Analysis of Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20: Phylogeny and Presence of a Putative Insertion Sequence

O estudo de filogenia baseado em seqüências de rDNA de Lactobacillus UFV H2b20 mostrou que esse microrganismo foi agrupado entre as subespécies de Lactobacillus delbrueckii. Este resultado confirma a nova classificação do isolado, baseada na hibridização DNA-DNA. A análise das substituições de bases mostra que a maioria é causada pela desaminação da 5-metilcitosina, o que causa uma transição GC/AT. A técnica PCR-DGGE de L. delbrueckii UFV H2b20 demonstrou resultados satisfatórios na análise de polimorfismos do operon rrn em microrganismos isolados. Foram encontradas cinco bandas diferentes para o L. delbrueckii UFV H2b20, confirmando a presença de cinco cópias distintas do rDNA 16S nesse microrganismo e possivelmente seis no total. O isolado L. delbrueckii UFV H2b20 apresentou um perfil de bandas diferente das outras linhagens de Lactobacillus, o que poderá ser utilizado para diferenciá-lo dos demais, uma vez que outros métodos baseados em PCR, como RAPD, mostram-se pouco discriminatórios. A análise das seqüências da região do rDNA 16S revelou uma seqüência de inserção putativa, de 915 pb, que foi caracterizada e denominada ISLdH2b20. Ela apresenta uma única ORF e codifica uma transposase putativa que apresenta homologia com a transposase de ISL5. Todos os elementos característicos de uma IS foram identificados bem como as seqüências regulatórias putativas da transposase.Phylogenetic analysis of Lactobacillus UFV H2b20 based on the 16S rDNA sequence positions this isolate among the Lactobacillus delbrueckii subspecies. It confirms the classification by DNA/DNA hybridization. Comparisons of the substituted bases along the 16S rDNA sequence show that most are probably caused by 5-methylcytosine deamination that results in GC/AT transition. Presence of polymorphic copies of the 16S rRNA gene in Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 were confirmed by PCR-DGGE. Five distinct bands of rDNA amplified sequences confirm at least five different copies of the gene. The intensity of one of the bands allows the inference of two identical copies. The DGGE profile of this isolate was different from those of other L. delbrueckii strains, providing a mean to distinguish it in mixed cultures. Analysis of the nucleotide sequences along the rDNA region revealed the presence of putative insertion sequences. One of them, 915 bp long, was characterized and denominated ISLdH2b20. It presents a single ORF that encodes a putative transposase with some homology to the one of ISL5 of L. delbrueckii subsp. bulgaricus. All the characteristic elements of an IS were located as well as the putative regulatory sequences of the transposase.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerai

Surface characteristics of the probiotic Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20

Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 tem demonstrado alto potencial de colonizar o intestino de camundongos livres de germes e, também, de imunoestimulação. Essa bactéria possui características fisiológicas e genéticas que a qualificam como probiótica. Um mutante espontâneo desprovido da capacidade de imunoestimulação foi obtido após transferências sucessivas em meio de cultura. A investigação das possíveis causas dessa instabilidade é um dos objetivos desse trabalho. A existência de identidade entre as bactérias foi comprovada por seqüenciamento do rDNA 16S e por Eletroforese em Gel com Gradiente (DGGE), tendo as seqüências apresentado com 99% de identidade e o perfil de bandas no gel sido semelhante. A instabilidade não se deve a um processo de cura deplasmídeo, uma vez que em ambas inexiste DNA plasmidial, como demonstrado por extração convencional de DNA plasmidial e por Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE). As duas bactérias exibiram o mesmo perfil de bandas de proteínas de superfície (SDS-PAGE), porém, diferiram quanto à expressão de proteínas de tamanho correspondente ao de proteínas S. No entanto, por se ter obtido apenas o fragmento amplificado correspondente à porção da âncora do gene codificador de proteína da camada S, inferiu-se que o L. delbrueckii UFV H2b20 não expressa tais proteínas. As micrografias em microscopia eletrônica de transmissão mostram a inexistência de camada S em L. delbrueckii UFV H2b20, selvagem e mutante. Nessas bactérias, a eletroforese em duas dimensões revelou 769 proteínas no extrato de proteínas de superfície da selvagem e 860 na mutante. Desses totais, 323 estavam presentes apenas no selvagem e 414 no mutante. A espectroscopia de massa das proteínas de maior expressão na selvagem e o seqüenciamento de Cterminal em MALDI-TOF/TOF revelaram similaridade com proteínas intracelulares, uma evidência de que ocorreu dano no envelope celular durante o processo de extração de proteínas de superfície. Assim, a hipótese da existência de diferenças entre as duas linhagens, no que se refere às superfícies, não pôde ser comprovada com a metodologia utilizada. A capacidade de adesão de L. delbrueckii UFV H2b20 mutante a um dos mais abundantes carboidratos da mucosa intestinal, N-acetilglicosamina (GlcNAc), mostrouse 27% menor que a selvagem, por medição em Surface Plasmon Resonance (SPR). O estudo de utilização de L. delbrueckii UFV H2b20, como veículo de apresentação de antígeno foi proposto como resultado do trabalho de desenvolvimento de um plasmídeo recombinante que contém o peptídeo sinal da proteína S fundido à proteína anticâncer, NY-ESO-1, e à região ancoradora de proteína S. A seqüência resultante apresenta todos os fragmentos clonados no mesmo quadro de leitura, favorecendo a expressão de NYESO- 1 na superfície de L. delbrueckii UFV H2b20 e a ampliação da utilidade dessa bactéria.Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 has been demonstrating a high potential to colonize bowels of mice free of germs and also for immunostimulation. This bacterium has physiologic and genetic characteristics that qualify it as a probiotic. A spontaneous mutant without the immunostimulation ability was obtained after successive transferences in growth medium. One of the objectives of this work is to investigate the possible causes of this instability. The existence ofidentity between the bacteria was proved by the rDNA 16S sequencing and by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), and the sequences showed 99% of identity an the profile of gel bands was similar. The instability is not due to a plasmid curing process, since none of them have plasmidial DNA, as was demonstrated by the conventional extraction of plasmidial DNA and by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). The two bacteria showed the same profile of bands of surface proteins (SDS-PAGE), but differed as to the expression of the proteins with the size corresponding to the S proteins. Nevertheless, because only the amplified fragment corresponding to the anchor part of the codifier gene of the protein of the S layer was obtained, it was inferred that the L. delbrueckii UFV H2b20 does not express these proteins. The micrographies from transmission eletronic microscopy show the non existence of the S layer in L. delbrueckii UFV H2b20, both in the wild type and the mutant. In these bacteria, the eletrophoresis in two dimensions showed 769 proteins in the extract of surface proteins from the wild bacterium and 860 from the mutant one. From these totals, 323 were present only in the wild type and 414 in the mutant bacterium. The mass spectroscopy of the proteins with greater expression in the wild bacterium and the sequencing of the terminal-C in the MALDI-TOF/TOF showed similarity with intracellular proteins, an evidence that damage occurred on the cellular envelope during the extraction process of the surface proteins. Thus, the hypothesis of differences between the two strains, related to the surfaces, could not be proved with methodology used. The adhesion ability of the mutant L. delbrueckii UFV H2b20 to one of the most abundant carbohydrate of the intestinal mucosa, the N-acetylghucosamine (GlcNac), showed to be 27% less than that of the wild bacterium, by messurements in Surface Plasmon Resonance (SPR). The study of the use of L. delbrueckii UFV H2b20 antigen delivery vehicle was proposed as a result of the work of the development of a recombinant plasmid that contains the signal peptide of the S protein fused to the anticancer NY-ESO-1, and to the anchorage region of the S protein. The resulting sequence shows all of the cloned fragments in the same reading frame, which favours the expression of NY-ESO-1 on the L. delbrueckii UFV H2b20 and a broader use of this bacterium.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerai