Nuevos catalizadores altamente estabilizados de la enzima β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis inmovilizada sobre soportes glioxil

La presente invención se refiere a un procedimiento de estabilización de una β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis, preferentemente inmovilizada en un soporte, que comprende unir la enzima a un polímero activado con al menos un agente conservante de estabilización de enzimas, dicho polímero activado comprendiendo grupos aldehído y/o carboxilo, y donde la unión es de tipo covalente y/o electrostática entre al menos un grupo amino de la enzima con un grupo aldehído o carboxilo del polímero activado. Es asimismo objeto de la presente invención, el catalizador de β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis obtenido por el procedimiento anterior, así como sus diferentes usos tales como la hidrólisis de lactosa en leche y sueros ácidos, la síntesis de galactooligosacáridos o su uso en reactores de tanque agitado, de lecho fijo o de lecho fluidizadoPeer reviewedConsejo Superior de Investigaciones CientíficasA1 Solicitud de adición a la patent

Protein hydrolysis by immobilized and stabilized trypsin

El pdf del artículo es la versión pre-print.-- et al.The preparation of novel immobilized and stabilized derivatives of trypsin is reported here. The new derivatives preserved 80% of the initial catalytic activity toward synthetic substrates [benzoyl-arginine p-nitroanilide (BAPNA)] and were 50,000-fold more thermally stable than the diluted soluble enzyme in the absence of autolysis. Trypsin was immobilized on highly activated glyoxyl-Sepharose following a two-step immobilization strategy: (a) first, a multipoint covalent immobilization at pH 8.5 that only involves low pKa amino groups (e.g., those derived from the activation of trypsin from trypsinogen) is performed and (b) next, an additional alkaline incubation at pH 10 is performed to favor an intense, additional multipoint immobilization between the high concentration of proximate aldehyde groups on the support surface and the high pKa amino groups at the enzyme surface region that participated in the first immobilization step. Interestingly, the new, highly stable trypsin derivatives were also much more active in the proteolysis of high molecular weight proteins when compared with a nonstabilized derivative prepared on CNBr-activated Sepharose. In fact, all the proteins contained a cheese whey extract had been completely proteolyzed after 6 h at pH 9 and 50°C, as determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Under these experimental conditions, the immobilized biocatalysts preserve more than 90% of their initial activity after 20 days. Analysis of the three-dimensional (3D) structure of the best immobilized trypsin derivative showed a surface region containing two amino terminal groups and five lysine (Lys) residues that may be responsible for this novel and interesting immobilization and stabilization. Moreover, this region is relatively far from the active site of the enzyme, which could explain the good results obtained for the hydrolysis of high-molecular weight proteins. © 2011 American Institute of Chemical Engineers (AIChE).Peer Reviewe

Identificación y caracterización de esterasas de Lactobacillus plantarum con interés en tecnología de alimentos

Resumen del trabajo presentado a la 7ª Reunión de la Red Tematica Bal: "Participación de las Bacterias Lácticas en la Salud Humana y en la Calidad Alimentaria" celebrado en Madrid del 4 al 5 de julio de 2013.Los ésteres son compuestos aromáticos que a pesar de encontrarse en niveles traza, son muy importantes en el perfil aromático de los alimentos. Pequeñas variaciones en los niveles de estos compuestos pueden tener importantes efectos en el aroma, y por lo tanto en la calidad, de los alimentos. Los ésteres de los alimentos se originan por acción de enzimas con actividad esterasa (EC 3.1.1.x) que pueden catalizar tanto reacciones de hidrólisis como de síntesis en función de las condiciones de reacción, por lo que tienen un gran interés en biotecnología. Entre estas enzimas se pueden distinguir carboxilesterasas, arilesterasas y lipasas. Las carboxilesterasas y las arilesterasas catalizan la hidrólisis de ésteres de cadena alifática corta o media solubles en agua, mientras que las lipasas presentan actividad frente a ésteres de cadena larga e insolubles en agua. Las feruloil esterasas, son un tipo de arilesterasas capaces de hidrolizar el enlace éster entre los ácidos cinámicos y los azúcares de las paredes celulares vegetales liberando compuestos fenólicos como el ácido cafeico, p-cumárico y ferúlico, los cuales presentan numerosas aplicaciones en la industria alimentaría. Lactobacillus plantarum es la especie de bacteria láctica modelo en fermentaciones de sustratos vegetales, en donde los ésteres de compuestos fenólicos, se encuentran en altas concentraciones. En el genoma de L. plantarum aparecen anotados genes que codifican “esterasas” o “lipasas” cuya funcionalidad no se ha comprobado bioquímicamente a pesar del interés biotecnológico que presentan. Por ello el objetivo de este trabajo es la identificación y caracterización de posibles esterasas en L. plantarum WCFS1. A pesar de que se han clonado los genes que codifican 14 posibles esterasas o lipasas, sólo se han podido producir y purificar correctamente las proteínas Lp_0796, Lp_0973, Lp_1002, Lp_2923, Lp_2987, Lp_3561 y Lp_3562. Utilizando ésteres derivados de p-nitrofenilo que varían en la longitud de su cadena alifática (desde acetato de p-nitrofenilo hasta palmitato de pnitrofenilo) se ha comprobado que todas las proteínas estudiadas hidrolizan mejor los ésteres de cadena corta, aunque Lp_1002, Lp_2926 y Lp_3562 también hidrolizan eficazmente palmitato de p-nitrofenilo.La proteína Lp_2987 es la única que no presenta actividad sobre ninguno de los derivados ensayados por lo que no se puede considerar como “esterasa”. La especificidad de substrato de las esterasas también se ha evaluado mediante una colección de ésteres que permite conocer su selectividad respecto a la carga del substrato, al tamaño de la cadena o al alcohol presente. Todas las proteínas purificadas, excepto Lp_2987, presentan actividad sobre acetato de fenilo, por lo que se pueden considerar como “aril esterasas”. La proteína Lp_0973 es la única que, además de acetato de fenilo, degrada triacetina y tributirina. De las esterasas estudiadas, la proteína Lp_0796 es la más interesante puesto que es una “feruloil esterasa” que hidroliza ésteres de ácidos hidroxicinámicos, siendo la primera vez que se describe una proteína con esta actividad en L. plantarum. Con objeto de mejorar la actividad de las esterasas para su posible uso industrial se han realizado experimentos de cristalización, inmovilización y evolución dirigida de alguna de ellas. Los resultados obtenidos indican que L. plantarum es una fuente adecuada de enzimas con actividad esterasa de gran influencia en el aroma de los alimentos.Peer reviewe

The evolution of the ventilatory ratio is a prognostic factor in mechanically ventilated COVID-19 ARDS patients

Background: Mortality due to COVID-19 is high, especially in patients requiring mechanical ventilation. The purpose of the study is to investigate associations between mortality and variables measured during the first three days of mechanical ventilation in patients with COVID-19 intubated at ICU admission. Methods: Multicenter, observational, cohort study includes consecutive patients with COVID-19 admitted to 44 Spanish ICUs between February 25 and July 31, 2020, who required intubation at ICU admission and mechanical ventilation for more than three days. We collected demographic and clinical data prior to admission; information about clinical evolution at days 1 and 3 of mechanical ventilation; and outcomes. Results: Of the 2,095 patients with COVID-19 admitted to the ICU, 1,118 (53.3%) were intubated at day 1 and remained under mechanical ventilation at day three. From days 1 to 3, PaO2/FiO2 increased from 115.6 [80.0-171.2] to 180.0 [135.4-227.9] mmHg and the ventilatory ratio from 1.73 [1.33-2.25] to 1.96 [1.61-2.40]. In-hospital mortality was 38.7%. A higher increase between ICU admission and day 3 in the ventilatory ratio (OR 1.04 [CI 1.01-1.07], p = 0.030) and creatinine levels (OR 1.05 [CI 1.01-1.09], p = 0.005) and a lower increase in platelet counts (OR 0.96 [CI 0.93-1.00], p = 0.037) were independently associated with a higher risk of death. No association between mortality and the PaO2/FiO2 variation was observed (OR 0.99 [CI 0.95 to 1.02], p = 0.47). Conclusions: Higher ventilatory ratio and its increase at day 3 is associated with mortality in patients with COVID-19 receiving mechanical ventilation at ICU admission. No association was found in the PaO2/FiO2 variation

Clonal chromosomal mosaicism and loss of chromosome Y in elderly men increase vulnerability for SARS-CoV-2

The pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2, COVID-19) had an estimated overall case fatality ratio of 1.38% (pre-vaccination), being 53% higher in males and increasing exponentially with age. Among 9578 individuals diagnosed with COVID-19 in the SCOURGE study, we found 133 cases (1.42%) with detectable clonal mosaicism for chromosome alterations (mCA) and 226 males (5.08%) with acquired loss of chromosome Y (LOY). Individuals with clonal mosaic events (mCA and/or LOY) showed a 54% increase in the risk of COVID-19 lethality. LOY is associated with transcriptomic biomarkers of immune dysfunction, pro-coagulation activity and cardiovascular risk. Interferon-induced genes involved in the initial immune response to SARS-CoV-2 are also down-regulated in LOY. Thus, mCA and LOY underlie at least part of the sex-biased severity and mortality of COVID-19 in aging patients. Given its potential therapeutic and prognostic relevance, evaluation of clonal mosaicism should be implemented as biomarker of COVID-19 severity in elderly people. Among 9578 individuals diagnosed with COVID-19 in the SCOURGE study, individuals with clonal mosaic events (clonal mosaicism for chromosome alterations and/or loss of chromosome Y) showed an increased risk of COVID-19 lethality

Lipasa LipBL y sus aplicaciones

La presente invención se refiere al uso de la lipasa LipBL para la hidrólisis de distintos sustratos seleccionados de entre p-nitrofenoles, tributirina, Tween 80, aceites, sustratos quirales y proquirales, aceite de pescado, azúcares paracetilados o nitrocefin y a un procedimiento enzimático de monodesprotección regioselectiva de azúcares paracetilados para la obtención de azúcares monodesacteilados.Peer reviewedUniversidad de Sevilla Pabellón de Brasil, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España)A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnic

Synthesis of sn-2 docosahexaenoyl monoacylglycerol by mild enzymatic transesterification of docosahexaenoic acid ethyl ester and glycerol in a solvent-free system

The enzymatic transesterification of docosahexaenoic acid (DHA) ethyl ester with glycerol was performed with several lipases in a solvent-free system and it involves the initial formation of sn-2 docosahexaenyl monoacylglyceride. This DHA derivative is highly relevant for improving the bioavailability of DHA and it has received increasing interest in the field of nutrition. Three commercial lipases, from Rhizomucor miehei (RML), Alcaligenes sp (QL), and Candida antarctica-fraction B (CALB) were tested. In certain cases (CALB), using an excess of DHA ethyl ester and high temperatures the transesterification reaction continues to the formation of triacylglycerides, but in other cases, sn-2 monoacylglyceride (2-MG) is the unique synthetic product even in the presence of high concentrations of DHA ethyl ester. At low temperatures (e.g. 37°C), RML derivatives synthesize only 2-MG in 15 min. These very mild conditions are very interesting for the thermal oxidative stability of the omega-3 fatty acid and for the thermal stability of the biocatalyst. Using Normal Phase HPLC-ELSD and accurate markers, the formation of the 2-MG was confirmed.This work was sponsored by the Spanish Ministry of Science and Innovation 223 [project number AGL-2009-07526], [project number BIO2012-36861].Peer reviewe

Capture of enzyme aggregates by covalent immobilization on solid supports. Relevant stabilization of enzymes by aggregation

In this paper, a novel procedure for the immobilization and stabilization of enzymes is proposed: the multipoint covalent attachment of bi-molecular enzyme aggregates. This immobilization protocol allows the “capture” and fixation of the enzyme aggregate on the support surface. In addition to stabilization by multipoint attachment, enzyme aggregation promotes very interesting stabilizing effects. In the presence of low concentrations of polyethylene glycol (30 %) the dimeric amine oxidase from Pisum sativum forms soluble bi-molecular aggregates. Enzyme aggregates were analyzed by Dynamic Light Scattering and by full chemical loading of a mesoporous support (10 % agarose gels activated with glyoxyl groups). The soluble aggregate was immobilized by multipoint attachment on glyoxyl- agarose at pH 8.5 though the four amino termini of the two dimeric molecules (Lys residues are not reactive at this pH). The immobilized aggregated structure cannot undergo any movement (translational or rotational) after multipoint attachment and the aggregate is “fixed” on the support surface even after the removal of PEG. The immobilized aggregate was further incubated at pH 10 in order to allow the Lys residues to react with the glyoxyl groups on the support. Enzyme aggregation has an important effect on enzyme stabilization: the aggregated derivative was 40 fold more stable than a similar derivative of the isolated enzyme and 200 fold more than native enzymes in experiments of thermal inactivation.This work was supported by the Ramon Areces Foundation by the project in the field of Sciences of Life and Matter titled “The detection and elimination of biogenic amines in foods: the design of new biosensors and new amino oxidase catalysts”. The authors thank the Ramon Areces Foundation for the pre-doctoral grant given to Paz Garcia-Garcia.Peer reviewe

Síntesis enzimática de lípidos estructurados (dicaprilil-monooleina). Papel crítico del biocatalizador

Resumen del póster presentado a las II Jornadas Científicas CIAL-Fórum, celebradas durante los dias 16 y 17 de noviembre de 2016 en el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL).En la última década, ha aumentado el interés en la síntesis lípidos estructurados (SL) conteniendo ácidos grasos esenciales, ácidos grasos poliinsaturados w-3 y w-6 (PUFA), en la posición sn-2, y ácidos grasos de cadena media (MCFA) en las posiciones sn-1,3, conocidos como MLM-SL, debido a los numerosos efectos beneficiosos que se han descrito para ellos, sobre personas con necesidades dietéticas especiales. Estos SL pueden ser producidos químicamente o enzimáticamente utilizando lipasas como catalizadores (triacilglicerol acilhidrolasas, EC 3.1.1.3). Las lipasas son enzimas usadas para hidrolizar TAGs, pero también pueden catalizar la reacción inversa de hidrólisis, es decir, la esterificación bajo un ambiente hidrófobo. En este trabajo se estudia la reacción enzimática de Trioleina con diferentes derivados del ácido caprílico para obtener aceites hipocalóricos. Utilizando ligeros excesos del donador de acilo, se obtienen buenos rendimientos de síntesis de COO (monocapril-dioleina) y estos rendimientos eran similares cuando se usaba el ácido caprílico, ester metílico de ácido caprílico o tricaprilina siendo también similares para las tres lipasas comerciales (de Candida antarctica-fraccion B (CALB), de Thermomyces lanuginosa (TLL) y de Rhizomucor miehiei (RML)), adsorbidas sobre soportes hidrofóbicos ensayadas. Sin embargo, las mejores velocidades de síntesis se obtenían con TLL. Utilizando excesos significativos del donador de acilo, se obtenían buenos rendimientos de síntesis de COC y estos rendimientos eran mejores con tricaprilina y utilizando como catalizador diferentes derivados de TLL, consiguiendo buenos parámetros de actividad catalítica, rendimientos altos en COC y bajos rendimientos en COO. En principio la combinación TLL y tricaprilina era la mejor solución para la optimización en la producción de COC, como aceite hipocalórico. Sin embargo, se comprobó como la clave en la síntesis era el estudio de la ingeniería del biocatalizador, ya que diferentes derivados de TLL dan diferentes rendimientos en interesterificación. TLL adsorbida por intercambio iónico sobre Duolite será mejor catalizador que TLL adsorbida hidrofóbicamente (Sepabeads) y que el derivado comercial de TLL de la casa Novozymes (Lipozyme TL-IM). Los mejores rendimientos de síntesis de COC eran del 46% y se obtenían en 24 horas con una relación molar de 1/ 5 (Trioleina/tricaprilina). Después de 5 ciclos de reacción los catalizadores conservaban más del 95 % de su actividad.Los autores agradecen la financiación otorgada por el Ministerio de Economía y Competitividad a través del proyecto BIO2012-36861 (2012).Peer reviewe