Ação ovicida do extrato bruto enzimático do fungo Pochonia chlamydosporia sobre ovos de Ancylostoma sp

Ancylostoma sp é um geo-helminto potencialmente zoonótico. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a ação do extrato bruto enzimático de Pochonia chlamydosporia (VC4) sobre ovos de Ancylostoma sp, em meio ágar-água 2% e em cultura de fezes. Observou-se um percentual de redução na eclosão dos ovos de Ancylostoma sp, de 76,8% na placas de Petri do grupo tratado em relação ao grupo controle. O extrato bruto enzimático de Pochonia chlamydosporia foi eficiente na redução da eclosão dos ovos de Ancylostoma sp, podendo ser utilizado como controlador biológico desse nematoide.Ancylostoma sp is a potentially zoonotic geohelminth. This study aimed to evaluate in vitro the action of crude enzyme extract of Pochonia chlamydosporia (VC4) on eggs of Ancylostoma sp in 2% water-agar and in fecal cultures. The percentage reduction in Ancylostoma sp egg eclosion was 76.8% in Petri dishes of the treated group compared to the control group. The crude enzyme extract of Pochonia chlamydosporia was effective at reducing Ancylostoma sp egg eclosion and can be used as biological control of this nematode

Nematicidal activity of Paecilomyces marquandii proteases on infective larvae of Ancylostoma spp

ABSTRACT The present study aimed to evaluate the action of Paecilomyces marquandii proteases on Ancylostoma spp L3. White halos in the zymogram confirmed the proteolytic action. Difference (p <0.01) between the number of L3 in the differents groups was found, with 41.4% of reduction of Ancylostoma spp. L3 before 24 hours

Avaliação do fungo Duddingtonia flagrans e hipoclorito de sódio a 5% sobre a eclodibilidade de ovos de ciatostomíneos

O objetivo do presente trabalho foi avaliar diferentes concentrações de conídios do fungo Duddingtonia flagrans (AC001) e hipoclorito de sódio (NaOCl) a 5% (v/v) sob a eclosão de ovos de nematódeos gastrintestinais de equinos. Foram formados cinco grupos experimentais: Grupo 1 (3 x 106 conídios de AC001 + 20 g de fezes), Grupo 2 (6 x 106 conídios de AC001 + 20 g de fezes), Grupo 3 (9 x 106 conídios de AC001 + 20 g de fezes), Grupo 4 (5 mL de hipoclorito de sódio 5% (v/v) + 20 g de fezes) e Grupo 5 (5 mL de água destilada + 20 g de fezes). Em seguida, as coproculturas foram incubadas por 10 dias no escuro 26 ± 1° a 2°C e, posteriormente, procedeu-se a recuperação de larvas infectantes (L3) de nematódeos por meio da técnica de Baermann. Ao final do período experimental, constatou-se a presença absoluta de L3 de nematódeos ciatostomíneos. Os resultados demonstraram que houve redução significativa (p&lt;0,01) na recuperação de L3 em todos os grupos tratados com o AC001 (G1, G2 e G3) e também com o hipoclorito de sódio a 5% (v/v) (G4) em relação ao grupo controle (G5). Notou-se que não houve diferença (p&gt;0,01) entre as três concentrações de conídios testadas nos grupos G2 e G3. Conclui-se que o fungo D. flagrans e o hipoclorito de sódio a 5% (v/v) foram eficientes na redução de L3 de nematódeos gastrintestinais nas coproculturas, podendo esse resultado ser utilizado em futuros delineamentos experimentais

Avaliação do fungo Duddingtonia flagrans e hipoclorito de sódio a 5% sobre a eclodibilidade de ovos de ciatostomíneos

O objetivo do presente trabalho foi avaliar diferentes concentrações de conídios do fungo Duddingtonia flagrans (AC001) e hipoclorito de sódio (NaOCl) a 5% (v/v) sob a eclosão de ovos de nematódeos gastrintestinais de equinos. Foram formados cinco grupos experimentais: Grupo 1 (3 x 106 conídios de AC001 + 20 g de fezes), Grupo 2 (6 x 106 conídios de AC001 + 20 g de fezes), Grupo 3 (9 x 106 conídios de AC001 + 20 g de fezes), Grupo 4 (5 mL de hipoclorito de sódio 5% (v/v) + 20 g de fezes) e Grupo 5 (5 mL de água destilada + 20 g de fezes). Em seguida, as coproculturas foram incubadas por 10 dias no escuro 26 ± 1° a 2°C e, posteriormente, procedeu-se a recuperação de larvas infectantes (L3) de nematódeos por meio da técnica de Baermann. Ao final do período experimental, constatou-se a presença absoluta de L3 de nematódeos ciatostomíneos. Os resultados demonstraram que houve redução significativa (p0,01) entre as três concentrações de conídios testadas nos grupos G2 e G3. Conclui-se que o fungo D. flagrans e o hipoclorito de sódio a 5% (v/v) foram eficientes na redução de L3 de nematódeos gastrintestinais nas coproculturas, podendo esse resultado ser utilizado em futuros delineamentos experimentais

Fungal Antagonism Assessment of Predatory Species and Producers Metabolites and Their Effectiveness on Haemonchus contortus Infective Larvae

The objective of this study was to assess antagonism of nematophagous fungi and species producers metabolites and their effectiveness on Haemonchus contortus infective larvae (L 3 ). Assay A assesses the synergistic, additive, or antagonistic effect on the production of spores of fungal isolates of the species Duddingtonia flagrans, Clonostachys rosea, Trichoderma esau, and Arthrobotrys musiformis; Assay B evaluates in vitro the effect of intercropping of these isolates grown in 2% water-agar (2% WA) on L 3 of H. contortus. D. flagrans (Assay A) produced 5.3 × 10 6 spores and associated with T. esau, A. musiformis, or C. rosea reduced its production by 60.37, 45.28, and 49.05%, respectively. T. esau produced 7.9 × 10 7 conidia and associated with D. flagrans, A. musiformis, or C. rosea reduced its production by 39.24, 82.27, and 96.96%, respectively. A. musiformis produced 7.3 × 10 9 spores and associated with D. flagrans, T. esau, or C. rosea reduced its production by 99.98, 99.99, and 99.98%, respectively. C. rosea produced 7.3 × 10 8 conidia and associated with D. flagrans, T. esau, or A. musiformis reduced its production by 95.20, 96.84, and 93.56%, respectively. These results show evidence of antagonism in the production of spores between predators fungi

Production of protease of Monacrosporium thaumasium (NF34a) and its utilization in control of Angiostrongylus vasorum larvae

Angiostrongylus vasorum é um nematóide que parasita cães domésticos e canídeos silvestres. O tratamento do hospedeiro definitivo (cães) é realizado com a utilização de antihelmínticos, contudo, devido à sua importância em humanos e animais, justifica-se o estudo de medidas alternativas que possam contribuir para o controle desse nematóide. Nesse contexto, a aplicação do controle biológico realizado com fungos nematófagos é uma alternativa que apresenta grande potencial. Fungos nematófagos produzem proteases extracelulares as quais podem estar diretamente envolvidas em diversas etapas da infecção dos ovos e das larvas. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo otimizar a produção, purificar, caracterizar e avaliar a aplicação da protease do fungo nematófago Monacrosporium thaumasium (NF34a) no controle de larvas de primeiro estádio de A. vasorum. Micélios fúngicos foram obtidos através da transferência de discos de cultura do isolado mantido em corn-meal-ágar 2% (CMA 2%) e transferidos para frascos contendo 50 ml de meio líquido que teve sua composição otimizada para a produção de protease. Em seguida, a protease foi purificada e caracterizada em relação ao seu pH, temperatura, termoestabilidade e influencia de sais no meio de reação. Por fim, foi demonstrada a atividade larvicida do extrato bruto e da protease purificada de M. thaumasium (NF34) sobre larvas de primeiro estágio de A. vasorum. O extrato de levedura, nos níveis avaliados, apresentou um efeito significativo (p<0,05) sobre a produção de protease. Observou-se também que a variável pH teve significância (p<0.1) sobre a produção de protease. Uma protease (Mt1) produzido por NF34a foi purificada em apenas um passo, utilizando-se uma cromatografia de troca iônica em pH 8,0. A massa molecular da enzima purificada (Mt1) foi de aproximadamente de 40 kDa. A atividade máxima da protease foi obtido na faixa de pH entre 7,0 e 8,0 e a 60 ºC. Os íons Mg+2 e o Zn+2 inibiram parcialmente a atividade de Mt1, enquanto o PMSF inibiu-a por completo. Por outro lado, Ca+2 causou um ligeiro aumento da atividade da protease. Em relação à atividade enzimática sobre L1 de A. vasorum, no intervalo de 24 horas, o extrato bruto produzido por NF34a, reduziu em 77,4% o número de larvas (p<0.05), enquanto a Mt1 reduziu em 23.9% o número das L1 de A. vasorum (p<0.05), em relação ao controle. Tanto o extrato bruto quanto a Mt1, mantiveram suas atividades biológicas intactas após incubação em temperatura de 28º C, durante 7 dias. Foi observada a produção de Mt1 quando M. thaumasium (NF34a) cresceu utilizando-se L1 de A. vasorum como única fonte de carbono e nitrogênio. Esses resultados demonstraram que a enzima pode ter um relevante papel no processo de infecção das larvas. Assim, maiores estudos sobre o mecanismo molecular da interação do fungo M. thaumasium com nematóides potencialmente zoonóticos são necessários.Angiostrongylus vasorum is a nematode that parasitizes domestic dogs and wild canids. The treatment of the definitive host (dogs) is accomplished with the use of anthelmintics, however, due to its importance in humans and animals, the study of alternative measures that may help in controlling this nematode is justified. In this context, the application of biological control performed with nematophagous fungi is an alternative that has great potential. Nematophagous fungi produce extracellular proteases which may be directly involved in various stages of infection of eggs and larvae. Thus, this study aimed to optimize production, purify, characterize and evaluate the application of protease of the nematophagous fungus Monacrosporium thaumasium (NF34a) in the control of first-stage-larvae of A. vasorum. Fungal mycelia were obtained by transferring culture disks of the isolated kept in 2% corn-meal-agar (2% CMA) and transferred to flasks containing 50 ml of liquid medium which had the composition optimized for the production of protease. Then, the protease was purified and characterized with respect to its pH, temperature, thermostability and influence of salts in the reaction medium. Finally, was evaluated the larvicidal activity of the crude extract and of the purified protease from M. thaumasium (NF34) on first-stage-larvae of A. vasorum. Yeast extract at the levels evaluated, showed a significant effect (p <0.05) on the production of protease. It was also observed that the variable pH was significant (p <0.1) on production of protease. A protease (Mt1) produced by NF34a was purified in only one step, using an ion exchange chromatography at pH 8.0. The molecular mass of purified enzyme (Mt1) was approximately 40 kDa. The maximum activity of protease was obtained at the pH range between 7.0 and 8.0 and 60 ° C. The ions Mg+2 and Zn+2 partially inhibited the activity of Mt1, whereas PMSF inhibited it completely. In contrast, Ca2+ caused a slight increase of protease activity. Regarding the enzymatic activity on A. vasorum L1 in the interval of 24 hours, the crude extract produced by NF34a, reduced in 77.4% the number of larvae (p <0.05) while Mt1 reduced in 23.9% the number of A. vasorum L1 (p <0.05), compared to control. Both the crude extract as Mt1, kept their biological activity intact after incubation at 28° C for 7 days. It was observed the production of Mt1 when M. thaumasium (NF34a) grew using A. vasorum L1 as the only source of carbon and nitrogen. These results demonstrate that the enzyme may have an important role in the infection of larvae. Thus, further studies about the molecular mechanism of the interaction of the fungus M. thaumasium with potential zoonotic nematodes are necessary.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerai

Production, purification and identification of extracellular enzymes from nematophagous fungi and their nematicidal activities

O controle biológico é uma das possíveis aplicações biotecnológicas de enzimas fúngicas. Este tipo de controle se destaca por ser uma alternativa “limpa”, sem o uso de produtos químicos que possam gerar possíveis resíduos. Nesse contexto, fungos nematófagos produzem enzimas extracelulares envolvidas em diversas etapas da infecção, como liberação de nutrientes para o crescimento do microrganismo, penetração da cutícula pela degradação proteica e digestão do tecido hospedeiro. O mecanismo molecular da ação patogênica de fungos contra nematoides não é completamente conhecido. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo otimizar a produção, purificar e caracterizar enzimas extracelulares produzidas por fungos nematófagos, bem como avaliar sua capacidade nematicida. Micélios obtidos da transferência de discos de cultura de três isolados de fungos nematófagos (Monacrosporium thaumasium (NF34), M. sinense (SF53) e Pochonia chlamydosporia (VC4)) mantidos em corn-meal-ágar 2% (CMA 2%) e transferidos para frascos contendo meio de cultura que teve sua composição otimizada para a produção de protease e quitinase. Em seguida, as enzimas foram purificadas e caracterizadas em relação ao pH e temperatura. Por fim, foi demonstrada a atividade nematicida dos extratos brutos e das enzimas purificadas sobre larvas de nematoides. Duas varíaveis (pH e tempo de incubação), apresentaram um efeito significativo (p 0,01) entre as concentrações de P. chlamydosporia na destruição de ovos. No entanto, houve uma tendência de aumento da mortalidade com o aumento da concentração de P. chlamydosporia. As proteases e quitinases do isolado VC4, causaram uma redução de percentagem significativa (p 0.01) between the concentrations of P. chlamydosporia in the destruction of eggs. However, there was a trend for increased mortality with increasing its concentration. Proteases and chitinases of isolate VC4 have caused a significant percentage reduction (p <0.01) in the number of viable eggs of D. renale, compared to control, with the following values of reduction: 27.8% (proteases), 29 4% (chitinase) and 43.4% (proteases + chitinases). More studies should be conducted to optimize enzyme production conditions and the application of these on nematodes.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic