Effets génotoxiques et épigénétiques des expositions professionnelles agricoles et le lien avec le développement de cancers

La littérature montre une augmentation de risque de certaines maladies dans la population agricole,notamment un risque accru de certains cancers, tel que les lymphomes non-Hodgkiniens par exemple.Plusieurs études épidémiologiques ont trouvé des associations entre les expositions professionnellesagricoles et le développement de cancer. Les études d’épidémiologie moléculaire tentent d’étudier laplausibilité biologique de ces associations. On remarque cependant que très peu de ces études se focalisent surles femmes et leurs expositions qui sont d’un intérêt particulier puisqu’elles différent des hommes en termesd’utilisation de produits chimiques/pesticides mais aussi quant aux tâches qu’elles entreprennent sur l’exploitation.Une cohorte française, EPIBIO97, qui a inclut 773 individus entre 1997 et 2000, a comptabilisé toutes lestâches entrepris par les hommes (n=454) et les femmes (n=319). La plupart des participants ont aussi fait dond’échantillons biologiques (sang et urines). Un suivi a aussi eu lieu entre 2007 et 2010. En nousfocalisant sur les femmes de cette cohorte, le test des comètes a été appliqué aux échantillons sanguins obtenus àl’inclusion et au suivi afin d’évaluer les niveaux de dommages à l’ADN et une quantification des taux de méthylationde l’ADN grâce à une méthode développée en UHPLC-MS/MS. A l’inclusion, un excès de dommages à l’ADN a étéretrouvé parmi les femmes pratiquant la traite comparée aux femmes qui n’étaient pas exposées, des expositionsenvironnementales ont aussi été associés avec un excès de dommages tel que la présence de porcs sur l’exploitationet à l’inverse la présence de volailles était associée à une réduction de dommages. Les dommages à l’ADN étaient engénéral plus importants au suivi qu’à l’inclusion, l’exposition continue des femmes à certaines tâches a aussi été associé àun moindre risque d’augmentation de dommages à l’ADN, tel que la traite et la désinfection du matériel de traite par exemple.Vis-à-vis de la méthylation de l’ADN, une diminution du taux de méthylation a été trouvé parmi les femmes pratiquantla traite et appliquant des herbicides sur cours. L’association entre ces biomarqueurs et le risque de cancer a aussi étéévalué, où une augmentation des dommages à l’ADN au fil de temps a été associé avec un plus grand risque de cancer.Ces études montrent que les expositions professionnelles agricoles peuvent avoir un effet sur l’intégrité de l’ADN quipeut, à son tour, être associé au risque de cancer.The literature has shown an increased risk of certain diseases among the agricultural population,notably some locations of cancer, such as non-Hodgkin lymphoma for example. Severalepidemiological studies have found associations between agricultural occupational exposures and cancerdevelopment. In an attempt to bring elements of biological plausibility to these associations, molecularepidemiological studies have been brought forward. However, very few of these studies focus on female’sexposure. This is of particular interest since their exposures differ in terms of chemical use and tasks undertaken.A French cohort, EPIBIO97, which included 773 participants from 1997 to 2000, assessed the tasksundertaken by both male (n=454) and female workers (n=319). Most of these participants also gavebiological samples (blood and urine). A follow-up also took place from 2007 to 2010. Focusing on females, thecomet assay was applied to the samples obtained both at enrolment and follow-up to assess DNA damagelevels and a quantification of global DNA methylation levels was done using UHPLC-MS/MS on enrolment samples.At enrolment, an increased amount of DNA damage was found among females involved inmilking tasks compared to those not exposed, some environmental exposures were also associated withincreased damage such as the presence of swine on the farm and inversely, the presence of poultrywas associated with less DNA damage. DNA damage was also found to have increased betweenenrolment and follow-up and the continuous exposure to some tasks has been associated a decreased risk ofincreased DNA damage such as milking and disinfection of milking equipment for example.Regarding DNA methylation, a decrease in DNA methylation was found among females involved in milkingand those using herbicides on courtyards. These biomarkers were also tested for their association with cancerdiagnosis, where an increase in DNA damage overtime could be associated with a higher risk of cancer.These studies show that farming occupational exposures may have an effect on DNA integrity which can in turn beassociated with an increased risk of cancer

Modification d’une phase stationnaire de carbone graphitique poreux (PGC) pour l’analyse robuste à haut débit de marqueurs épigénétiques chez l’Homme par HPLC-MS/MS

International audienceLe développement des cancers et leurs progressions est intimement lié aux altérations épigénétiques. La méthylation de la cytidine est l’une de ces modifications, très souvent étudiée dans la littérature [1]. Cependant les données sur l’hydroxyméthylation de ce nucléoside sont plus rares alors qu’il a également été associé à la survenue de cancers [2]. Deux approches de l’étude des altérations épigénétiques est possible : (i) la méthylation de loci spécifiques la plus couramment étudiée reflète des modifications dans l’expression de certains gènes ou (ii) l’analyse des modifications épigénétiques sur l’ensemble du génome, reflétant des perturbations entrainant des modifications épigénétiques détectables sur l’ensemble de l’ADN (y compris les régions non codantes).Notre objectif était d’analyser la méthylation et l’hydroxyméthylation globales de l’ADN extrait de neutrophiles issus de sang humain par LC-MS/MS. Diverses méthodes sont utilisées dans la littérature pour analyser la méthylation de l’ADN, telle que l’utilisation de kits ELISA ou la PCR [3]. Cependant, la spécificité de la LC-MS/MS est supérieure à celle des autres techniques [4]. De plus, il s’agit d’une méthode plus robuste, automatisable, et donc plus adaptée à l’analyse de grandes séries d’échantillons. Il n’existe cependant à ce jour pas de méthode publiée et validée permettant l’analyse de la 5-hydroxymethylcytidine par LC-MS/MS. L’objectif de cette étude a donc été la mise au point d’une méthode d’analyse robuste permettant la séparation et la détection de ces deux marqueurs épigénétiques par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. La 5-hydroxymethylcytidine étant un composé très polaire et soluble uniquement dans l’eau, les colonnes C18 ne permettent pas sa rétention et le mode HILIC pose des problèmes de solubilité. L’ADN analysé est préparé par une étape automatisée d’hydrolyse enzymatique avant son injection. Il est indispensable d’avoir un facteur de rétention suffisant pour les deux composés afin d’éviter la suppression ionique due au pic de matrice. Une colonne de type carbone graphite poreux doit permettre la rétention de composés polaires dans un échantillons aqueux [5]. Les pics obtenus avec une colonne Hypercarb (150*3 mm, 5μm, Thermo Scientific, Waltham, Etats-Unis) sont cependant déformés et la rétention est trop élevée pour permettre une analyse rapide. Des modificateurs de phases sont généralement utilisés pour améliorer la qualité de séparation et perturber les interactions non souhaitées [6]. La triéthylamine et l’acide trichloracétique sont classiquement utilisés dans ce genre de cas de figure. Ces composés sont cependant non compatibles avec un couplage à la spectrométrie de masse car ils inhibent le signal. Suite aux modifications de la phase stationnaire, la colonne est donc rincée avant son installation sur le système de spectrométrie de masse. L’adsorption des modificateurs est ainsi maintenue dans la colonne sans perturber le signal en spectrométrie de masse.La colonne finalement obtenue a été utilisée pour l’analyse de 550 échantillons issus d’une cohorte française d’affiliés à la mutuelle agricole (MSA). Les analyses se sont étalées sur deux semaines et la colonne a été reconditionnée une fois durant cette période. Un contrôle a été injecté tous les 8 échantillons, en alternant concentration basse, moyenne et haute afin de vérifier la justesse des résultats. De plus, un étalon interne marqué au 13C pour la 5-méthylcytidine et au 2H pour la 5 hydroxyméthylcytidine a été utilisé pour chaque composé. Les échantillons sont analysés par plaques de 96 puits. Au cours d’une série de 96 échantillons le coefficient de variation du temps de rétention est de 0,63% pour la 5-méthylcytidine (inférieur à 5 secondes entre les temps de rétention maximum et minimum) et de 0,70% pour la 5-hydroxyméthylcytidine (inférieur à 8 secondes de différence entre les temps de rétention maximum et minimum). Le coefficient de variation pour la concentration obtenue dans le contrôle le plus bas est inférieur à 5%. L’analyse des résultats a permis de suivre les variations de ces marqueurs épigénétiques dans la population étudiée. La méthylation, l’hydroxymethylation ainsi que le rapport de leurs concentrations ont été suivis et leurs variations ont pu être associées à diverses habitudes de vie des participants.[1] Skvortsova, K., Stirzaker, C., Taberlay, P., Essays Biochem. 2019, 63, 797–811.[2] Pfeifer, G. P., Kadam, S., Jin, S.-G., Epigenetics Chromatin 2013, 6, 10.[3] Khodadadi, E., Fahmideh, L., Khodadadi, E., Dao, S., Yousefi, M., Taghizadeh, S., Asgharzadeh, M.,Yousefi, B., Kafil, H. S., BioMed Research International 2021, 2021, 1–9.[4] Pinho, A. R., Fortuna, A., Falcão, A., Santos, A. C., Seiça, R., Estevens, C., Veiga, F., Ribeiro, A. J.,Comparison of ELISA and HPLC-MS methods for the determination of exenatide in biological andbiotechnology-based formulation matrices. Journal of Pharmaceutical Analysis 2019, 9, 143–155.[5] Gautam, N., Alamoudi, J. A., Kumar, S., Alnouti, Y., J. Pharm. Biomed. Anal. 2020, 178, 112902.[6] Skvortsova, K., Stirzaker, C., Taberlay, P., Essays in Biochemistry 2019, 63, 797–811