Characterization of mutations involved in resistance to streptomycin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and its relation with the efflux system

O Mycobacterium tuberculosis é intrinsecamente resistente a diversos antimicrobianos. Esta resistência é devida, principalmente, ao envelope hidrofóbico da célula bacteriana que atua como uma barreira efetiva para diversos compostos. Outros determinantes da sua resistência intrínseca incluem enzimas hidrolíticas e bombas de efluxo de drogas. A resistência adquirida em isolados clínicos de M. tuberculosis é principalmente devida a mutações em genes que codificam alvos para os fármacos ou em seus ativadores. Apesar disso, um número entre 5–30% das cepas resistentes não têm caracterizado o seu mecanismo de resistência, considerando-se o sistema de efluxo como uma das possibilidades para esta resistência. O efluxo é o resultado da atividade de proteínas transportadoras envolvidas na extrusão de substâncias (incluindo todas as classes de relevantes antimicrobianos clínicos) de dentro da célula para o meio externo. O principal objetivo deste trabalho foi comparar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) em condições de diferentes tratamentos (presença e ausência de inibição do sistema de efluxo) e os resultados obtidos com o seqüenciamento dos genes rpsL e rrs. Para isso foram testados 79 isolados de M. tuberculosis, destes, 43 (54%) isolados apresentaram mutações; 38 (48%) diminuíram a CMI na presença de inibidores do sistema de efluxo, sendo que isso ocorreu tanto em isolados resistentes ou sensíveis, mutados ou não-mutados. Em três isolados resistentes a estreptomicina não foram identificadas alterações nos genes rpsL e rrs e na presença de inibidores do sistema de efluxo a resistência foi diminuída. A diminuição da CMI nesses isolados resistentes, embora sem mutação, indica uma possível participação do sistema de efluxo. Nas cepas mutadas, o mecanismo de efluxo, estaria aumentando a tolerância do isolado à concentração da droga. Estas últimas possuiriam dois mecanismos de resistência atuantes (mutação nos genes alvo do fármaco e superexpressão das proteínas de membrana responsáveis pelo efluxo de drogas).Mycobacterium tuberculosis is naturally resistant to many antimicrobials. This resistance is due mainly to the hydrophobic cell envelope acting as an effective permeability barrier for many compounds. Other determinants ones of its intrinsic resistance include hydrolytic enzymes and efflux pumps of drugs. The acquired resistance in clinical isolates of M. tuberculosis is mainly due to mutations in genes that encode targets for drugs substances or in their activators. Even so, in 5-30% of the resistant strains the resistance mechanism is not known and the efflux system has been considered as one of the possibilities for this resistance. Efflux is the result of the activity of transport proteins involved in extrusion of substances (including all classes of clinically relevant antimicrobials) from the interior of the cells into the external environment. The main goal of this study is to compare the Minimal Inibitory Concentration (MIC) in different conditions (with or without efflux system inhibitors) and the sequencing data of the rpsL and rrs genes. For that we have analized 79 M. tuberculosis isolates, and from these, 43 (54%) presented mutations; 38 (48%) decreased the MIC in presence of efflux system inhibitors. This decrease in MIC occurred in resistant or sensitive isolates, with or without mutations. Three resistant isolates did not present any mutations in rpsL and rrs genes and in presence of efflux system inhibitors the resistance decreased. The decrease of MIC in these resistant isolates, although without mutation, indicates participation of the efflux system. In the mutated isolates the efflux system could increase the tolerance to drug concentration. In these isolates two resistance mechanisms must be acting (mutation on the drug target genes and over-expression of membrane proteins responsible for the drug efflux)

Determinação do custo biológico em isolados de Mycobacterium tuberculosis com mutações nos genes rpsL, rrs, gidB, rpoB e katG

Uma vez que poucas drogas são ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis, torna-se muito importante se conhecer os mecanismos que levam a resistência e, embora, tenha-se aprendido muito sobre a resistência, ainda existem alguns antimicrobianos onde esse mecanismo não está completamente elucidado. A aquisição da resistência aos antimicrobianos em bactérias, por sua vez, é frequentemente associada com a perda de fitness e é muito importante a determinação do fitness na população, já que, ele pode influenciar a o futuro da epidemia de isolados resistentes a múltiplas drogas. As mutações associadas com a resistência a estreptomicina nos genes rpsL e rrs são bem conhecidas e podem explicar em torno de 70% da resistência fenotípica. Mutações no gene gidB foram descritas recentemente em isolados clínicos de M. tuberculosis como associadas com a resistência a baixas concentrações de estreptomicina. Nesse estudo, mutações em gidB ocorreram em 27% das cepas resistentes a estreptomicina sem mutações nos genes rpsL e rrs. Duas mutações foram consideradas polimorfismos, gidB16 (alelo 16G) foi identificado exclusivamente no genótipo Latin American Mediterranean, enquanto que gidB92 (alelo 92C) foi associado com a linhagem Beijing. O fitness de 21 cepas multidroga resistentes de M. tuberculosis foi estudado através do método de quantificação da redução da resazurina, enquanto o fitness de 78 cepas foi estudado através de curvas de crescimento utilizando o mycobacterial growth indicator tube e estudos de competição com alguns isolados selecionados. Em geral, analisando-se as curvas de crescimento, em ambos os estudos as cepas com mutações K43R em rpsL e S531L em rpoB ou cresceram melhor ou sem diferença do isolado sensível, já os isolados com mutações em rpoB- não em S531L e com mutações em mais de um gene cresceram em média mais lentamente que os isolados sensíveis. Quanto às diferentes linhagens, no primeiro estudo, os isolados classificados como Latin American Mediterranean cresceram mais rápido no parâmetro tamanho da fase lag, mas sem nenhuma diferença na fase logarítmica, já no segundo estudo, o resultado foi diferente, as cepas não-Latin American Mediterranean cresceram em média mais rapidamente, mas sem diferença estatística das cepas Latin American Mediterranean, e também cresceram melhor nos ensaios de competição. O fitness dos isolados clínicos estudados é muito heterogêneo, possivelmente devido ao fato desses isolados apresentarem diferentes graus de resistência às drogas, diferentes mutações nos genes e ainda diferentes genótipos. Em ambos os estudos foi possível afirmar que as mutações mais encontradas em isolados clínicos são as mutações não relacionadas com a perda do fitness ou que geram pouco custo biológico ao isolado.Since few drugs are active against the Mycobacterium tuberculosis, it is very important to know the mechanisms that lead to resistance and, although much has been learned about the resistance, there are still some antimicrobials where it is not fully understood. The acquisition of antimicrobial resistance in bacteria is often associated with a loss in fitness and it is very important to have the fitness determined in the population, since it can influence the future of the multidrug isolates epidemic. Mutations related to streptomycin-resistance in the rpsL and rrs genes are well known and can explain about 70% of the phenotypic resistance. Mutations in the gidB gene were described recently as being associated with resistance to low concentrations of streptomycin in strains of M. tuberculosis. In this study, mutations in gidB occurred in 27% of streptomycin-resistant strains without mutations in the rrs and rpsL genes. Two mutations were considered polymorphisms, gidB16 (16G allele) was found exclusively in Latin American Mediterranean genotype, while gidB92 (92C allele) was associated with Beijing lineage in another population. The fitness of 21 multidrug resistant strains of M. tuberculosis was studied by the method of quantitative resazurin reduction assay and fitness of 78 strains was studied by growth curves in mycobacterial growth indicator tube and competition assays using some selected strains. In general, analyzing the growth curves in both studies the strains with the mutations rpsL K43R and rpoB S531L grew better or with no difference from the susceptible strain, on the other hand, strains with mutations in rpoB-but not S531L and with mutations in more than one gene grew, on average, more slowly than susceptible ones. Regarding the different lineages from the first study, strains classified as Latin American Mediterranean grew faster in the parameter of the lag phase, but with no difference in the logarithmic phase. In the second study, the outcome was different, non- Latin American Mediterranean strains grew faster on average, but with no statistical difference from Latin American Mediterranean strains, and also grew well in the competition assays. The fitness of the clinical isolates studied is very heterogeneous, possibly because these isolates present varying degrees of drug resistance, different mutations in the genes analyzed and even different genotypes. In both studies we can say that the frequently mutations found in clinical isolates are the mutations related with no fitness cost or that generate little fitness cost

Determinação do custo biológico em isolados de Mycobacterium tuberculosis com mutações nos genes rpsL, rrs, gidB, rpoB e katG

Uma vez que poucas drogas são ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis, torna-se muito importante se conhecer os mecanismos que levam a resistência e, embora, tenha-se aprendido muito sobre a resistência, ainda existem alguns antimicrobianos onde esse mecanismo não está completamente elucidado. A aquisição da resistência aos antimicrobianos em bactérias, por sua vez, é frequentemente associada com a perda de fitness e é muito importante a determinação do fitness na população, já que, ele pode influenciar a o futuro da epidemia de isolados resistentes a múltiplas drogas. As mutações associadas com a resistência a estreptomicina nos genes rpsL e rrs são bem conhecidas e podem explicar em torno de 70% da resistência fenotípica. Mutações no gene gidB foram descritas recentemente em isolados clínicos de M. tuberculosis como associadas com a resistência a baixas concentrações de estreptomicina. Nesse estudo, mutações em gidB ocorreram em 27% das cepas resistentes a estreptomicina sem mutações nos genes rpsL e rrs. Duas mutações foram consideradas polimorfismos, gidB16 (alelo 16G) foi identificado exclusivamente no genótipo Latin American Mediterranean, enquanto que gidB92 (alelo 92C) foi associado com a linhagem Beijing. O fitness de 21 cepas multidroga resistentes de M. tuberculosis foi estudado através do método de quantificação da redução da resazurina, enquanto o fitness de 78 cepas foi estudado através de curvas de crescimento utilizando o mycobacterial growth indicator tube e estudos de competição com alguns isolados selecionados. Em geral, analisando-se as curvas de crescimento, em ambos os estudos as cepas com mutações K43R em rpsL e S531L em rpoB ou cresceram melhor ou sem diferença do isolado sensível, já os isolados com mutações em rpoB- não em S531L e com mutações em mais de um gene cresceram em média mais lentamente que os isolados sensíveis. Quanto às diferentes linhagens, no primeiro estudo, os isolados classificados como Latin American Mediterranean cresceram mais rápido no parâmetro tamanho da fase lag, mas sem nenhuma diferença na fase logarítmica, já no segundo estudo, o resultado foi diferente, as cepas não-Latin American Mediterranean cresceram em média mais rapidamente, mas sem diferença estatística das cepas Latin American Mediterranean, e também cresceram melhor nos ensaios de competição. O fitness dos isolados clínicos estudados é muito heterogêneo, possivelmente devido ao fato desses isolados apresentarem diferentes graus de resistência às drogas, diferentes mutações nos genes e ainda diferentes genótipos. Em ambos os estudos foi possível afirmar que as mutações mais encontradas em isolados clínicos são as mutações não relacionadas com a perda do fitness ou que geram pouco custo biológico ao isolado.Since few drugs are active against the Mycobacterium tuberculosis, it is very important to know the mechanisms that lead to resistance and, although much has been learned about the resistance, there are still some antimicrobials where it is not fully understood. The acquisition of antimicrobial resistance in bacteria is often associated with a loss in fitness and it is very important to have the fitness determined in the population, since it can influence the future of the multidrug isolates epidemic. Mutations related to streptomycin-resistance in the rpsL and rrs genes are well known and can explain about 70% of the phenotypic resistance. Mutations in the gidB gene were described recently as being associated with resistance to low concentrations of streptomycin in strains of M. tuberculosis. In this study, mutations in gidB occurred in 27% of streptomycin-resistant strains without mutations in the rrs and rpsL genes. Two mutations were considered polymorphisms, gidB16 (16G allele) was found exclusively in Latin American Mediterranean genotype, while gidB92 (92C allele) was associated with Beijing lineage in another population. The fitness of 21 multidrug resistant strains of M. tuberculosis was studied by the method of quantitative resazurin reduction assay and fitness of 78 strains was studied by growth curves in mycobacterial growth indicator tube and competition assays using some selected strains. In general, analyzing the growth curves in both studies the strains with the mutations rpsL K43R and rpoB S531L grew better or with no difference from the susceptible strain, on the other hand, strains with mutations in rpoB-but not S531L and with mutations in more than one gene grew, on average, more slowly than susceptible ones. Regarding the different lineages from the first study, strains classified as Latin American Mediterranean grew faster in the parameter of the lag phase, but with no difference in the logarithmic phase. In the second study, the outcome was different, non- Latin American Mediterranean strains grew faster on average, but with no statistical difference from Latin American Mediterranean strains, and also grew well in the competition assays. The fitness of the clinical isolates studied is very heterogeneous, possibly because these isolates present varying degrees of drug resistance, different mutations in the genes analyzed and even different genotypes. In both studies we can say that the frequently mutations found in clinical isolates are the mutations related with no fitness cost or that generate little fitness cost

Characterization of mutations involved in resistance to streptomycin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and its relation with the efflux system

O Mycobacterium tuberculosis é intrinsecamente resistente a diversos antimicrobianos. Esta resistência é devida, principalmente, ao envelope hidrofóbico da célula bacteriana que atua como uma barreira efetiva para diversos compostos. Outros determinantes da sua resistência intrínseca incluem enzimas hidrolíticas e bombas de efluxo de drogas. A resistência adquirida em isolados clínicos de M. tuberculosis é principalmente devida a mutações em genes que codificam alvos para os fármacos ou em seus ativadores. Apesar disso, um número entre 5–30% das cepas resistentes não têm caracterizado o seu mecanismo de resistência, considerando-se o sistema de efluxo como uma das possibilidades para esta resistência. O efluxo é o resultado da atividade de proteínas transportadoras envolvidas na extrusão de substâncias (incluindo todas as classes de relevantes antimicrobianos clínicos) de dentro da célula para o meio externo. O principal objetivo deste trabalho foi comparar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) em condições de diferentes tratamentos (presença e ausência de inibição do sistema de efluxo) e os resultados obtidos com o seqüenciamento dos genes rpsL e rrs. Para isso foram testados 79 isolados de M. tuberculosis, destes, 43 (54%) isolados apresentaram mutações; 38 (48%) diminuíram a CMI na presença de inibidores do sistema de efluxo, sendo que isso ocorreu tanto em isolados resistentes ou sensíveis, mutados ou não-mutados. Em três isolados resistentes a estreptomicina não foram identificadas alterações nos genes rpsL e rrs e na presença de inibidores do sistema de efluxo a resistência foi diminuída. A diminuição da CMI nesses isolados resistentes, embora sem mutação, indica uma possível participação do sistema de efluxo. Nas cepas mutadas, o mecanismo de efluxo, estaria aumentando a tolerância do isolado à concentração da droga. Estas últimas possuiriam dois mecanismos de resistência atuantes (mutação nos genes alvo do fármaco e superexpressão das proteínas de membrana responsáveis pelo efluxo de drogas).Mycobacterium tuberculosis is naturally resistant to many antimicrobials. This resistance is due mainly to the hydrophobic cell envelope acting as an effective permeability barrier for many compounds. Other determinants ones of its intrinsic resistance include hydrolytic enzymes and efflux pumps of drugs. The acquired resistance in clinical isolates of M. tuberculosis is mainly due to mutations in genes that encode targets for drugs substances or in their activators. Even so, in 5-30% of the resistant strains the resistance mechanism is not known and the efflux system has been considered as one of the possibilities for this resistance. Efflux is the result of the activity of transport proteins involved in extrusion of substances (including all classes of clinically relevant antimicrobials) from the interior of the cells into the external environment. The main goal of this study is to compare the Minimal Inibitory Concentration (MIC) in different conditions (with or without efflux system inhibitors) and the sequencing data of the rpsL and rrs genes. For that we have analized 79 M. tuberculosis isolates, and from these, 43 (54%) presented mutations; 38 (48%) decreased the MIC in presence of efflux system inhibitors. This decrease in MIC occurred in resistant or sensitive isolates, with or without mutations. Three resistant isolates did not present any mutations in rpsL and rrs genes and in presence of efflux system inhibitors the resistance decreased. The decrease of MIC in these resistant isolates, although without mutation, indicates participation of the efflux system. In the mutated isolates the efflux system could increase the tolerance to drug concentration. In these isolates two resistance mechanisms must be acting (mutation on the drug target genes and over-expression of membrane proteins responsible for the drug efflux)

Tuberculosis recurrence in a high incidence setting for HIV and tuberculosis in Brazil

Background: To compare epidemiological data between recurrent cases after cure (RC), distinguishing relapse from reinfection, after dropout (RD) and new cases (NC) in an ambulatory setting in a TB-endemic country. Methods: Records of patients who started treatment for pulmonary TB between 2004 and 2010 in a TB clinic were reviewed. Epidemiological data were analyzed. Spoligotyping and MIRU patterns were used to determine relapse or reinfection in 13 RC available. Results: Of the eligible group (1449), 1060 were NC (73.2%), among the recurrent cases, 203 (14%) were RC and 186 (12.8%) were RD. Of RC, 171 (84.2%) occurred later than 6 months after a previous episode, 13 had available DNA, in 4 (30.7%) the disease was attributed to reinfection and in 9 (69.3%), to relapse. Comparing RC to NC, HIV (p < 0.0001) was independent risk factor for RC. When RC and RD were compared, alcohol abuse (p = 0.001) and treatment noncompliance (p = 0.006) were more frequent in RD. Conclusions: HIV is the sole more important associated factor for RC. This finding points the need to improve the approach to manage TB in order to decrease the chance for exposure especially in vulnerable people with increased risk of developing disease and to improve DOTS strategy to deal with factors associated to treatment noncompliance

Tuberculosis recurrence in a high incidence setting for HIV and tuberculosis in Brazil

Background: To compare epidemiological data between recurrent cases after cure (RC), distinguishing relapse from reinfection, after dropout (RD) and new cases (NC) in an ambulatory setting in a TB-endemic country. Methods: Records of patients who started treatment for pulmonary TB between 2004 and 2010 in a TB clinic were reviewed. Epidemiological data were analyzed. Spoligotyping and MIRU patterns were used to determine relapse or reinfection in 13 RC available. Results: Of the eligible group (1449), 1060 were NC (73.2%), among the recurrent cases, 203 (14%) were RC and 186 (12.8%) were RD. Of RC, 171 (84.2%) occurred later than 6 months after a previous episode, 13 had available DNA, in 4 (30.7%) the disease was attributed to reinfection and in 9 (69.3%), to relapse. Comparing RC to NC, HIV (p < 0.0001) was independent risk factor for RC. When RC and RD were compared, alcohol abuse (p = 0.001) and treatment noncompliance (p = 0.006) were more frequent in RD. Conclusions: HIV is the sole more important associated factor for RC. This finding points the need to improve the approach to manage TB in order to decrease the chance for exposure especially in vulnerable people with increased risk of developing disease and to improve DOTS strategy to deal with factors associated to treatment noncompliance