Identification et caractérisation des partenaires d'interaction de l'intégrase du VIH-1

Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un rétrovirus dont le génome est constitué d'un ARN simple brin qui est transcrit par la transcriptase inverse en ADN double brin. Ce dernier est transporté activement dans le noyau sous forme d'un complexe nucléoprotéique appelé le complexe de préintégration (PIC, preintegration complexe) qui renferme outre les protéines virales, intégrase et transcriptase inverse, des protéines cellulaires. Une fois dans le noyau, l'ADN viral est intégré dans le génome cellulaire sous forme de provirus par l'intégrase. En plus de l'intégration, l'intégrase joue un rôle important dans différentes étapes du cycle de réplication telles que la décapsidation, la transcription inverse et la maturation des particules virales. L'intégrase est suffisante pour catalyser l'intégration in vitro. Cependant, l'intégration in vivo est modulée par des facteurs cellulaires dont plusieurs ont été identifiés par différents groupes, en utilisant des approches expérimentales différentes. Afin d'identifier de nouveaux partenaires cellulaires de l'intégrase, nous avons conçu un système de séparation biotine-streptavidine où un ADN reproduisant une portion du U3-LTR viral et renfermant un site d'attachement de l'intégrase a été utilisé comme appât. Les protéines co-purifiées avec l'intégrase grâce à ce système ont été ensuite identifiées par spectrométrie de masse. Parmi les protéines identifiées, plusieurs sont déjà connues dans la littérature comme partenaires d'interaction de l'intégrase, ce qui valide notre approche. Notre intérêt a porté sur les nouvelles protéines, en particulier les RNA hélicases DDX5/p68 et DDX17/p72 ainsi que l'histone désacétylase 1 (HDAC1) dont nous avons confirmé l'interaction avec l'intégrase par co-immunoprécipitation et par pull-down. L'inhibition de l'expression de DDX5, DDX17 ou HDAC1, par siRNA, ainsi que leur surexpression dans des cellules HeLa-CD4 infectées par le VIH-1 ont révélé un rôle positif pour ces protéines dans la réplication virale. Une analyse détaillée de l'ADN viral intégré et non intégré (ADN total, produits de la transcription inverse, les cercles à 2 LTRs) a montré que DDX17 facilite l'intégration alors que DDX5 et HDAC1 semblent favoriser la transcription inverse durant la phase précoce du cycle viral. Les RNA hélicases DDX5 et DDX17, contrairement à HDAC1, jouent un rôle dans la phase tardive où elles exercent une inhibition sur l'expression des protéines virales, mesurée par un rapporteur luciférase dans les cellules HeLa-CD4 et dans les cellules 293T. Par ailleurs, les RNA hélicases se sont avérées nécessaires à l'infectivité du virus car leur déplétion dans les cellules productrices donne naissance à des virions peu infectieux. L'inhibition de l'expression de HDAC1 dans les cellules productrices s'est traduit par une diminution de l'infectivité des virions dans les cellules T Jurkat mais non dans les cellules HeLa-CD4. Le travail présenté dans cette thèse a permis d'identifier les RNA hélicases DDX5 et DDX17 ainsi que HDAC1 comme nouveaux partenaires d'interaction de l'intégrase et d'établir leur rôle positif dans la réplication virale.\ud ______________________________________________________________________________ \ud MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : VIH-1, intégrase, co-facteurs cellulaires, RNA hélicases, DDX5, DDX17, histone désacétylasel (HDAC1

Isolation, antioxidant and antimicrobial activities of ecdysteroids from serratula cichoracea

[Background] Several Serratula species are used in folk medicine and showed interesting biological activities. The objective of this work was to continue the investigation of the chemical composition of the ethyl acetate extract of the flowers of Serratula cichoracea which in our previous study showed a significant antioxidant activity in 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH•) essay compared to quercetin used as control molecule and to evaluate the isolated compounds for their antioxidant and antimicrobial activities, [Methods] Ethyl acetate extract (15 g) was fractionated by column chromatography on silica gel. After purification on preparative plates, the isolated compounds were identified by spectral analyses mainly high resolution electrospray ionisation mass spectrometry (HR-ESIMS) and one-and two-dimensionnal nuclear magnetic resonance spectroscopy experiments, and were evaluated in vitro for antioxidant activity using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical and for antimicrobial properties, [Results] A new phytoecdysteroid named 22-epi-ajugasterone C (1) together with ajugasterone C (2), were isolated. Compounds 1 and 2 had weak scavenging effect compared with myricetin used as positive control, whereas the two compounds showed antimicrobial properties against multiresistant strains like Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Serratia sp., Klebsiella pneumoniae and Candida albicans, [Conclusion] The new isolated phytoecdysteroid and its epimer ajugasterone C, responded to their effectiveness against different various antibiotic-resistant bacteria.The authors are thankful to Dr. Djamel Sarri for the identification of Serratula cichoracea, and to DGRSDT and MESRS for financial support.Peer Reviewe