Participation of NMDA, P2X7 receptors and COX-2 enzyme of dorsal root ganglia in peripheral inflammatory hyperalgesia

Orientador: Carlos Amilcar ParadaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O gânglio da raiz dorsal (GRD) tornou-se um grande foco de estudos ao longo dos últimos anos, devido ao seu papel modulatório no desenvolvimento das hiperalgesias. Resultados prévios de nosso grupo demonstraram que a ativação da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2) e receptores NMDA, nas células do gânglio da raiz dorsal, participam do desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória no tecido periférico. Desta maneira, o objetivo deste estudo foi investigar se a ativação do receptor NMDA media um crosstalk entre neurônios e células gliais satélites, e se é dependente da ativação do receptor purinérgico P2X7 e/ou enzima COX-2. A administração ganglionar (gl.) de oligodeoxinucleotídeo antisense (ODN-AS) contra o receptor P2X7 e enzima COX-2 preveniu a hiperalgesia induzida pela administração ganglionar do agonista do receptor NMDA. Em contraste, o tratamento com ODN-AS contra os receptores NMDA não afetou a hiperalgesia mecânica induzida pela administração ganglionar de 2'(3')-0-(4-Benzoilbenzoil) adenosina 5'-trifosfato trietilamônio (BzATP) ou interleucina-1beta (IL-1beta). A histologia do GRD, realizada através de microscopia eletrônica de transmissão, mostrou um tecido diversificado, onde, há uma relação íntima entre neurônios e células satélites. Através da técnica de imunogold observou-se que as subunidades NR1 e NR2B do receptor NMDA e o receptor P2X7 são expressos em neurônios e células satélites. Em conjunto, nossos achados sugerem que a hiperalgesia do tecido periférico é desencadeada pela ativação dos receptores NMDA, que ativa os receptores P2X7, induzindo a liberação de IL-1beta que ativa a ciclooxigenase-2. A ativação da COX-2 no gânglio da raiz dorsal produz e libera prostaglandina-E2, que sensibilizará os nociceptores aferentes primáriosAbstract: The dorsal root ganglion (DRG) has become a major focus of several studies over the last few years mainly because of its modulatory role in hyperalgesia development. We have previously demonstrated that the activation of cyclooxygenase-2 (COX-2) enzyme and NMDA receptors (NMDAR), in the dorsal root ganglion cells, participate of the development of inflammatory hyperalgesia in the peripheral tissue. Thus, the aim of this study was to investigate, in male Wistar rats, whether NMDA receptor activation mediates a crosstalk between neurons and satellite glial cells, and if it is dependent on P2X purinergic receptor 7 (P2X7) and/or COX-2 activation. Ganglionar (gl.) administration of oligodeoxynucleotide antisense (ODN-AS) against P2X7 receptor and COX-2 enzyme prevented the hyperalgesia induced by ganglionar administration of NMDAR agonist. In contrast, the treatment with ODN-AS against NMDAR did not affect the mechanical hyperalgesia induced by ganglionar administration of 2' (3')-O-(4-Benzoylbenzoyl) adenosine 5'-triphosphate triethylammonium (BzATP) or interleukin-1beta (IL-1beta). The histological analysis of DRG cuts, performed through transmission electron microscopy, showed a diversified tissue and an intimate relationship between neurons and satellite cells. By the immunogold technique, followed by observation with transmission electron microscopy, we demonstrated that NMDAR NR1 and NR2B subunits and P2X7 receptor are expressed in both neurons and satellite glial cells of DRG. Our in vitro experiments (DRG culture) indicate that the NMDA receptor inhibition interferes with the calcium influx in satellite cells induced by the P2X7 receptor agonist. Taken together, our findings suggest the hiperalgesia is triggered by NMDAR activation, which activates P2X7 receptors, inducing the release of IL-1beta, which activates COX-2. The activation of COX-2 in DRG cells produces and releases prostaglandin-E2, which sensitizes primary afferent nociceptorsDoutoradoFisiologiaDoutor em Biologia Funcional e MolecularCAPE

Effects of subanesthetic doses of ketamine in cats subjected to experimental endotoxemia

Endotoxemia is one of the most difficult problems of diagnostic and treatment, due to the initiate of an exaggerated inflammatory response, culminating with the involvement of multiple organs. Ketamine has anti-inflamatory effects in several species, however, in cats this effect haven t yet been proven. The objective of this study was to evaluate the clinical and anti-inflamatory effects of ketamine in subanesthetic doses, before or after LPS injection in cats. Nine health male cats were used in a crossover study. After fasting for 12 hours and 6 hours of water, were administered dexmedetomidine (5 ug kg-1) and butorphanol (0.3 mg kg- 1), by intramuscular injection, for inserting a catheter into the jugular vein and into the cephalic vein. The next day, the animals were randomized and divided into three groups: lipopolysaccharide (LPS, n=9) who received a bolus of NaCl 0,9% solution (0.05 ml kg-1), followed by continuous infusion (IC) LPS (2 ug kg-1 h-1) the rate of 2 ml h-1 kg-1, four hours, ketamine/LPS (C/LPS, n=9) who received a bolus of ketamine (0.5 mg kg-1), followed by the IC of ketamine (10 ug kg-1 min-1) and LPS (2 ug kg-1 h-1) the rate of 2 ml kg-1 h-1 for two hours and, after infusion of LPS (2 ug kg-1 h-1) at the same rate for two hours; LPS/ketamine (LPS/C, n=9), which received IC LPS (2 ug kg-1 h-1) for two hours and, after bolus injection of ketamine (0.5 mg kg-1), the same IC (10 ug kg-1 min-1) and LPS (2 ug kg-1 h-1) at the same rate for two hours. All treatments were diluted in NaCl 0,9% and administered intravenously. The parameters measured were the following moments: M-15, before begin IC of LPS and 5 (M5) 30 (M30), 60 (M60), 90 (M90), 120 (M120), 150 (M150), 180 (M180), 240 (M240), 360 (M360), 480 (M480), 600 (M600) and 720 (M720) minutes after the start of the IC. In addition, we evaluated the clinical, biochemical and hemogram 1440, 2880 and 4320 minutes after the start of IC LPS. We observed higher values of heart rate (HR) of M5 to M120 in C/LPS and lowest values of M150 to M240 and of M600 to M720 in the LPS compared to other treatments. Were also observed of M5 in the C/LPS, M60 in the LPS/C and of M90 in the LPS to M720 higher values of HR compared to M-15. Systolic blood pressure showed up in all groups under the M360 at M720 compared to baseline. In all treatments there was an increase in rectal temperature of M600 to M60 in relation of M-15. The levels of glucose and lactate increased of M120 to M360 in relation of baseline in all groups. The leukocytes were reduced by up to M60 at M360 in all treatments compared to M-15. The triglyceride is submitted to high M720 M1440 from baseline in all groups. The conclusion was that subanesthetic doses of ketamine showed minimal changes in cardiovascular parameters, with increased heart rate. Ketamine administered before or after LPS injection isn t softened or reversed the detrimental effects that in cats submitted to experimental endotoxemia by continuous infusion of LPSA endotoxemia é um dos problemas com maiores dificuldades de diagnóstico e tratamento, devido ao desencadeamento de uma resposta imunológica exacerbada, culminando com o envolvimento de múltiplos órgãos. A cetamina possui efeitos anti-inflamatórios em diversas espécies, entretanto, em felinos esse ainda não foi comprovado. Objetivou-se neste estudo, avaliar os efeitos clínicos e anti-inflamatórios da administração de cetamina, em doses subanestésicas, previamente ou após a indução da endotoxemia em felinos. Foram utilizados nove gatos machos, hígidos, sendo autocontroles. Após jejum alimentar de 12 horas e hídrico de seis horas, administrou-se dexmedetomidina (5 ug kg-1) e butorfanol (0,3 mg kg-1), pela via intramuscular, para inserção de um cateter na veia jugular e na veia cefálica. No dia seguinte, os animais foram sorteados e alocados em três grupos: lipopolissacarídeo (LPS, n=9), os quais receberam bolus de solução de NaCl 0,9% (0,05 ml kg-1), seguida por infusão contínua (IC) de LPS (2 ug kg-1 h-1) na taxa de 2 ml kg-1 h-1, durante quatro horas; cetamina/LPS (C/LPS, n=9), os quais receberam bolus de cetamina (0,5 mg kg-1), seguido da IC de cetamina (10 ug kg-1 min-1) e LPS (2 ug kg-1 h-1) na taxa de 2 ml kg-1 h-1 por duas horas e, após, infusão de LPS (2 ug kg-1 h-1) na mesma taxa por mais duas horas; LPS/Cetamina (LPS/C, n=9), os quais receberam IC de LPS (2 ug kg-1 h-1), por duas horas e, logo após bolus de cetamina (0,5 mg kg-1), IC da mesma (10 ug kg-1 min-1) e LPS (2 ug kg-1 h-1) na mesma taxa por duas horas. Todos os tratamentos foram diluídos em NaCl 0,9% e administrados pela via intravenosa. Os parâmetros foram mensurados nos momentos: M-15, antes do início da IC de LPS e 5 (M5) 30 (M30), 60 (M60), 90 (M90), 120 (M120), 150 (M150), 180 (M180), 240 (M240), 360 (M360), 480 (M480), 600 (M600) e 720 (M720) minutos após o início da IC. Além disso, avaliou-se os parâmetros clínicos, hemograma e bioquímico após o início da IC de LPS. A frequência cardíaca (FC) foi maior de M5 a M120 no C/LPS e menor de M150 a M240 e M600 a M720 no LPS em relação aos outros tratamentos. De M5 no C/LPS, de M60 no LPS/C e de M90 no LPS até a M720 a FC foi maior em relação a M-15. A pressão arterial sistólica foi menor em todos os grupos de M360 a M720 em relação ao basal. Em todos os tratamento observou-se aumento da temperatura retal de M60 a M600 em relação a M-15. Os valores de glicose e lactato elevaram-se de M120 a M360 em relação ao basal nos três grupos. Os leucócitos apresentaram-se diminuídos de M60 a M360 em todos os tratamentos em relação a M-15. Os triglicerídeos apresentaram-se elevados de M720 a M1440 em relação ao basal em todos os grupos. Conclui-se que doses subanestésicas a cetamina apresentou mínimas alterações nos parâmetros cardiovasculares, com aumento da frequência cardíaca. A cetamina administrada previamente ou após a indução da endotoxemia não amenizou ou reverteu os efeitos deletérios dessa, em gatos submetidos à endotoxemia experimental através da infusão contínua de lipopolissacaríde

Effects of subanesthetic doses of ketamine in cats with induced experimental endotoxemia

ABSTRACT. Farias F.H., Gehrcke M.I., Padilha V.S., Volpato J., Tochetto R., Comassetto F. & Oleskovicz N. [Effects of subanesthetic doses of ketamine in cats with induced experimental endotoxemia.] Efeitos da cetamina em doses subanestésicas em gatos submetidos à endotoxemia experimental. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 37(4):297-302, 2015. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Centro de Ciências Agroveterinárias, Universidade do Estado de Santa Catarina, Avenida Luís de Camões, 2090, Bairro Conta Dinheiro, Lages, SC 88520-000, Brasil. E-mail: [email protected] The clinical endotoxemia is difficult to diagnosis and treatment because of the involvement of multiple organs. This study aimed to evaluate the clinical effects of subanesthetic doses of ketamine, before or after the induction of endotoxemia in cats. Were used nine healthy cats, with 4.3±0.59 kg, autocontroles, placed into three groups: lipopolysaccharide (LPS, n=9) received a bolus of NaCl 0,9 % followed by a continuous infusion (CI) of LPS for two hours and; bolus of NaCl 0,9 % followed by CI of LPS for two hours; ketamine/LPS (C/ LPS, n=9) received a bolus of ketamine followed by ketamine CI and LPS for two hours and, after, bolus of saline followed by CI of LPS for another two hours; LPS/ketamine (LPS/C, n=9) received bolus of saline followed by a CI LPS for two hours and then after bolus of ketamine followed by the same CI associated with LPS for two hours. The heart rate was higher for 5 to 120 minutes after initiation of the CI LPS in C/LPS and less than 150 to 240 minutes and from 600 to 720 minutes in LPS compared to the other groups. Five minutes after CI LPS initiation in C/LPS, 60 minutes in LPS/C and 90 minutes to 720 minutes in LPS, FC was higher than at baseline. The PAS was lower in all groups from 360 to 720 minutes compared to baseline. All treatments showed increased TR from 60 to 600 minutes compared to baseline. The levels of glucose and lactate increase from 120 to 360 minutes compared to baseline in all groups. The leukocyte decreased from 60 to 360 minutes in all treatments compared to baseline. It is concluded that ketamine at subanesthetic doses, before or after induction of endotoxemia in cats has minimal cardiovascular effects, but does not inhibit or reverse hyperthermia and leukopenia produced by endotoxemia in cats

Respostas cardiorrespiratória e metabólica do propofol nas formulações em emulsão lipídica ou microemulsão em gatas

O presente estudo objetiva avaliar os efeitos cardiorrespiratórios e metabólicos do propofol em emulsão lipídica e microemulsão em gatas. Foram utilizadas 12 gatas, hígidas, adultas, alocadas em dois grupos: microemulsão (MICRO, n=6) e emulsão lipídica (EMU, n=6), os quais receberam propofol, na respectiva formulação, em dose suficiente para intubação. Em seguida, foram intubados, fornecendo-se oxigênio 100%, em sistema sem reinalação de gases. Ato contínuo, iniciou-se a infusão de propofol na dose de 0,3mg kg-1 min-1 durante 90 minutos. A dose necessária para indução foi de 9,5±1,3mg kg-1 e 10±1mg kg-1 para MICRO e EMU, respectivamente. Os valores de pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial média (PAM), pressão arterial diastólica (PAD) e pH foram menores, em todos os momentos, no EMU em relação ao MICRO; a f do EMU foi menor de T30 até T75 em relação ao MICRO. A PaCO2 do EMU foi maior de T15 até T90. Os tempos de extubação, decúbito esternal, deambulação e recuperação total foram de 40,6±30,7; 91±37,5; 134,5±54,5 e 169,1±55,4 minutos no MICRO e de 68,8±37,3; 133,3±85,3; 171,3±77,1 e 233,1±60,6 minutos no EMU, respectivamente. Houve aumento da enzima Alanina Aminotransferase de 12 às 72h no EMU e de 48 às 72h no MICRO. O propofol em microemulsão apresentou características clínicas de indução e manutenção, bem como efeitos metabólicos semelhantes à formulação em emulsão lipídica. A formulação em microemulsão proporcionou maior estabilidade cardiovascular e respiratória para indução e infusão contínua em gatas hígidas

Farmacocinética do propofol em nanoemulsão em gatos Pharmacokinetic of propofol in nanoemulsion in cats

Os felinos são deficientes na biotransformação do propofol e os dados em relação à farmacocinética nessa espécie são escassos. O objetivo deste estudo foi determinar o perfil farmacocinético da infusão contínua de propofol em nanoemulsão juntamente com a emulsão lipídica em felinos. Utilizaram-se seis gatos sem raça definida (SRD), adultos, machos, castrados, com peso médio de 4,2±0,8kg, em estudo aleatório e de autocontrole. Os animais receberam 10mg kg-1 min-1 de propofol a 1% em emulsão lipídica (EMU) ou em nanoemulsão (NANO) durante 30 segundos e, imediatamente após, iniciou-se a infusão de 0,3 mg kg-1 min-1 da mesma formulação durante 60 minutos. Após 15 dias, receberam o mesmo tratamento com a formulação oposta. Amostras de 3mL de sangue venoso foram coletadas nos tempos 0 (basal), 2, 5, 10, 15, 30 e 60 minutos de infusão e aos 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 600 e 1440 minutos após o final da infusão. Os parâmetros farmacocinéticos foram determinados a partir da curva de decaimento da concentração plasmática versus tempo ao final da infusão. A análise estatística foi realizada através de ANOVA-RM com posterior teste t pareado entre os grupos. Não houve diferença entre as formulações em relação a todos os parâmetros. Os volumes de distribuição foram altos com Vdss de 23,23±12,30 litros kg-1 para a nanoemulsão e de 18,12±8,54 litros kg-1 para a emulsão lipídica. Os Cls foram baixos com um Cl central de 22,20±10,83mL kg-1 min-1 para a nanoemulsão e de 23,42±13,50mL kg-1 min-1 para emulsão lipídica. Conclui-se que a farmacocinética do propofol em gatos após infusão contínua caracteriza-se por uma ampla distribuição tecidual e uma lenta eliminação, com possível efeito cumulativo. A formulação em nanoemulsão apresenta características farmacocinéticas semelhantes às da emulsão lipídica.Cats are deficient in the metabolism of propofol and the data on the pharmacokinetics in this species are scarce. The aim of this study was to determine the pharmacokinetic profile of continuous infusion of propofol in lipid emulsion and compare with the nanoemulsion formulation, in cats. Domestic cats, short hair, adults, male, castrated, weighting 4.2±0.8kg in a randomized and self control trial were used. The animals received 10mg kg-1 of 1% propofol in lipid emulsion or nanoemulsion for 30 seconds and immediately after that, a continuous rate infusion of 0.3mg kg-1 min-1 of the same formulation was administered for 60 minutes. After 15 days the cats received the same treatment with the opposite formulation. Samples of 3mL of venous blood were collected by a central venous catheter inserted in the jugular vein at 0 (baseline), 2, 5, 10, 15, 30, and 60 minutes of infusion and at 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 600 and 1440 minutes after the end of the infusion. The pharmacokinetic parameters were determined from the decay curve of plasma concentration versus time at the end of the infusion. Statistical analysis was performed using RM-ANOVA with subsequent paired t-test between groups. There was no difference between the formulations with respect to all parameters. The volumes of distribution were high with Vdss of 23.23±12.30 liters kg-1 for the nanoemulsion and 18.12±8.54 liters kg-1 for lipid emulsion. The Cls were low with a Cl central to 22.20±10.83mL kg-1 min-1 for the nanoemulsion and 23.42±13.50mL kg-1 min-1 for lipid emulsion. The conclusion is that the pharmacokinetics of propofol in cats after infusion is characterized by a broad tissue distribution and a slow elimination, with possible cumulative effect. The formulation nanoemulsion has pharmacokinetic properties similar to the lipid emulsion

Evaluation of the clinical and cardiorespiratory effects of propofol microemulsion in dogs Efeitos clínicos e cardiorespiratórios do propofol em microemulsão em cães

This research aimed to evaluate the clinical and cardiorespiratory effects of a propofol formulation with nanometer droplet diameter in dogs. Six adult healthy female dogs weighing 14.8±1.2kg were used in this study. Each dog received two treatments with a 15-day washout period. A microemulsion (MICRO) or lipid emulsion (EMU) of propofol was administered intravenously (IV) for induction and maintenance of anesthesia. Anesthesia was maintained with a constant rate infusion of propofol (0.4mg kg-1 minute-1). Cardiorespiratory variables were recorded before induction (baseline), immediately after and at 15-minute intervals for 90 minutes after treatment. Arterial blood samples were also taken for blood gas analysis, except at 45 and 75 minutes after induction. The mean arterial pressure decreased significantly during both treatments, while the cardiac index decreased significantly only in MICRO treatment. The time to extubation, sternal recumbency, ambulation and total recovery was similar in both treatments. Opisthotonos was observed in 33% of the animals in each treatment. The propofol microemulsion presented clinical and respiratory parameters similar to those obtained with the lipid emulsion commercially available, but had some significantly different hemodynamic characteristics when used for inducing and maintaining anesthesia. Based only in these results, no advantages are seen in the use of this new microemulsion.<br>Este estudo tem o objetivo de avaliar os efeitos clínicos e cardiorrespiratórios de uma formulação de propofol formada por nanopartículas, em cães. Para esse propósito, seis cães hígidos, adultos, fêmeas, com peso médio de 14,8±1,2kg foram utilizados. Cada cão recebeu dois tratamentos, sendo que entre estes foi permitido aos animais um período de washout de 15 dias. Os animais receberam propofol em microemulsão (MICRO) ou em emulsão lipídica (EMU) por via intravenosa (IV) para a indução e manutenção da anestesia. A anestesia foi mantida com velocidade de infusão constante (0,4mg kg-1 min-1). As variáveis cardiorrespiratórias foram mensuradas antes da indução (basal), imediatamente após a indução, e então a cada 15 minutos, durante 90 minutos. Amostras de sangue arterial também foram colhidas para análise de gases sanguíneos, exceto aos 45 e 75 minutos após a indução. A pressão arterial média diminuiu significativamente com a utilização de ambos os tratamentos, enquanto o índice cardíaco reduziu significativamente somente com o tratamento MICRO. O tempo necessário para extubação, decúbito esternal, deambulação e recuperação total foi semelhante em ambos os grupos. Opistótono foi observado em 33% dos animais em cada tratamento. A microemulsão de propofol apresentou parâmetros clínicos e respiratórios semelhantes àqueles obtidos com a emulsão lipídica comercialmente disponível, porém mostrou algumas características hemodinâmicas diferentes, quando utilizada para a indução e manutenção da anestesia. Com base somente nesses resultados, não são observadas vantagens na utilização da microemulsão

Peripheral Inflammatory Hyperalgesia Depends on P2X7 Receptors in Satellite Glial Cells.

Peripheral inflammatory hyperalgesia depends on the sensitization of primary nociceptive neurons. Inflammation drives molecular alterations not only locally but also in the dorsal root ganglion (DRG) where interleukin-1 beta (IL-1β) and purinoceptors are upregulated. Activation of the P2X7 purinoceptors by ATP is essential for IL-1β maturation and release. At the DRG, P2X7R are expressed by satellite glial cells (SGCs) surrounding sensory neurons soma. Although SGCs have no projections outside the sensory ganglia these cells affect pain signaling through intercellular communication. Therefore, here we investigated whether activation of P2X7R by ATP and the subsequent release of IL-1β in DRG participate in peripheral inflammatory hyperalgesia. Immunofluorescent images confirmed the expression of P2X7R and IL-1β in SGCs of the DRG. The function of P2X7R was then verified using a selective antagonist, A-740003, or antisense for P2X7R administered in the L5-DRG. Inflammation was induced by CFA, carrageenan, IL-1β, or PGE2 administered in rat's hind paw. Blockage of P2X7R at the DRG reduced the mechanical hyperalgesia induced by CFA, and prevented the mechanical hyperalgesia induced by carrageenan or IL-1β, but not PGE2. It was also found an increase in P2X7 mRNA expression at the DRG after peripheral inflammation. IL-1β production was also increased by inflammatory stimuli in vivo and in vitro, using SGC-enriched cultures stimulated with LPS. In LPS-stimulated cultures, activation of P2X7R by BzATP induced the release of IL-1β, which was blocked by A-740003. In summary, our data suggest that peripheral inflammation leads to the activation of P2X7R expressed by SGCs at the DRG. Then, ATP-induced activation of P2X7R mediates the release of IL-1β from SGC. This evidence places the SGC as an active player in the establishment of peripheral inflammatory hyperalgesia and highlights the importance of the events in DRG for the treatment of inflammatory diseases