Analyse de la diversité structurale des complexes de protéasome humain par approches protéomiques quantitatives

La plupart des fonctions cellulaires essentielles nécessitent l'action coordonnée d'un nombre important de protéines qui sont associées en complexes multi-protéiques, ces derniers étant souvent hautement dynamiques à la fois dans le temps, dans l'espace, et en abondance. Le protéasome, complexe multiprotéique ubiquitaire et présent dans tous les compartiments cellulaires, est indispensable à la survie des cellules eucaryotes car il est responsable de la dégradation de protéines modifiées et non fonctionnelles, ou de protéines impliquées dans la régulation de nombreux processus cellulaires clés. Le protéasome présente donc une grande diversité fonctionnelle, mais également structurale. Il est en effet constitué par l'association dynamique de plusieurs sous complexes, un cœur catalytique appelé protéasome 20S présent dans tous les complexes de protéasome, et quatre types de régulateurs, 19S, PA28a/ß, PA28?, et PA200. Le protéasome 20S existe lui-même sous 4 formes principales, selon l'intégration contrôlée des sous-unités catalytiques standards (ß1, ß2 et ß5), ou immunologiques (ß1i, ß2i et ß5i), et peut être présent sous forme libre dans la cellule ou en association avec un ou deux complexes régulateurs, identiques ou différents. Le niveau de connaissance de la stœchiométrie de ces complexes, de leur répartition cellulaire, de leur dynamique, et de leur rôle fonctionnel spécifique est aujourd'hui très limité. L'objectif de ce travail de thèse a été de développer des approches utilisant les techniques les plus récentes d'analyses protéomiques quantitatives basées sur la spectrométrie de masse pour étudier la diversité structurale des complexes de protéasomes. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la répartition des complexes de protéasome dans des cellules de leucémie aigüe myéloïde (U937 et KG1a). Pour cela, nous avons optimisé un protocole de fractionnement subcellulaire de cellule réticulées au formaldéhyde, un agent chimique qui va permettre de stabiliser les interactions protéine-protéine, associé à une technique de purification de l'ensemble des complexes de protéasome endogène et à une analyse par protéomique quantitative. Nos résultats ont montré qu'au niveau subcellulaire, le protéasome est régulé via des changements d'interaction avec ses régulateurs plutôt que via des variations de la stœchiométrie en sous unités-catalytiques. Dans un second temps, nous avons cherché à déterminer l'ensemble des protéines partenaires du protéasome dans les différents compartiments des cellules U937, pour accéder à ses fonctions subcellulaires principales. Nous avons montré que le protéasome est plutôt impliqué dans les voies de signalisation intracellulaire dans le cytosol alors qu'il est plutôt associé au contrôle qualité des protéines dans le réticulum endoplasmique. Dans le noyau, le protéasome semble avoir un rôle dans la transcription et la réparation de l'ADN endommagé. Ces résultats mettent en lumière des fonctions spécialisées du protéasome dans chaque compartiment cellulaire. Dans une troisième partie, nous avons étendu l'étude des complexes de protéasome à 8 lignées cellulaires d'origines différentes et avons pu montrer que les compositions en sous-unités catalytiques et en régulateurs étaient très variables en fonction du type cellulaire. Nous avons également développé une méthode d'étude de profil d'abondance protéique qui nous a permis de mettre en évidence des associations spécifiques et tout à fait originales de certains sous-complexes de protéasome, avec des régulateurs particuliers. L'une d'entre elles, l'interaction préférentielle entre l'immunoprotéasome et le régulateur PA28aß a pu être confirmée par d'autres approches biochimiques. Nos travaux, basés sur le développement d'outils biochimiques et de stratégies de protéomique quantitative innovants, ont donc permis de mieux comprendre la diversité, la stœchiométrie, et la dynamique des complexes de protéasome. Les méthodes développées pourront être appliquées à l'étude d'autres complexes protéiques d'intérêt.Most of essential cellular pathways require the coordinated action of a large number of proteins that associate to form multi-protein complexes, often highly dynamic in time, space and abundance. The proteasome, an ubiquitous multiprotein complex, is responsible for the degradation of modified and non-functional proteins, or proteins involved in the regulation of most cellular key processes. Therefore the proteasome has a large functional, but also structural, diversity. It is constituted by the dynamic association between several complexes with a central catalytic particle, called 20S proteasome, present in all proteasome complexes, and four types of regulators, called 19S, PA28aß, PA28? and PA200. The cellular 20S proteasome exists in four main conformations, depending on the controlled integration of standard (ß1, ß2 and ß5), or immunological (ß1i, ß2i and ß5i) catalytic subunits, and can be found in its free form or in association with one or two, identical or different, regulatory complexes. The level of knowledge of these complexes stoichiometry, their cellular distribution, their dynamics and their specific functional roles is now very limited. The aim of this thesis project was to develop approaches using the most recent quantitative proteomic techniques based on mass spectrometry to study the structural diversity of proteasome complex. First, we studied the distribution of proteasome complexes in acute myeloid leukemia cells (U937 and KG1a). We optimized an integrated strategy combining in vivo formaldehyde cross-linking for an early stabilization of proteasome complexes, cellular fractionation of cross-linked cells, immunopurification of proteasome complexes, and label-free mass spectrometry quantification of proteins. Our results showed that, at the subcellular level, the proteasome is mainly regulated through changes in the 20S proteasome interaction with its regulators rather than through changes in the composition of its catalytic subunits. In a second part, we identified all proteasome associated proteins in three different compartments of U937 cells to determine its main subcellular functions. We showed that the proteasome is rather associated with intracellular signaling pathways in the cytosol whereas it is mainly associated with proteins involved in protein quality control in the endoplasmic reticulum. In the nucleus, we found that the proteasome is associated with proteins involved in transcription or DNA damage response. These results highlight a specialized function of proteasome in each cellular compartment. In a third part, we extended the study of proteasome complexes to 8 cell lines of different origins and we showed that catalytic subunits and regulators compositions of proteasome complexes are highly variable depending on the cell type. In addition, we have developed a method of protein abundance profiling that allowed us to define the existence of proteasome complex subtypes formed by specific 20S proteasome species and regulatory complexes. One of these preferential interactions involving the immunoproteasome and the PA28aß regulator has been confirmed by other biochemical approaches. Our work, based on the development of innovative biochemical tools and quantitative proteomic strategies, have thus helped to better understand the diversity, the stoichiometry and the dynamics of proteasome complexes at the subcellular level and between different cell types. The developed methods might be useful to study the distribution and composition of other protein complexes

La Société pour l’étude des Langues Romanes vue du lycée de Montpellier et de l’Académie d’Aix-en-Provence : Tourtoulon, Boucherie et le proviseur Foncin

En 1897, dans son Discours de réception à l’Académie d’Aix, Charles de Tourtoulon rendait hommage à son prédécesseur décédé Joseph Foncin. Il fut reçu par Charles Soubrat, un ancien condisciple. Leurs deux discours, réunis dans une même brochure, sont à la base de cet article. Foncin, proviseur au lycée de Montpellier jusqu’à mi-1868, s’entretenait avec le professeur Anatole Boucherie lorsque la Société pour l’étude des langues romanes (SELR) se préparait. Dès sa création en 1869, il y avait adhéré. La précision des données permet d’observer la procédure que Tourtoulon avait suivie lors des recherches de la limite oc/oïl en 1873, le moment fort de sa vie de linguiste. La démarche scientifique expérimentale du récipiendaire est décrite, de même que son travail d’historien en vue d’écrire une histoire totale, autour du roi Jacques d’Aragon. Dans son discours, il proposait une méthode de travail à des amateurs qui voudraient étudier le parler de leur village tandis que des académiciens provençaux étaient surpris que leur confrère et linguiste Gaston Paris ait nié en 1888 la spécificité de la langue d’oc. On note également comment les diverses préoccupations et les engagements de l’érudit Tourtoulon ont rythmé sa vie, notamment dans le Félibrige. La trajectoire de Joseph Foncin, connue par plusieurs sources, permet d’éclairer son soutien à la SELR. Agrégé de grammaire, Lorrain ayant exercé dans l’Est puis le Midi de la France, il avait été en contact avec différentes langues et dialectes, comme d’autres jeunes agrégés nommés loin de leur lieu d’origine. Après ses mariages successifs, il avait fait l’essentiel de sa carrière dans le Midi. Il est représentatif de ces professeurs et éducateurs ayant vu l’intérêt de la SELR et des projets qu’elle portait avec sa revue pour la connaissance de la langue d’oc, autour de Boucherie et de Tourtoulon entre autres.In 1897, in his reception speech at the academy of Aix-en-Provence, Charles de Tourtoulon paid tribute to his deceased predecessor Joseph Foncin. Charles Soubrat, his former fellow student, pronounced then the welcome speech. The two speeches, gathered in a single brochure, are the base of the present article. Foncin, proviseur of the lycée of Montpellier until mid–1868, and Professor Anatole Boucherie were in very good termes while the Société pour l’étude des langues romanes (SELR) was getting started. From its creation in 1869 Joseph Foncin had joined it. Precise data make it possible to observe the procedure Tourtoulon had followed during the research of the oc/oïl boundary in 1873, the highest point of his life as a linguist. The methodology used througout this investigation is precisely explained. His experimental scientific approach is thus described, as well as his work as a historian with a view to writing a complete history about King James of Aragon. In his speech, he proposed a working method to amateurs who would like to study the language of their village, while Provençal academics were surprised that their colleague and linguist Gaston Paris had denied in 1888 the specificity of the langue d'oc. We also note how the various preoccupations and commitments of the scholar Tourtoulon punctuated his life, particularly in the Félibrige. The evolution of Joseph Foncin, known by several sources, sheds light on his support for the SELR. As an Agrégé de grammaire, born in Lorraine but having worked in the East and then the South of France, he had been in contact with different languages and dialects, as had other young agrégés named far from their place of origin. After his successive weddings, he had spent most of his career in the South of France. He is representative of those teachers and educators who saw the interest of the SELR and the projects it carried with its journal (la RLaR) for the knowledge of the langue d'oc, in the path of Boucherie and Tourtoulon among others

Les détails occultés : la correspondance de l’écrivain occitan Jean-Baptiste Fabre et de son neveu Favre de Saint-Castor au prisme de l’honneur et de l’identité (1774-1782)

Cet article traite de questions d’honneur, d’identité et de secret des familles, à travers une correspondance du xviiie siècle entre l’abbé Jean-Baptiste Fabre, célèbre écrivain occitan de Montpellier, et un de ses rares parents, son neveu Jean-Baptiste Favre de Saint-Castor. Né à Aubais, dans le Gard, Saint-Castor servait comme garde du corps à Versailles. À l’occasion d’une rencontre amoureuse, les allusions que comporte la correspondance se multiplient, troublant la compréhension de la situation. Des sources judiciaires font connaître les protagonistes et le motif du silence observé : une affaire de bigamie impliquait un seigneur de l’Anjou et la compagne du neveu, éphémère épousée. Le couple a sollicité parents et protecteurs, dont l’intendant du Languedoc Saint-Priest, pour pouvoir se marier et donner légitimité à ses enfants. La correspondance, conservée par son tuteur, a permis à une de leurs filles de connaître ses origines familiales et de prétendre à un héritage maternel à Saint-Domingue

Pluralisme juridique et sécurisation foncière dans une commune cadastrée Le cas de Miadanandriana

Sur la base du décret du 29 août 1929 relatif au droit foncier indigène, une procédure cadastrale a été engagée sur la commune de Miadanandriana en 1935. Depuis l'établissement du plan cadastral jusqu'à l'inscription des titres cadastraux à la matrice foncière, prés de 40 ans se sont écoulés. De gros investissements en moyens humains, financiers et techniques ont été justifiés par le fait que la maîtrise du foncier constitue pour l'administration centrale un enjeu stratégique majeur de gestion des territoires et de leur développement. Aujourd'hui, l'heure est à la décentralisation de la gestion du foncier. Or à Miadanandriana, force est de constater que la gestion du foncier par les citoyens fait déjà intervenir les autorités locales notamment lors d'une recherche accrue de sécurisation foncière

Analysis of Drosophila melanogaster proteome dynamics during embryonic development by a combination of label-free proteomics approaches.

During embryogenesis, organisms undergo considerable cellular remodelling requiring the combined action of thousands of proteins. In case of the well-studied model Drosophila melanogaster, transcriptomic studies, most notably from the modENCODE project, have described in detail changes in gene expression at the mRNA level across development. Although such data are clearly very useful to understand how the genome is regulated during embryogenesis, it is important to understand how changes in gene expression are reflected at the level of the proteome. In this study, we describe a combination of two quantitative label-free approaches, SWATH and data-dependent acquisition, to monitor changes in protein expression across a timecourse of D. melanogaster embryonic development. We demonstrate that both approaches provide robust and reproducible methods for the analysis of proteome changes. In a preliminary analysis of Drosophila embryogenesis, we identified several pathways, including the heat-shock response, nuclear protein import and energy production that are regulated during embryo development. In some cases changes in protein expression mirrored transcript levels across development, whereas other proteins showed signatures of post-transcriptional regulation. Taken together, our pilot study provides a solid platform for a more detailed exploration of the embryonic proteome.Funding: B.F, D.K and L.G are funded by BBSRC (Ref: BB/L002817/1). MR and JV acknowledge funding by the Wellcome Trust (RG 093735/Z/10/Z) the ERC (Starting grant 260809), M.R. is a Wellcome Trust Research Career Development and Wellcome-Beit Prize fellow.  This is the author accepted manuscript. The final version is available from Wiley via http://dx.doi.org/10.1002/pmic.20150048

Characterisation of protein isoforms encoded by the Drosophila Glycogen Synthase Kinase 3 gene shaggy

The Drosophila shaggy gene (sgg, GSK-3) encodes multiple protein isoforms with serine/threonine kinase activity and is a key player in diverse developmental signalling pathways. Currently it is unclear whether different Sgg proteoforms are similarly involved in signalling or if different proteoforms have distinct functions. We used CRISPR/Cas9 genome engineering to tag eight different Sgg proteoform classes and determined their localization during embryonic development. We performed proteomic analysis of the two major proteoform classes and generated mutant lines for both of these for transcriptomic and phenotypic analysis. We uncovered distinct tissue-specific localization patterns for all of the tagged proteoforms we examined, most of which have not previously been characterised directly at the protein level, including one proteoform initiating with a non-standard codon. Collectively, this suggests complex developmentally regulated splicing of the sgg primary transcript. Further, affinity purification followed by mass spectrometric analyses indicate a different repertoire of interacting proteins for the two major proteoforms we examined, one with ubiquitous expression (Sgg-PB) and one with nervous system specific expression (Sgg-PA). Specific mutation of these proteoforms shows that Sgg-PB performs the well characterised maternal and zygotic segmentations functions of the sgg locus, while Sgg-PA mutants show adult lifespan and locomotor defects consistent with its nervous system localisation. Our findings provide new insights into the role of GSK-3 proteoforms and intriguing links with the GSK-3α and GSK-3β proteins encoded by independent vertebrate genes. Our analysis suggests that different proteoforms generated by alternative splicing are likely to perform distinct functions

Comparison of Drosophila melanogaster Embryo and Adult Proteome by SWATH-MS Reveals Differential Regulation of Protein Synthesis, Degradation Machinery, and Metabolism Modules.

An important area of modern biology consists of understanding the relationship between genotype and phenotype. However, to understand this relationship it is essential to investigate one of the principal links between them: the proteome. With the development of recent mass-spectrometry approaches, it is now possible to quantify entire proteomes and thus relate them to different phenotypes. Here, we present a comparison of the proteome of two extreme developmental states in the well-established model organism Drosophila melanogaster: adult and embryo. Protein modules such as ribosome, proteasome, tricarboxylic acid cycle, glycolysis, or oxidative phosphorylation were found differentially expressed between the two developmental stages. Analysis of post-translation modifications of the proteins identified in this study indicates that they generally follow the same trend as their corresponding protein. Comparison between changes in the proteome and the transcriptome highlighted patterns of post-transcriptional regulation for the subunits of protein complexes such as the ribosome and the proteasome, whereas protein from modules such as TCA cycle, glycolysis, and oxidative phosphorylation seem to be coregulated at the transcriptional level. Finally, the impact of the endosymbiont Wolbachia pipientis on the proteome of both developmental states was also investigated.BBSR

La communication littéraire et ses outils : écrits publics, écrits privés

À partir d’exemples portant sur divers types d’écrits (dictionnaire, journal, roman, correspondance), cet ouvrage interroge les formes de la communication littéraire dans les sphères publique et privée. Le Congrès national des sociétés historiques et scientifiques rassemble chaque année universitaires, membres de sociétés savantes et jeunes chercheurs. Ce recueil est issu de travaux présentés lors du 139e Congrès sur le thème « Langages et communication »