Flavonoids Analysis by high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis - separation optimization and technological applications

No presente trabalho foram estudadas as separações de 18 flavonóides (9 agliconas e 9 glicosídeos) pelas técnicas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase reversa (RP-HPLC) e Cromatografia Micelar Eletrocinética em fluxo reverso (RF-Meck). Em ambas as técnicas foram avaliados solventes puros (metanol, acetonitrila e tetrahidrofurano) e suas misturas como formas de promover a variação de seletividade, através da modificação da fase móvel em HPLC, e da natureza do aditivo orgânico em RF-Meck. Nos estudos efetuados em HPLC utilizando-se gradiente, pode-se comprovar a possibilidade da modelagem do fator de retenção em funçã da proporção de solvente utilizados (MeOH, ACN, THF e suas misturas). Pode-se ainda, com base nos dados de retenção e na análise hierárquica de c1usters, diferenciar quatro diferentes grupos de sistemas cromatográficos com diferentes seletividades para flavonóides agliconas, e outros quatro com diferentes seletividades para glicosídeos. Os sistemas cromatográficos mais ortogonais (cada um pertencente a um grupo de seletividade) foram aplicados na separação de uma planta modelo (Azadirachta indica), de onde pode-se escolher a fase móvel mais seletiva para se otimizar a separação dos flavonóides glicosilados presentes nas folhas desta planta. No método final otimizado pode-se identificar e quantificar cinco dos flavonóides majoritários presentes, sendo três glicosídeos de quercetina (rutina, isoquercitrina e quercitrina) e dois glicosídeos de kaempferol (astragalin e nicotiflorin), em amostras de duas diferentes procedências (Piracicaba-SP e Silvânia-GO). Nos estudos envolvendo a separação dos dezoito flavonóides por RFMEKC pode-se comprovar diferenças significativas de seletividade quando se varia a natureza do solvente orgânico utilizado como aditivo, além de se observar tendências na migração em função das propriedades do solvente adicionado e da estrutura molecular do flavonóide. O solvente de menor eficiência para separação dos flavonóides foi o MeOH. Através da análise dos eletroferogramas obtidos através de um planejamento experimental de misturas, e das trocas de pares críticos observadas nos vários eletrólitos utilizados, obteve-se um método de separação com apenas um par crítico em menos de 12 minutos de corrida. O coeficiente de variação obtido para o fator de retenção foi de 1,5% e para área de 3%, considerando-se cinco injeções. O método desenvolvido foi aplicado com sucesso na identificação dos flavonóides majoritários presentes na planta modelo (Neem), obtendo-se o mesmo resultado do estudo anterior. Como forma de avaliar a concentração de flavonóides totais presentes em espécies vegetais é comum a análise de extratos após hidrólise ácida (conversão de todos glicosídeos em agliconas). Desta forma otimizou-se uma metodologia de separação em RP-HPLC de 8 flavonóides agliconas comumente presentes em alimentos e extratos vegetais de uso cosmético. A otimização foi efetuada mediante um planejamento experimental de misturas, para escolha da fase móvel mais seletiva, e de um planejamento fatorial composto central, para otimização das condições de gradiente. O método obtido foi o mais rápido já visto dentro da literatura consultada. A separação em linha de base foi efetuada em menos de 15 minutos, com coeficientes de variação de área entre 0,1 e 1,8%, coeficiente de correlação de 0,9993 a 0,9994 na faixa de 5 a 100 µg/mL, e limites de quantificação estimados na faixa de 0,1 a 0,21µg/mL. O método desenvolvido foi aplicado na otimização das condições de hidrólise de um extrato de Neem. A otimização foi efetuada através de metodologia de superfície de resposta, levando-se em consideração a concentração de ácido adicionada, o tempo de reação, a temperatura, e a concentração de um antioxidante (ácido ascórbico) adicionado. O resultado da otimização foi uma metodologia de hidrólise com tempo de reação igual a 5 minutos, utilizando-se 1,4 mol/L de HCI, 119°C e 500 µg/mL de ácido ascórbico. Através das metodologias de análise e de hidrólise desenvolvidas pode-se constatar a presença e quantificar no extrato de Neem os flavonóides agliconas quercetina, kaempferol e miricetina. Com o objetivo de se avaliar quais os componentes presentes em extratos vegetais são os responsáveis pelo poder antioxidante atribuído a determinadas plantas, foi montado um sistema de avaliação de poder antioxidante \"on-line\" com reação pós-coluna em HPLC (baseado na literatura) utilizando-se como \"radical livre modelo\" o ABTS. A análise da planta modelo (Neem) neste sistema mostrou que os flavonóides glicosilados identificados nas partes anteriores deste trabalho são os responsáveis pelo poder antioxidante atribuído a esta planta. De posse desta informação, e visando a obtenção de extratos para aplicações cosméticas com poder antioxidante, modelou-se a extração dos flavonóide do Neem em função da composição do solvente extrator (água, etanol , propilenoglicol e suas misturas), de acordo com um planejamento simplex centróide ampliado. Além da previsão da concentração dos princípios ativos pode-se ainda prever outras propriedades dos extratos obtidos, tais como, índice de refração e densidade, muitas vezes constituintes de especificações técnicas de acordo com as aplicações a que se destinam (cremes, xampús, etc).At this work, separation of 18 flavonoids (9 aglycones and 9 glycosides) using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Reduced Flow Micellar Electrokinetic Chromatography (RF-MEKC) were evaluated. For both techniques, pure solvents (methanol, acetonitrile and tetrahydrofuran) e their mixtures were evaluated as an approach of varying selectivity by changing mobile phase in HPLC and organic additive type in RF-MEKC. For HPLC studies using gradient elution, it was possible to guarantee the modeling for retention factor in function of organic solvent used (methanol, acetonitrile and tetrahydrofuran and theirs mixtures). It can be also confirmed, based on retention data and hierarquical clusters analysis, four different chromatographic groups with different selectivity for flavonoid aglycone, and four groups with different selectivity for glycosides. More orthogonal chromatographic systems (each one belonging to a selectivity group) were applied to Neem (Azadirachta Indica) analysis. From this study, it can be chosen the most selective mobile phase composition and optimize flavonoid glycosides separation present at Neem leaves. Applying optimized method, five major flavonoids can be identified and quantified, three quercetin glycosides (rutin, isoquercitrin and quercitrin) and two kaempferol glycosides (astragalin and nicotiflorin), at two samples from different origins (Piracicaba-SP and Silvânia-GO). For studies regarding eighteen flavonoids separation by RF-MEKC can be proved significant selectivity differences when distinct organic solvent are used as additive. Moreover, it can be noted tendencies in migration behaviour depending of solvent used and molecular structure of flavonoids. The solvent with less efficiency to f/avonoid separation is methanol. Analyzing electropherograms obtained by a design of mixtures and by criticai pairs changes observed in diverse electro/ytes, a separation method with only one criticai pair and 12 minutes run was obtained. Coefficient of variation obtained for retention factor was 1.5% and 3% for area (n=5). Developed method was applied to identify major flavonoids at model plant (Neem) and same results observed at previous work were obtained. In order to evaluate total flavonoid concentration present in a plant is a common approach to analyse extracts after acid hydrolyze (convert ali glycosides to aglycones). A method was optimized to separate 8 flavonoid aglicones by RPHPLC usually present in food and vegetal extracts to cosmetic use. Optimization was performed by a mixture factorial design to select the most selective mobile phase composition and one facto ria I design with central point to optimize gradient parameters. Developed methodology is the faster reported in literature until now. Baseline separation was achieved in less than 15 minutes, with coefficients of variation between 0.1 and 1.8%, correlation coefficient from 0,9993 to 0,9994 at 5-100 µg/mL concentration range and quantification limits from 0.1 to 0.21 µg/mL. Developed method was used to optimize hydrolize parameters for a Neem extract. Optimization was realized by a response surface methodology, having concentration of acid added, reaction time, temperature and antioxidant (ascorbic acid) concentration added as parameters. From this study was developed a hydrolyze methodology with 5 minutes of reaction time, using 1.4 mol/L HCI, 119°C and 500 µg/mL of ascorbic acid. Applying method of analysis and hydrolyze developed at Neem extracts it can be identified and quantified aglicones quercetin, kaempferol and miricetin. Aiming to evaluate which compounds in a vegetal extract have antioxidant activity credited to some plants, an on-line system with post-column reaction was built in HPLC (based on literature), using ABTS as free radical mode!. Neem analysis at this system showed that flavonoid glycosides identified before are the responsible for antioxidant activity described for this plant. Based on this information and intending to obtain vegetal extracts with antioxidant activity for cosmetic use, Neem extraction procedure was modeled in function of solvent mixture used (water, ethanol, propylene glycol and their mixtures), following a simplex centroid designo Besides the concentration of active components prediction it can also be predict other properties like refractive index and density, properties that might be included at technical specifications depending of the intended use (creams, shampoos, etc)

Flavonoids Analysis by high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis - separation optimization and technological applications

No presente trabalho foram estudadas as separações de 18 flavonóides (9 agliconas e 9 glicosídeos) pelas técnicas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase reversa (RP-HPLC) e Cromatografia Micelar Eletrocinética em fluxo reverso (RF-Meck). Em ambas as técnicas foram avaliados solventes puros (metanol, acetonitrila e tetrahidrofurano) e suas misturas como formas de promover a variação de seletividade, através da modificação da fase móvel em HPLC, e da natureza do aditivo orgânico em RF-Meck. Nos estudos efetuados em HPLC utilizando-se gradiente, pode-se comprovar a possibilidade da modelagem do fator de retenção em funçã da proporção de solvente utilizados (MeOH, ACN, THF e suas misturas). Pode-se ainda, com base nos dados de retenção e na análise hierárquica de c1usters, diferenciar quatro diferentes grupos de sistemas cromatográficos com diferentes seletividades para flavonóides agliconas, e outros quatro com diferentes seletividades para glicosídeos. Os sistemas cromatográficos mais ortogonais (cada um pertencente a um grupo de seletividade) foram aplicados na separação de uma planta modelo (Azadirachta indica), de onde pode-se escolher a fase móvel mais seletiva para se otimizar a separação dos flavonóides glicosilados presentes nas folhas desta planta. No método final otimizado pode-se identificar e quantificar cinco dos flavonóides majoritários presentes, sendo três glicosídeos de quercetina (rutina, isoquercitrina e quercitrina) e dois glicosídeos de kaempferol (astragalin e nicotiflorin), em amostras de duas diferentes procedências (Piracicaba-SP e Silvânia-GO). Nos estudos envolvendo a separação dos dezoito flavonóides por RFMEKC pode-se comprovar diferenças significativas de seletividade quando se varia a natureza do solvente orgânico utilizado como aditivo, além de se observar tendências na migração em função das propriedades do solvente adicionado e da estrutura molecular do flavonóide. O solvente de menor eficiência para separação dos flavonóides foi o MeOH. Através da análise dos eletroferogramas obtidos através de um planejamento experimental de misturas, e das trocas de pares críticos observadas nos vários eletrólitos utilizados, obteve-se um método de separação com apenas um par crítico em menos de 12 minutos de corrida. O coeficiente de variação obtido para o fator de retenção foi de 1,5% e para área de 3%, considerando-se cinco injeções. O método desenvolvido foi aplicado com sucesso na identificação dos flavonóides majoritários presentes na planta modelo (Neem), obtendo-se o mesmo resultado do estudo anterior. Como forma de avaliar a concentração de flavonóides totais presentes em espécies vegetais é comum a análise de extratos após hidrólise ácida (conversão de todos glicosídeos em agliconas). Desta forma otimizou-se uma metodologia de separação em RP-HPLC de 8 flavonóides agliconas comumente presentes em alimentos e extratos vegetais de uso cosmético. A otimização foi efetuada mediante um planejamento experimental de misturas, para escolha da fase móvel mais seletiva, e de um planejamento fatorial composto central, para otimização das condições de gradiente. O método obtido foi o mais rápido já visto dentro da literatura consultada. A separação em linha de base foi efetuada em menos de 15 minutos, com coeficientes de variação de área entre 0,1 e 1,8%, coeficiente de correlação de 0,9993 a 0,9994 na faixa de 5 a 100 µg/mL, e limites de quantificação estimados na faixa de 0,1 a 0,21µg/mL. O método desenvolvido foi aplicado na otimização das condições de hidrólise de um extrato de Neem. A otimização foi efetuada através de metodologia de superfície de resposta, levando-se em consideração a concentração de ácido adicionada, o tempo de reação, a temperatura, e a concentração de um antioxidante (ácido ascórbico) adicionado. O resultado da otimização foi uma metodologia de hidrólise com tempo de reação igual a 5 minutos, utilizando-se 1,4 mol/L de HCI, 119°C e 500 µg/mL de ácido ascórbico. Através das metodologias de análise e de hidrólise desenvolvidas pode-se constatar a presença e quantificar no extrato de Neem os flavonóides agliconas quercetina, kaempferol e miricetina. Com o objetivo de se avaliar quais os componentes presentes em extratos vegetais são os responsáveis pelo poder antioxidante atribuído a determinadas plantas, foi montado um sistema de avaliação de poder antioxidante \"on-line\" com reação pós-coluna em HPLC (baseado na literatura) utilizando-se como \"radical livre modelo\" o ABTS. A análise da planta modelo (Neem) neste sistema mostrou que os flavonóides glicosilados identificados nas partes anteriores deste trabalho são os responsáveis pelo poder antioxidante atribuído a esta planta. De posse desta informação, e visando a obtenção de extratos para aplicações cosméticas com poder antioxidante, modelou-se a extração dos flavonóide do Neem em função da composição do solvente extrator (água, etanol , propilenoglicol e suas misturas), de acordo com um planejamento simplex centróide ampliado. Além da previsão da concentração dos princípios ativos pode-se ainda prever outras propriedades dos extratos obtidos, tais como, índice de refração e densidade, muitas vezes constituintes de especificações técnicas de acordo com as aplicações a que se destinam (cremes, xampús, etc).At this work, separation of 18 flavonoids (9 aglycones and 9 glycosides) using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Reduced Flow Micellar Electrokinetic Chromatography (RF-MEKC) were evaluated. For both techniques, pure solvents (methanol, acetonitrile and tetrahydrofuran) e their mixtures were evaluated as an approach of varying selectivity by changing mobile phase in HPLC and organic additive type in RF-MEKC. For HPLC studies using gradient elution, it was possible to guarantee the modeling for retention factor in function of organic solvent used (methanol, acetonitrile and tetrahydrofuran and theirs mixtures). It can be also confirmed, based on retention data and hierarquical clusters analysis, four different chromatographic groups with different selectivity for flavonoid aglycone, and four groups with different selectivity for glycosides. More orthogonal chromatographic systems (each one belonging to a selectivity group) were applied to Neem (Azadirachta Indica) analysis. From this study, it can be chosen the most selective mobile phase composition and optimize flavonoid glycosides separation present at Neem leaves. Applying optimized method, five major flavonoids can be identified and quantified, three quercetin glycosides (rutin, isoquercitrin and quercitrin) and two kaempferol glycosides (astragalin and nicotiflorin), at two samples from different origins (Piracicaba-SP and Silvânia-GO). For studies regarding eighteen flavonoids separation by RF-MEKC can be proved significant selectivity differences when distinct organic solvent are used as additive. Moreover, it can be noted tendencies in migration behaviour depending of solvent used and molecular structure of flavonoids. The solvent with less efficiency to f/avonoid separation is methanol. Analyzing electropherograms obtained by a design of mixtures and by criticai pairs changes observed in diverse electro/ytes, a separation method with only one criticai pair and 12 minutes run was obtained. Coefficient of variation obtained for retention factor was 1.5% and 3% for area (n=5). Developed method was applied to identify major flavonoids at model plant (Neem) and same results observed at previous work were obtained. In order to evaluate total flavonoid concentration present in a plant is a common approach to analyse extracts after acid hydrolyze (convert ali glycosides to aglycones). A method was optimized to separate 8 flavonoid aglicones by RPHPLC usually present in food and vegetal extracts to cosmetic use. Optimization was performed by a mixture factorial design to select the most selective mobile phase composition and one facto ria I design with central point to optimize gradient parameters. Developed methodology is the faster reported in literature until now. Baseline separation was achieved in less than 15 minutes, with coefficients of variation between 0.1 and 1.8%, correlation coefficient from 0,9993 to 0,9994 at 5-100 µg/mL concentration range and quantification limits from 0.1 to 0.21 µg/mL. Developed method was used to optimize hydrolize parameters for a Neem extract. Optimization was realized by a response surface methodology, having concentration of acid added, reaction time, temperature and antioxidant (ascorbic acid) concentration added as parameters. From this study was developed a hydrolyze methodology with 5 minutes of reaction time, using 1.4 mol/L HCI, 119°C and 500 µg/mL of ascorbic acid. Applying method of analysis and hydrolyze developed at Neem extracts it can be identified and quantified aglicones quercetin, kaempferol and miricetin. Aiming to evaluate which compounds in a vegetal extract have antioxidant activity credited to some plants, an on-line system with post-column reaction was built in HPLC (based on literature), using ABTS as free radical mode!. Neem analysis at this system showed that flavonoid glycosides identified before are the responsible for antioxidant activity described for this plant. Based on this information and intending to obtain vegetal extracts with antioxidant activity for cosmetic use, Neem extraction procedure was modeled in function of solvent mixture used (water, ethanol, propylene glycol and their mixtures), following a simplex centroid designo Besides the concentration of active components prediction it can also be predict other properties like refractive index and density, properties that might be included at technical specifications depending of the intended use (creams, shampoos, etc)

Simple method for determination of cocaine and main metabolites in urine by CE coupled to MS

in this work, a simple method for the simultaneous determination of cocaine (COC) and five COC metabolites (benzoylecgonine, cocaethylene (CET), anhydroecgonine, anhydroecgonine methyl ester and ecgonine methyl ester) in human urine using CE coupled to MS via electrospray ionization (CE-ESI-MS) was developed and validated. Formic acid at 1 mol/L concentration was used as electrolyte whereas formic acid at 0.05 mol/L concentration in 1:1 methanol:water composed the coaxial sheath liquid at the ESI nozzle. The developed method presented good linearity in the dynamic range from 250 ng/mL to 5000 ng/mL (coefficient of determination greater than 0.98 for all compounds). LODs (signal-to-noise ratio of 3) were 100 ng/mL for COC and CET and 250 ng/mL for the other studied metabolites whereas LOQ`s (signal-to-noise ratio of 10) were 250 ng/mL for COC and CET and 500 ng/mL for all other compounds. Intra-day precision and recovery tests estimated at three different concentration levels (500, 1500 and 5000 ng/mL) provided RSD lower than 10% (except anhydroecgonine, 18% RSD) and recoveries from 83-109% for all analytes. The method was successfully applied to real cases. For the positive urine samples, the presence of COC and its` metabolites was further confirmed by MS/MS experiments

Applications of capillary electrophoresis to the analysis of compounds of clinical, forensic, cosmetological, environmental, nutritional and pharmaceutical importance

Since its inception in the 80's, capillary electrophoresis has matured into a well-established separation technique, actually encompassing a family of electrodriven techniques with distinct separation mechanisms and selectivity, performed in a single capillary column. In this work, the versatility of capillary electrophoresis in handling materials from a diversity of chemical classes and complex sample matrices is illustrated by representative applications in the clinical, forensic, cosmetological, environmental, nutritional and pharmaceutical areas, grouping together our own research interests and results