VİTAMİN D VE VİTAMİN D METABOLİZMASINDA ROL ALAN CYP450 İZOENZİMLERİNİN HAYVAN MODELİNDE MULTİPL SKLEROZ (MS) HASTALIĞININ PATOFİZYOLOJİSİNE ETKİLERİNİN MOLEKÜLER DÜZEYDE ARAŞTIRILMASI

Multiple sclerosis (MS) is a complicated, recurrent, and often progressive inflammatory demyelinating autoimmune disease of the central nervous system, yet etiopathogenesis remains unsolved. MS frequency increases with increasing latitude, leading to a hypothesis that MS is inversely correlated with the duration and intensity of sunlight and vitamin D concentrations. In this study, the relationships between vitamin D supplementation, MS, VDR, and vitamin D metabolizing CYP enzymes, including CYP2R1, CYP27A1, CYP27B1, and CYP24A1 at mRNA and protein expression levels, were investigated by qRT-PCR and Western blotting techniques in female C57BL/6 mouse autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. Both mRNA and protein expressions of Gr 1 were set to 1.00 fold, and expressions of the other groups were calculated relatively to Gr 1. At first, mice were divided into four groups; Gr 1 (control), Gr 2 (vitamin D supplemented control), Gr 3 (EAE), and Gr 4 (vitamin D supplemented EAE). According to the results of this study, vitamin D was not a preventive but a therapeutic agent since significantly higher numbers of mice were recovered in the Gr 4 (8 mice out of 12) than the Gr 3 (2 mice out of 12) (p=0.013<0.05). There was no statistically significant difference in CYP27A1 mRNA and protein expression among the groups. CYP2R1 mRNA expression was significantly low in Gr 4 (0.50 fold; p<0.05). However, CYP2R1 protein expression was not significantly different between the groups. CYP27B1 mRNA and protein expression were significantly high in Gr 2 and Gr 4 compared to Gr 3. CYP24A1 protein expression was higher in Gr 4 (1.70±0.46; p<0.05), which was positively correlated with the clinical score of the EAE. Although VDR mRNA expression increases with the EAE immunization, it was reverted in protein expression levels probably because of the post-transcriptional regulations by miRNAs. In conclusion, vitamin D supplementation and CYP24A1 inhibitor therapy may help to reduce the severity of MS symptoms.Multipl skleroz (MS), merkezi sinir sisteminin komplike, tekrarlayan ve sıklıkla ilerleyici inflamatuar demiyelinizan otoimmün bir hastalığıdır, ancak etyopatogenezi henüz çözülememiştir. Ekvatoral kuşaktan uzaklaştıkça MS hastalığının görülme sıklığı artmaktadır, bu da güneş ışığının süresi, açısı ve D vitamini konsantrasyonları ile MS görülme sıklığının ters orantılı olduğunu belirten hipotezin ortaya çıkmasına sebep olmuştur. Bu çalışmada, dişi C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyelit (DOE) modeli oluşturularak, D vitamini takviyesi, MS, VDR ve D vitamini metabolize eden CYP2R1, CYP27A1, CYP27B1 ve CYP24A1 enzimlerinin mRNA ve protein ekspresyon seviyeleri arasındaki ilişkiler qRT-PCR ve Western blot teknikleri ile araştırılmıştır. mRNA ve protein ekspresyonları Gr 1’de 1.00 kat olarak kabul edilerek diğer grupların ekspresyonları hesaplanmıştır ve Gr 1 ile kıyaslanmıştır. Başlangıçta fareler dört gruba ayrılmıştır; Gr 1 (kontrol), Gr 2 (D vitamini takviyeli kontrol), Gr 3 (DOE) ve Gr 4 (D vitamini takviyeli DOE). Çalışmanın sonuçlarına göre, D vitamini önleyici değil, tedavi edici bir ajandır çünkü Gr 4'te (8 fare) Gr 3'e (2 fare) göre önemli ölçüde daha fazla sayıda farede iyileşme gözlemlenmiştir (p=0.013<0.05). Gruplar arasında CYP27A1 mRNA ve protein ekspresyonunda anlamlı bir fark görülememiştir. Ayrıca, CYP2R1 mRNA ekspresyonunun, diğer gruplara kıyasla Gr 4'te (0.50 kat; p<0.05) önemli ölçüde düşük olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte, CYP2R1 protein ekspresyonu açısından gruplar arasında önemli bir fark bulunmamaktadır. CYP27B1 mRNA ve protein ekspresyonunun, Gr 3’e göre Gr 2 ve Gr 4'te önemli ölçüde yüksek olduğu görülmüştür. CYP24A1 protein ekspresyonunun, DOE'nin klinik skoru ile pozitif korelasyon göstererek Gr 4'te (1.70±0.46; p<0.05) daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. VDR mRNA ekspresyonu, DOE immünizasyonu sonucunda artarken protein ekspresyonu seviyelerinin sağlıklı gruplarla eşit olduğu görülmüştür. Bu durum miRNA'ların post-transkripsiyonel düzenlemelerde aldığı rol nedeniyle gerçekleşmiş olabilir. Sonuç olarak, D vitamini takviyesi ve CYP24A1 inhibitörü tedavisi MS semptomlarının şiddetini azaltmaya yardımcı olabilir.Ph.D. - Doctoral ProgramTÜBİTAK 1001 Project No: 117Z91

İlaç ve kanserojen metabolizmasını çalışmak amacıyla karaciğer, kolon ve prostat hücre hatlarında CYP1A1, CYP2E1, NQO1 VE GST enzimlerinin protein ve mRNA ekspresyonlarının analizi.

Xenobiotic metabolism is the combination of phase I and phase II reactions which are named as modification and conjugation reactions, respectively. Most of the marketed drugs are metabolized by Cytochrome P450s (CYPs) known as phase I enzymes. CYP1A1 and CYP2E1 enzymes play role in activation/inactivation of many drugs and carcinogens. Phase II enzymes including NQO1 and GSTP1 are important for the elimination of toxic metabolites by reduction and conjugation reactions, respectively. Since in vitro studies are considered as the preliminary step for the discovery of new drug molecules or for the investigation of the effects of chemicals on the molecular basis, this study was aimed to show the best cell line model for studying CYP1A1, CYP2E1, NQO1 and GSTP1 enzymes playing role in drug and carcinogen metabolism. Therefore, protein and mRNA expression of these enzymes were analyzed in the HT29 and SW620 (colon); HEPG2 and HUH7 (liver); PNT1A and PC3 (prostate) cell lines. For this purpose, cell lines were grown as three replicates in 5% CO2 incubator followed by the protein extraction and RNA purification steps. Then, mRNA and protein expressions of the enzymes by cell lines were analyzed by qRT-PCR and Western blotting techniques, respectively. The results showed that all cell lines express CYP1A1 protein and relative protein expression is highest in the HT29 and SW620 (colon) cell lines. In addition, liver cell lines HEPG2 and HUH7 expressed highest CYP1A1 mRNA. CYP2E1 protein expression was found in all cell lines at relatively high levels except PC3. CYP2E1 mRNA expression was very high in HUH7 and HT29 cell lines. PNT1A and HEPG2 expressed NQO1 protein at relatively high levels while PC3 and HUH7 cell lines expressed NQO1 protein at significantly lower levels. NQO1 mRNA expression varies in cell lines and PNT1A showed the highest mRNA expression when compared with HUH7 cell line. HUH7 showed the highest GSTP1 protein expression whereas the HEPG2 did not show any GSTP1 protein expression. mRNA expression of GSTP1 in the descending order is PNT1A, HT29, SW620, PC3 and HUH7 while there is no mRNA expression in HEPG2 cell line. In conclusion, CYP1A1, CYP2E1, NQO1 and GSTP1 protein and mRNA expressions showed differences in different cell lines originated from colon, liver and prostate tissues. It was found that HT29 colon cell line is the best model among these cell lines to study all of four enzymes together since it expressed both protein and mRNA of these enzymes at relatively significant levels. However, if CYP1A1, CYP2E1, NQO1 and GSTP1 would be studied individually, HT29, HUH7, PNT1A and HT29 are the best models, respectively.M.S. - Master of Scienc

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ/LİSANSÜSTÜ TEZ PROJESİ

İLAÇ METABOLİZMASINI ÇALIŞMAK AMACIYLA KARACİĞER HÜCRE KÜLTÜRÜNDE FAZ I ENZİMLERİN AKTİVİTELERİNİN İNCELENMES

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ/LİSANSÜSTÜ TEZ PROJESİ

YENİ GELİŞTİRİLEN TAXOL TÜREVİ İLE BİTKİ FENOLİK BİLEŞİKLERİ ARASINDAKİ ETKİLEŞİMİN ARAŞTIRILMASI AMACIYLA İLAÇ METABOLİZE EDEN FAZ I VE FAZ II ENZİMLERİN AKTİVİTELERİNİN, PROTEİN VE MRNA EKSPRESYONLARININ HÜCRE HATLARINDA İNCELENMES

VİTAMİN D VE VİTAMİN D METABOLİZMASINDA ROL ALAN CYP450 İZOENZİMLERİNİN HAYVAN MODELİNDE MULTİPL SKLEROZ HASTALIĞININ PATOFİZYOLOJİSİNE ETKİLERİNİN MOLEKÜLER DÜZEYDE ARALTIRILMASI

VİTAMİN D VE VİTAMİN D METABOLİZMASINDA ROL ALAN CYP450 İZOENZİMLERİNİN HAYVAN MODELİNDE MULTİPL SKLEROZ HASTALIĞININ PATOFİZYOLOJİSİNE ETKİLERİNİN MOLEKÜLER DÜZEYDE ARALTIRILMAS

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ/LİSANSÜSTÜ TEZ PROJESİ

YENİ GELİŞTİRİLEN TAXOL TÜREVİ İLE BİTKİ FENOLİK BİLEŞİKLERİ ARASINDAKİ ETKİLEŞİMİN ARAŞTIRILMASI AMACIYLA İLAÇ METABOLİZE EDEN FAZ I VE FAZ II ENZİMLERİN AKTİVİTELERİNİN, PROTEİN VE MRNA EKSPRESYONLARININ HÜCRE HATLARINDA İNCELENMES

İLAÇ METABOLİZMASINI ÇALIŞMAK AMACIYLA KARACİĞER HÜCRE KÜLTÜRÜNDE FAZ I ENZİMLERİN AKTİVİTELERİNİN İNCELENMESİ

İLAÇ METABOLİZMASINI ÇALIŞMAK AMACIYLA KARACİĞER HÜCRE KÜLTÜRÜNDE FAZ I ENZİMLERİN AKTİVİTELERİNİN İNCELENMES

Convergence or divergence: EU and Turkish foreign policy over the last decade

This chapter points to an attitude of both convergence and divergence between European and Turkish foreign policies. Both parties’ outlook towards the Balkans, Russia and the Caucasus suggests that interests could converge on a number of points, while the divergence can be partially explained by the evolution of Turkish foreign policy-making over the last decade. Furthermore, an increasingly strong link between domestic politics and foreign policy has encouraged Turkish policy-makers to adopt a more assertive and independent stance, occasionally at the expense of its relations with the Western alliance

Vitamin D, Vitamin D Reseptörü ve Vitamin D Metabolizmasında Rol Alan CYP450 İzozimlerinin Hayvan Modelinde Multipl Skleroz (MS) Hastalığının Patofizyolojisine Etkilerinin Moleküler Düzeyde Araştırılması

Multipl skleroz (MS), santral sinir sistemi beyaz cevherinin karmaşık, tekrarlayıcı, sıklıkla progressif seyirli inflamatuar demiyelinizan hastalığıdır (Noseworthy, Lucchinetti, Rodriguez, & Weinshenker, 2000). Hastalık 20-40 yaş arasında, kadınlarda erkeklere göre daha fazla görülmektedir. Hastalık riski ekvatoral kuşaktan uzaklaştıkça artmaktadır ve prevalansı 100.000 de 2 ile 200 arasında değişmektedir (World Health Organisation, 2008). Ekvatoral kuşakta MS hastalığının prevalansının düşüklüğünün güneş ışınlarının Vitamin D biyosentezi için daha elverişli olmasından kaynaklanabileceği düşünülmüş ve vitamin D ile MS arasında bağlantı bulan birçok yayın yapılmıştır. İmmünizasyon ile MS modeli oluşturulmuş hayvanlarda yapılan çalışmalarda vitamin D takviyesinin MS hastalığının ataklarındaki şiddeti azalttığı gözlemlenmiştir (Farias et al., 2013). Ayrıca MS hastaları ve sağlıklı bireylerden alınan kanlarda Vitamin D miktarları karşılaştırıldığında vitamin D miktarının hastalarda önemli oranda düşük olduğu rapor edilmiştir (van der Mei et al., 2007). Vitamin D dört halkadan oluşan bir sterol türevidir. İki önemli formda bulunur. Bunlar diyet ile alınan bitkisel kökenli ergosterolden türeyen ergokalsiferol (vitamin D2) ve hayvansal kökenli olup deride kolesterolün oksitlenme ürünü olan 7-dehidrokolesterolden türeyen kolekalsiferol (vitamin D3). İnsan vücudunda sadece vitamin D3 sentezlenir. Deride üretilen ya da diyet ile alınan vitamin D2 ve D3 dolaşım sistemine girerek karaciğerde CYP27A1 enzimi ile hidroksilasyona uğrar. Bu enzimatik reaksiyon sonucunda 25-hidroksivitamin D2 ve 25-hidroksivitamin D3 ara ürünleri oluşur. Daha sonra bu ara ürünler böbrekte CYP27B1enziminin katalizörlüğünde 1,25-dihidroksivitamin D2/D3’e dönüştürülür. 1,25-dihidroksivitamin D3 aktif vitamin metaboliti olarak kabul edilmektedir. Bu metabolit hormon özelliği göstermekte olup vitamin D reseptörüne bağlanarak birçok genin ekspresyonunu kontrol eder. Ancak bu aktif metabolit CYP24A1 enzimi tarafından inaktif edilerek kalsitorik asit olarak safra ile vücuttan atılır. Vitamin D ile multipl skleroz hastalığı arasında ilişki olduğu gösterilmişse de bu ilişkinin moleküler düzeyde incelendiği çalışma sayısı çok azdır. Ayrıca MS hayvan modelinde Vitamin D’nin patofizyolojik etkilerinin, Vitamin D reseptörü ve Vitamin D metabolizmasında rol alan CYP27A1, CYP27B1 ve CYP24A1 enzimlerinin mRNA ve protein ekspresyonları düzeyinde inceleneceği ilk çalışma olacaktır. Vitamin D metabolizmasında rol alan enzimlerin ve vitamin D reseptörünün hastalık ile bağlantısının ortaya konması ile hastalığın tedavisine dönük ilaç üretilmesinde hedef olabilecek yeni bir yolak belirlenmiş olacaktır