Place de la biopsie en 2021 dans la démarche diagnostique des maladies mitochondriales.

National audienceLes maladies mitochondriales (MM) regroupent un ensemble de pathologies liées à un déficit de la chaine respiratoire mitochondriale (CRM). Elles sont dues à de mutations ou délétions dans des gènes localisés soit sur l’ADN mitochondrial, soit sur le génome nucléaire. Devant des symptômes évocateurs de cytopathie mitochondriale, la démarche diagnostique classique comprend la réalisation de bilans métaboliques de screening, l’imagerie, l’étude spécifique de la chaîne respiratoire, l’histopathologie et la biologie moléculaire. Les dosages des complexes de la CRM, l’histopathologie ainsi que l’analyse de l’ADNmt sont le plus souvent réalisés sur le muscle squelettique du fait des variations d’hétéroplasmie de l’ADNmt. Ces techniques longues et délicates permettent de mettre en évidence une possible MM mais ne distinguent pas les atteintes primaires des atteintes secondaires. Seule la mise en évidence du gène causal pose le diagnostic de MM. Depuis quelques années, la place croissante du NGS tend à systématiser les analyses moléculaires en première intention sur des matrices telles que les urines ou le sang. Etant donné l’expertise nécessaire pour l’interprétation de l’histologie, la complexité du dosage des complexes de la CRM, le caractère invasif d’une biopsie et la rapidité d’obtention des résultats moléculaires, nous avons décidé d’évaluer la place de la biopsie dans la démarche diagnostique des MM en 2021. Nous avons réalisé une étude rétrospective sur 260 patients en utilisant plusieurs paramètres: la CRM, l’examen anatomopathologique et les résultats de biologie moléculaire, en choisissant des critères histologiques et biochimiques « évocateurs de MM ». Nous avons ensuite évalué la sensibilité et spécificité des analyses musculaires en diagnostic mais aussi pour évaluer la pathogénicité des variants de signification inconnue. Dans notre cohorte, pour 76% des cas le diagnostic moléculaire pouvait obtenu sur le sang, dans 6% des cas sur un autre tissu comme les urines et pour les 18% les variants n’étaient détectés que sur l’ADN extrait du muscle. Notre étude a montré que la CRM est spécifique et peu sensible à l’inverse de l’étude histologique mais que dans les deux cas ces analyses ont une forte valeur prédictive négative (90%) mais une faible valeur prédictive positive (32%). Elles permettent d’avoir des arguments forts pour poursuivre les explorations moléculaires par un génome, lorsque les panels (non exhaustifs) sont négatifs. En ce qui concernant les VSI étudiés, l’étude fonctionnelle de la CRM a permis d’appuyer la pathogénicité de la mutation dans 42% des cas. La biopsie musculaire ne se situe plus forcément en amont des études moléculaires mais les complète lorsque celles –ci sont négatives. Elle reste tout de même essentielle pour le diagnostic de délétions uniques de l’ADNmt qui ne sont détectables que sur des ADNs extraits de muscle et est utile dans le diagnostic des MM à présentation musculaire (diagnostic différentiel)

Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients

To address the frequency of complex V defects, we systematically sequenced MT-ATP6/8 genes in 512 consecutive patients. We performed functional analysis in muscle or fibroblasts for 12 out of 27 putative homoplasmic mutations and in cybrids for four. Fibroblasts, muscle and cybrids with known deleterious mutations underwent parallel analysis. It included oxidative phosphorylation spectrophotometric assays, western blots, structural analysis, ATP production, glycolysis and cell proliferation evaluation. We demonstrated the deleterious nature of three original mutations. Striking gradation in severity of the mutations consequences and differences between muscle, fibroblasts and cybrids implied a likely under-diagnosis of human complex V defects

Intérêt du séquençage combiné du génome mitochondrial et d’un panel ciblé de gènes nucléaires impliqués dans les maladies mitochondriales

International audienceThe molecular study of mitochondrial diseases, essential for diagnosis, is special due to the dual genetic origin of these pathologies: mitochondrial DNA and nuclear DNA. Complete mtDNA sequencing still remains the first line diagnostic test followed if negative, by resequencing panels of several hundred mitochondrially-encoded nuclear genes. This strategy, with an initial entire mtDNA sequencing, is currently justified by the presence of nuclear mitochondrial DNA sequences (NUMTs) in the nuclear genome. We designed a resequencing panel combining the mtDNA and 135 nuclear genes which was evaluated compared to the performances of the standard mtDNA sequencing. Method validation was performed on the reading depth and reproducibility of the results. Thirty patients were analyzed by both methods. We were able to demonstrate that NUMTs did not impact the mtDNA sequencing quality, as the identified variants and mutant loads were identical with the reference mtDNA sequencing method. Reading depths were higher than the recommendations of the MitoDiag French diagnostic network, for the entire mtDNA for muscle and for 70% of the mtDNA for blood. These results highlight the usefulness of combining both mtDNA and mitochondrially nuclear-encoded genes and thus obtain more complete results and faster turnaround time for mitochondrial disease patients.Le diagnostic moléculaire des maladies mitochondriales est complexe du fait de la double origine génétique de ces pathologies : ADN mitochondrial (ADNmt) et ADN nucléaire (ADNn). Le séquençage complet de l’ADNmt reste l’analyse de première intention complété si besoin par l’étude de l’ADNn. Cette stratégie avec un séquençage isolé de l’ADNmt se justifie par l’existence de pseudogènes mitochondriaux au niveau nucléaire. Nous avons élaboré un panel comprenant l’ADNmt et 135 gènes nucléaires que nous avons comparés au séquençage isolé de l’ADNmt. Trente patients ont été analysés par les deux méthodes. La validation de méthode a été faite sur la profondeur de lecture et la reproductibilité des résultats. Nous avons mis en évidence l’absence d’impact des pseudogènes sur la détection et la quantification de l’hétéroplasmie des variants de l’ADNmt. Les profondeurs sont supérieures aux recommandations du réseau pour l’intégralité de l’ADNmt pour le muscle et pour 70 % pour le sang. Ces résultats mettent en avant l’intérêt du séquençage commun de l’ADNmt et ADNn permettant l’obtention de résultats complets, dans un délai plus court

Severe respiratory complex III defect prevents liver adaptation to prolonged fasting

International audienceBackground and aims: Next generation sequencing approaches have tremendously improved the diagnosis of rare genetic diseases. It may however be faced with difficult clinical interpretation of variants. Inherited enzymatic diseases provide an invaluable possibility to evaluate the function of the defective enzyme in human cell biology. This is the case for respiratory complex III, which has 11 structural subunits and requires several assembly factors. An important role of complex III in liver function is suggested by its frequent impairment in human cases of genetic complex III defects. Methods: We report the case of a child with complex III defect and acute liver dysfunction with lactic acidosis, hypoglycemia, and hyperammonemia. Mitochondrial activities were assessed in liver and fibroblasts using spectrophotometric assays. Genetic analysis was done by exome followed by Sanger sequencing. Functional complementation of defective fibroblasts was performed using lentiviral transduction followed by enzymatic analyses and expression assays. Results: Homozygous, truncating, mutations in LYRM7 and MTO1, two genes encoding essential mitochondrial proteins were found. Functional complementation of the complex III defect in fibroblasts demonstrated the causal role of LYRM7 mutations. Comparison of the patient’s clinical history to previously reported patients with complex III defect due to nuclear DNA mutations, some actually followed by us, showed striking similarities allowing us to propose common pathophysiology. Conclusions: Profound complex III defect in liver does not induce actual liver failure but impedes liver adaptation to prolonged fasting leading to severe lactic acidosis, hypoglycemia, and hyperammonemia, potentially leading to irreversible brain damage