Funktionelle Charakterisierung der cytoplasmatischen Domäne des Marburgvirus Oberflächenproteins GP

Das Marburgvirus (MARV) bildet zusammen mit dem Ebolavirus die Familie der Filoviridae, welche in menschlichen und nicht-menschlichen Primaten schwere hämorraghische Fieber verursachen können. Die Infektion von Zielzellen wird dabei durch das einzige Oberflächen-protein des MARV, das Glykoprotein GP vermittelt. Das Glykoprotein induziert die Bindung viraler Partikel an den zellulären Rezeptor, mit darauf folgender Endozytose, Fusion der viralen mit der endosomalen Membran, Freisetzung des Nukleocapsids in das Cytoplasma und darauf folgend Transkription und Replikation der viralen RNA. Bei dem MARV GP handelt es sich um ein klassisches Typ I Transmembranprotein bestehend aus einer großen Ektodomäne (220 kDa), einer Transmembran- und einer sehr kurzen cytoplasmatischen Domäne. Die Funktionen der Ekto- und Transmembrandomäne des MARV GP für den viralen Lebenszyklus wurden bereits weit reichend untersucht. Die Aufgabe der cytoplasmatischen Domäne des GP blieb bislang ungeklärt, möglicherweise weil die aus acht Aminosäuren aufgebaute Domäne keine klassischen Signalsequenzen enthält, die z.B. den intrazellulären Transport oder die Assemblierung und Ausschleusung viraler Partikel beeinflussen könnten. Im Laufe dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne den intrazellulären Transport des MARV GP entlang des klassischen sekretorischen Transport-wegs an die Plasmamembran nicht unmittelbar beeinflusst. Dies war erkennbar an den posttranslationalen Modifikationen wie N-Glykosylierung oder Oligomerisierung des GP, welche auch in Abwesenheit der cytoplasmatischen Domäne (GPΔCD) nicht signifikant verändert waren. Der Einfluss der cytoplasmatischen Domäne des GP auf den Zusammen-bau, Freisetzung und Infektiosität von MARV wurde mittels MARV-spezifischer infektiöser Virus-ähnlicher Partikel (iVLP) untersucht, die als Modellsystem für eine natürliche MARV Infektion gelten. Mittels quantitativer Immunelektronenmikroskopie wurde gezeigt, dass die cytoplasmatische Domäne des GP den Einbau des Proteins in iVLPs, als auch deren filamentöse Morphologie nicht beeinflusste, jedoch die erzeugten iVLPs eine deutlich reduzierte Infektiosität aufzeigten. Die zeitgleich auftretende verminderte O-Glykosylierung des GPΔCD wurde als ein Indiz für eine Konformationsänderung in der Ektodomäne angesehen, induziert durch die Abwesenheit der cytoplasmatischen Domäne. Mit Hilfe eines neu etablierten Aufnahmeassays konnte nachgewiesen werden, dass GPΔCD neben einer verringerten Infektiosität von iVLPs, auch deren verminderte Aufnahme in Ziel-zellen induzierte. Wir nehmen an, dass die Abwesenheit der cytoplasmatischen Domäne des Glykoproteins eine Konformationsänderung der Ektodomäne induziert (so genanntes „inside-out signaling“), was in einer verringerten Fusionsaktivität des GP und damit reduzierten Infektiosität resultiert

ROS-mediated waterlogging memory, induced by priming, mitigates photosynthesis inhibition in tomato under waterlogging stress

With global climate change, the frequency and intensity of waterlogging events are increasing due to frequent and heavy precipitation. Little is known however about the response of plants to repeated waterlogging stress events. The aim is to clarify physiological regulation mechanisms of tomato plants under repeated waterlogging stress, and whether Trichoderma harzianum can alleviate waterlogging injury. We identified two genotypes of tomato, ‘MIX-002’ and ‘LA4440’, as waterlogging tolerant and sensitive genotypes, respectively, based on plant biomass accumulation. The two tomato genotypes were subjected to a waterlogging priming treatment for 2 days (excess water for 1 cm above substrate surface) followed by a recovery stage for 2 days, and then a second waterlogging stress for 5 days (excess water for 1 cm above substrate surface) followed by a second recovery stage for 3 days. Leaf physiological, plant growth parameters, and the expression of five key genes were investigated. We found that the two genotypes responded differently to waterlogging priming and stress in terms of photosynthesis, reactive oxygen species (ROS), and osmotic regulatory mechanisms. Waterlogging stress significantly increased H2O2 content of ‘MIX-002’, while that of ‘LA4440’ had no significant change. Under waterlogging stress, photosynthesis of the two genotypes treated with waterlogging priming returned to the control level. However, Trichoderma harzianum treatment during the second recovery stage did not show positive mitigative effects. The plants of ‘LA4440’ with priming showed lower peroxidase (POD) activity and proline content but higher H2O2 content than that without priming under waterlogging stress. Under waterlogging stress with priming as compared to without priming, SODCC2 was downregulated in two tomatoes, and AGR2 and X92888 were upregulated in ‘MIX-002’ but downregulated in ‘LA4440’. Overall, the two tomato genotypes exhibited distinct photosynthetic, ROS and osmotic regulatory mechanisms responding to the waterlogging stress. Waterlogging priming can induce stress memory by adjusting stomatal conductance, sustaining ROS homeostasis, regulating osmotic regulatory substances and key gene expressions mediated by H2O2, and thus alleviate the damage on tomato photosynthesis when waterlogging reoccurred

Different strategies to achieve Pb-tolerance by the two Trebouxia algae coexisting in the lichen Ramalina farinacea

Lichen thalli are permeable to airborne substances, including heavy metals, which are harmful to cell metabolism. Ramalina farinacea shows a moderate tolerance to Pb. This lichen comprises two Trebouxia phycobionts, provisionally referred to as TR1 and TR9, with distinct physiological responses to acute oxidative stress. Thus, there is a more severe decay in photosynthesis and photosynthetic pigments in TR1 than in TR9. Similarly, under oxidative stress, antioxidant enzymes and HSP70 protein decrease in TR1 but increase in TR9. Since Pb toxicity is associated with increased ROS formation, we hypothesized greater Pb tolerance in this phycobiont. Accordingly, the aim of the present study was to characterize the physiological differences in the responses of TR1 and TR9 to Pb exposure. Liquid cultures of isolated phycobionts were incubated for 7 days in the presence of Pb(NO3)2. Thereafter, extracellular and intracellular Pb accumulation, photosynthetic pigments, and photosynthesis (as modulated chlorophyll fluorescence) were analyzed along with the antioxidant enzymes glutathione reductase (GR), superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APx), and catalase (CAT), and the stress-related protein HSP70. Pb uptake increased with the amount of supplied Pb in both algae. However, while significantly more metal was immobilized extracellularly by TR9, the amount of intracellular Pb accumulation was three times higher in TR1. In neither of the phycobionts were significant effects on photosynthetic pigments or photosynthetic electron transport observed. While under control conditions GR, SOD, and APx levels were significantly higher in TR1 than in TR9, only in the latter were these enzymes induced by Pb. This resulted in quantitatively similar antioxidant activities in the two algae when exposed to Pb. In conclusion, the phycobionts of R. farinacea make use of two different strategies against stress, in which the integration of distinct anatomical and physiological features affords similar levels of Pb tolerance.This study was supported by the Spanish Ministry of Science and Innovation (CGL2009-13429-C02-01/02) and the Generalitat Valenciana (PROMETEO 174/2008 and GVACOMP2011-205). We are grateful to the Central Support Service in Experimental Research (SCSIE), University of Valencia (Spain), for the TEM studies. We acknowledge Dr. Said Agouram (SCSIE, University of Valencia, Spain) for TEM-EDXS characterizations and for helpful discussions during the TEM investigations. We thank Wendy Ran and Daniel Sheerin for the English revision of the manuscript.Álvarez, R.; Del Hoyo, A.; García Breijo, FJ.; Reig Armiñana, J.; Del Campo, EM.; Guéra, A.; Barreno, E.... (2012). Different strategies to achieve Pb-tolerance by the two Trebouxia algae coexisting in the lichen Ramalina farinacea. Journal of Plant Physiology. 169(18):1797-1806. https://doi.org/10.1016/j.jplph.2012.07.005S179718061691

Funktionelle Charakterisierung der cytoplasmatischen Domäne des Marburgvirus Oberflächenproteins GP

Das Marburgvirus (MARV) bildet zusammen mit dem Ebolavirus die Familie der Filoviridae, welche in menschlichen und nicht-menschlichen Primaten schwere hämorraghische Fieber verursachen können. Die Infektion von Zielzellen wird dabei durch das einzige Oberflächen-protein des MARV, das Glykoprotein GP vermittelt. Das Glykoprotein induziert die Bindung viraler Partikel an den zellulären Rezeptor, mit darauf folgender Endozytose, Fusion der viralen mit der endosomalen Membran, Freisetzung des Nukleocapsids in das Cytoplasma und darauf folgend Transkription und Replikation der viralen RNA. Bei dem MARV GP handelt es sich um ein klassisches Typ I Transmembranprotein bestehend aus einer großen Ektodomäne (220 kDa), einer Transmembran- und einer sehr kurzen cytoplasmatischen Domäne. Die Funktionen der Ekto- und Transmembrandomäne des MARV GP für den viralen Lebenszyklus wurden bereits weit reichend untersucht. Die Aufgabe der cytoplasmatischen Domäne des GP blieb bislang ungeklärt, möglicherweise weil die aus acht Aminosäuren aufgebaute Domäne keine klassischen Signalsequenzen enthält, die z.B. den intrazellulären Transport oder die Assemblierung und Ausschleusung viraler Partikel beeinflussen könnten. Im Laufe dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne den intrazellulären Transport des MARV GP entlang des klassischen sekretorischen Transport-wegs an die Plasmamembran nicht unmittelbar beeinflusst. Dies war erkennbar an den posttranslationalen Modifikationen wie N-Glykosylierung oder Oligomerisierung des GP, welche auch in Abwesenheit der cytoplasmatischen Domäne (GPΔCD) nicht signifikant verändert waren. Der Einfluss der cytoplasmatischen Domäne des GP auf den Zusammen-bau, Freisetzung und Infektiosität von MARV wurde mittels MARV-spezifischer infektiöser Virus-ähnlicher Partikel (iVLP) untersucht, die als Modellsystem für eine natürliche MARV Infektion gelten. Mittels quantitativer Immunelektronenmikroskopie wurde gezeigt, dass die cytoplasmatische Domäne des GP den Einbau des Proteins in iVLPs, als auch deren filamentöse Morphologie nicht beeinflusste, jedoch die erzeugten iVLPs eine deutlich reduzierte Infektiosität aufzeigten. Die zeitgleich auftretende verminderte O-Glykosylierung des GPΔCD wurde als ein Indiz für eine Konformationsänderung in der Ektodomäne angesehen, induziert durch die Abwesenheit der cytoplasmatischen Domäne. Mit Hilfe eines neu etablierten Aufnahmeassays konnte nachgewiesen werden, dass GPΔCD neben einer verringerten Infektiosität von iVLPs, auch deren verminderte Aufnahme in Ziel-zellen induzierte. Wir nehmen an, dass die Abwesenheit der cytoplasmatischen Domäne des Glykoproteins eine Konformationsänderung der Ektodomäne induziert (so genanntes „inside-out signaling“), was in einer verringerten Fusionsaktivität des GP und damit reduzierten Infektiosität resultiert

Editorial: Influence of Protein-Protein Interactions (PPIs) on the Outcome of Viral Infections

International audienc

Vacuolar Protein Sorting Pathway Contributes to the Release of Marburg Virus ▿

VP40, the major matrix protein of Marburg virus, is the main driving force for viral budding. Additionally, cellular factors are likely to play an important role in the release of progeny virus. In the present study, we characterized the influence of the vacuolar protein sorting (VPS) pathway on the release of virus-like particles (VLPs), which are induced by Marburg virus VP40. In the supernatants of HEK 293 cells expressing VP40, different populations of VLPs with either a vesicular or a filamentous morphology were detected. While the filaments were almost completely composed of VP40, the vesicular particles additionally contained considerable amounts of cellular proteins. In contrast to that in the vesicles, the VP40 in the filaments was regularly organized, probably inducing the elimination of cellular proteins from the released VLPs. Vesicular particles were observed in the supernatants of cells even in the absence of VP40. Mutation of the late-domain motif in VP40 resulted in reduced release of filamentous particles, and likewise, inhibition of the VPS pathway by expression of a dominant-negative (DN) form of VPS4 inhibited the release of filamentous particles. In contrast, the release of vesicular particles did not respond significantly to the expression of DN VPS4. Like the budding of VLPs, the budding of Marburg virus particles was partially inhibited by the expression of DN VPS4. While the release of VLPs from VP40-expressing cells is a valuable tool with which to investigate the budding of Marburg virus particles, it is important to separate filamentous VLPs from vesicular particles, which contain many cellular proteins and use a different budding mechanism

VP40 Octamers Are Essential for Ebola Virus Replication

Matrix protein VP40 of Ebola virus is essential for virus assembly and budding. Monomeric VP40 can oligomerize in vitro into RNA binding octamers, and the crystal structure of octameric VP40 has revealed that residues Phe125 and Arg134 are the most important residues for the coordination of a short single-stranded RNA. Here we show that full-length wild-type VP40 octamers bind RNA upon HEK 293 cell expression. While the Phe125-to-Ala mutation resulted in reduced RNA binding, the Arg134-to-Ala mutation completely abolished RNA binding and thus octamer formation. The absence of octamer formation, however, does not affect virus-like particle (VLP) formation, as the VLPs generated from the expression of wild-type VP40 and mutated VP40 in HEK 293 cells showed similar morphology and abundance and no significant difference in size. These results strongly indicate that octameric VP40 is dispensable for VLP formation. The cellular localization of mutant VP40 was different from that of wild-type VP40. While wild-type VP40 was present in small patches predominantly at the plasma membrane, the octamer-negative mutants were found in larger aggregates at the periphery of the cell and in the perinuclear region. We next introduced the Arg134-to-Ala and/or the Phe125-to-Ala mutation into the Ebola virus genome. Recombinant wild-type virus and virus expressing the VP40 Phe125-to-Ala mutation were both rescued. In contrast, no recombinant virus expressing the VP40 Arg134-to-Ala mutation could be recovered. These results suggest that RNA binding of VP40 and therefore octamer formation are essential for the Ebola virus life cycle