazione di mappe di rischio” (dfp.units.it/spirochete/indice.html) allo scopo di renderli usufruibili dai cittadini e, quindi, contribuire almeno in parte alla prevenzione dell’infezione di malattie trasmesse da zecche tramite la conoscenza del territorio.XXI Cicl

MwoI and SmaI RFLPs polymorphisms of porcine obese gene and their association with carcass and meat characteristics of heavy pigs

The obese gene encodes leptin, a 16-kDa protein involved in the regulation of fat deposition and energy consumption.Backfat is one of the peculiar characteristics of Italian ham, and represents a fundamental quality factor. Therefore, theobese gene can be considered as a candidate marker for determining economically important production traits such asbackfat thickness, feed intake, and growth rate in swine. The aim was to investigate the relationship between obese genepolymorphisms and carcass and meat characteristics of pigs reared for ham production. In the present research, the analysesof three new RFLPs are reported. An MwoI polymorphism occurs at nucleotide 1792, within the intron. Pigs heterozygousat this position have heavier thighs with a thinner layer of fat. Two SmaI polymorphisms occur at nucleotides5018 and 5410 within the 3’ UTR of the obese gene. Animals heterozygous at position 5410 have characteristics suitablefor the production of San Daniele ham: lower backfat thickness and heavier thighs with a thinner fat layer, relative toother genotypes