A reliable bioassay procedure to evaluate per os toxicity of Bacillus thuringiensis strains against the rice delphacid, Tagosodes orizicolus (Homoptera: Delphacidae)

A reliable bioassay procedure was developed to test ingested Bacillus thuringiensis (Bt) toxins on the rice delphacid Tagosodes orizicolus. Initially, several colonies were established under greenhouse conditions, using rice plants to nurture the insect. For the bioassay, an in vitro feeding system was developed for third to fourth instar nymphs. Insects were fed through Parafilm membranes on sugar (10 % sucrose) and honey bee (1:48 vol/vol) solutions, observing a natural mortality of 10-15 % and 0-5 %, respectively. Results were reproducible under controlled conditions during the assay (18±0.1 °C at night and 28±0.1 °C during the day, 80 % RH and a 12:12 day:light photoperiod). In addition, natural mortality was quantified on insect colonies, collected from three different geographic areas of Costa Rica, with no significant differences between colonies under controlled conditions. Finally, bioassays were performed to evaluate the toxicity of a Bt collection on T. orizicolus. A preliminary sample of twenty-seven Bt strains was evaluated on coarse bioassays using three loops of sporulated colonies in 9 ml of liquid diet, the strains that exhibited higher percentages of T. orizicolus mortality were further analyzed in bioassays using lyophilized spores and crystals (1 mg/ml). As a result, strains 26-O-to, 40-X-m, 43- S-d and 23-O-to isolated from homopteran insects showed mortalities of 74, 96, 44 and 82 % respectively while HD-137, HD-1 and Bti showed 19, 83 and 95 % mortalities. Controls showed mortalities between 0 and 10 % in all bioassays. This is the first report of a reliable bioassay procedure to evaluate per os toxicity for a homopteran species using Bacillus thuringiensis strains.UCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias Básicas::Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM

Diversity of Bacillus thuringiensis strains isolated from coffee plantations infested with the coffee berry borer Hypothenemus hampei

The coffee berry borer Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Scolytidae) was first reported infecting Costa Rican coffee plantations in the year 2000. Due to the impact that this plague has in the economy of the country, we were interested in seeking new alternatives for the biological control of H. hampei, based on the entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Atotal of 202 B. thuringiensis isolates obtained from Costa Rican coffee plantations infested with H. hampei were analyzed through crystal morphology of the crystal inclusions and SDS-PAGE of d-endotoxins, while 105 strains were further evaluated by PCR for the presence cry, cyt and vip genes. Most of the Bt strains showed diverse crystal morphologies: pleomorphic (35%), oval (37%), bipyramidal (3%), bipyramidal and oval (12%), bipyramidal, oval and pleomorphic (10%) and bipyramidal, oval and cubic (3%). The SDS-PAGE analyses of the crystal preparations showed five strains with d-endotoxin from 20 to 40 kDa, six from 40 to 50 kDa, seven from 50 to 60 kDa, 19 from 60 to 70 kDa, 29 from 70 to 100 kDa and 39 from 100-145 kDa. PCR analyses demonstrated that the collection showed diverse cry genes profiles having several genes per strain: 78 strains contained the vip3 gene, 82 the cry2 gene, 45 the cry1 and 29 strains harbored cry3-cry7 genes. Atotal of 13 strains did not amplified with any of the cry primers used: cry1, cry2, cry3-7, cry5, cry11, cry12 and cry14. Forty-three different genetic profiles were found, mainly due to the combination of cry1A genes with other cry and vip genes. The genetic characterization of the collection provides opportunities for the selection of strains to be tested in bioassays against H. hampei and other insect pests of agricultural importance.En el año 2000 se reportó por primera vez la principal plaga del cafeto, conocida como broca (Hypothenemus hampei Ferrari) (Coleoptera: Scolitidae) en plantaciones de este cultivo en Costa Rica. Debido al impacto que esta plaga tiene en la economía del país, surgió la necesidad de encontrar una alternativa para el control biológico de esta plaga, basadas en la bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis. El objetivo de este trabajo fue aislar y caracterizar cepas de Bacillus thuringiensis a partir de plantaciones de café infestadas con H. hampei. Se aislaton 202 cepas que se analizaron mediante la morfología del cristal, SDS-PAGE de las d-endotoxinas, mientras que 105 cepas se evaluaron mediante PCR para determinar la presencia de genes cry, cyt y vip. La mayoría de las cepas presentaron diversas morfologías del cristal: pleomórficos (35%), ovalados (37%), bipiramidales (3%), bipiramidales y ovalados (12%), bipiramidales, ovalados y pleomórficos (10%) y bipiramidales, ovalados y cúbicos (3%). El análisis electorforético de las proteínas mostró que 5 cepas contenían d-endotoxinas con pesos moleculares entre los 20 y 40 kDa, 6 entre los 40 y 50 kDa, 7 entre los 50 y 60 kDa, 19 cepas entre los 60 y 70 kDa, 29 entre los 70 y 100 kDa y 39 cepas entre los 100 y 145 kDa. Los análisis mediante PCR mostró que la colección presenta una gran diversidad de genes cry, observándose varios genes por cepa: 78 cepas presentaron el gen vip3, 82 el gen cry2, 45 el gen cry1 y 29 cepas los genes cry3 y cry7. Un total de 13 cepas no amplificaron con los iniciadores cry1, cry2, cry3-7, cry5, cry11cry12 y cry14. Se encontraron 43 perfiles genéticos diferentes, detectándose principalmente la combinación de genes cry1A con otros genes cry o vip. La caracterización genética de esta colección provee información importante para la selección de cepas de Bacillus thuringiensis que se evaluarán mediante bioensayos contra Hypothenemus hampei u otras plagas de importancia económicaFundación para la Cooperación Costa Rica-Estados Unidos de América//CR-USA/Estados UnidosPrograma de Cooperación del Gobierno de MéxicoPrograma Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo//CYTED/EspañaUniversidad de Costa Rica//UCR/Costa RicaUCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias Básicas::Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM

Comparison of three in vitro protocols for direct somatic embryogenesis and plant regeneration of coffea arabica L. CVS. Caturra and Catuaí

Comparación de tres protocolos para la embriogénesis somática directa y la regeneración de plantas de Coffea arabica L. cvs. Caturra y Catuaí in vitro. La presente investigación tuvo como objetivo establecer una metodología para la inducción de la embriogénesis somática directa en las variedades de café Caturra y Catuaí. Se observó un efecto del genotipo en la inducción de la embriogénesis somática directa; con la variedad Caturra se obtuvo un mayor número de embriones somáticos (2,71±0,45). Los explantes de Caturra provenientes de plantas de 3 meses mostraron una mejor respuesta a la inducción de la embriogénesis somática directa que los explantes provenientes de plantas de 12 meses. De los explantes provenientes de plantas de 12 meses de Catuaí rojo no se obtuvo embriones somáticos en ninguno de los medios de cultivo evaluados. No hubo diferencias significativas en el número de embriones somáticos producidos a partir de la primera y segunda hoja de vitroplantas y los explantes provenientes de la parte distal, media y basal de las hojas de plantas de café. El medio de cultivo Yasuda resultó el más indicado para inducir la embriogénesis somática y el desarrollo de embriones somáticos en plántulas en Caturra. Mientras que para Catuaí rojo, fue el de Hatanaka.A coffee (Coffea arabica L. cvs. Caturra and Catuaí) plant regeneration protocol via direct somatic embryogenesis was established. Vitroplant explants from first and second pair of leaves and explants from the distal, middle, and basal sections of 3 and 12 month-old plants were cultivated on the protocols described by Yasuda, Hatanaka and CATIE. Caturra somatic embryos were cultured on the same embryo induction media or DEV medium. The maximum number of somatic embryos (2.71±0.45) was obtained from Caturra vitroplants. Explants from 3 month-old plants showed better response than 12 month-old Caturra explants. No somatic embryos were obtained in the in vitro protocols evaluated with 12 month-old Catuaí rojo plants. No differences were observed on the number of embryos produced from the first and second of vitroplant leaves and sections of the distal, middle, and basal coffee plant leaves. The Yasuda protocol was the most efficient to induce direct somatic embryogenesis and embryo-toplant conversion for the Caturra variety, whereas Hatanaka’s was the most suitable for the Catuaí variety.UCR::Vicerrectoría de Docencia::Ciencias Básicas::Facultad de Ciencias::Escuela de Biologí

Direct somatic embryogenesis in Coffea arabica L. cvs. Caturra and Catuaí: effect of tricontanol, light condition, and medium consistency

The influence of triacontanol (TRIA) concentration and its interaction with indole-3- acetic acid (IAA) on direct somatic embryogenesis (DSE) of Coffea arabica L. cvs Caturra and Catuaí was determined. Additionally, light conditions and culture medium consistency (semisolid vs. liquid) were evaluated. A higher average of somatic embryos per explant from Caturra (3.9±0.5) and Catuaí (3.6±0.5) leaves was obtained when 4.55 μM TRIA was added to the half-strength Murashige and Skoog (1962) medium supplemented with 1.1 μM benzilaminopurine (BAP) and 2.85 μM IAA. In relation to medium consistency, the highest number of embryoids in Caturra (3.2±0.2) and Catuaí (6.0±0.4) explants was obtained using Yasuda et al. (1985) semisolid medium. Regarding photoperiod, the number of embryoids per explant obtained for Catuaí cultured under a 16 h light photoperiod was 7.6±1.0 and in the dark 6.2±0.6. In Caturra, 4.2±0.4 embryoids were produced in the dark and 3.8±0.5 with 16 h light. No somatic embryos were observed in Caturra and Catuaí explants after 12 weeks of culture in liquid Yasuda et al. (1985) medium, and under any of the light conditions.Se investigó la influencia de la concentración de triacontanol (TRIA) y su interacción con el ácido indolacético (AIA) en la inducción de la embriogénesis somá- tica directa en Coffea arabica L. cvs. Caturra y Catuaí. Adicionalmente, se evaluó el efecto de la condición de la luz y de la consistencia del medio de cultivo (semisólido vs. líquido). Se determinó que la mayor cantidad de embriones somáticos por explante fue de 3,9±0,5 en Caturra y 3,6±0,5 en Catuaí, en el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) al 50%, complementado con BAP (1,1 µM), IAA (2,85 µM) y TRIA (4,55 µM). Para la consistencia del medio, la mayor cantidad de embriones somáticos en Caturra (3,2±0,2) y Catuaí (6,0±0,4) se obtuvo con el medio semisó- lido de Yasuda et al. (1985). En Catuaí, la mayor cantidad de embrioides se obtuvo con 16 h luz (7,6±1,0) y oscuridad (6,2±0,6) y para Caturra, con oscuridad (4,2±0,4) y 16 h luz (3,8±0,5). No se observó la formación de embriones somáticos en los explantes de Caturra y Catuaí después de 12 semanas de cultivo, en el medio líquido descrito por Yasuda et al. (1985) ni bajo ninguna de las condiciones de luz

Comparación de dos métódos de preparación de tejido para estudiar la anatomía interna del delfácido Tagosodes orizicolus con microscopia de luz y electrónica

Two methods of embedding, sectioning and staining were developed to study the intemal anatomy of the delphacid planthopper Tagosodes orizicolus, one of the most important plagues of rice in Latín America and the only vector of the hoja blanca tenuiVirus (RHBV), using both light and electron rnicroscopy. The paraffinehematoxiline- eosine Y Iliethod allows tite color identification of tissues, for example purple for fat tissue, pink for muscles, yellow- brown for exocutícle, while the resin-toluidíne-blue method preserves hetter the ultrastructure but do not permit colór identification. The informatíon obtained by these procedures is complementary and the material can also be used for in situ studies by irnmunomicroscopy, to assess the changes in cell ultrastructure and the localizatíon and replication of the RHBV during its infection cycle in the insect vector.Two methods of embedding, sectioning and staining were developed to study the intemal anatomy of the delphacid planthopper Tagosodes orizicolus, one of the most important plagues of rice in Latín America and the only vector of the hoja blanca tenuiVirus (RHBV), using both light and electron rnicroscopy. The paraffinehematoxiline- eosine Y Iliethod allows tite color identification of tissues, for example purple for fat tissue, pink for muscles, yellow- brown for exocutícle, while the resin-toluidíne-blue method preserves hetter the ultrastructure but do not permit colór identification. The informatíon obtained by these procedures is complementary and the material can also be used for in situ studies by irnmunomicroscopy, to assess the changes in cell ultrastructure and the localizatíon and replication of the RHBV during its infection cycle in the insect vector.UCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias Básicas::Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM

Relationship of genetically modified crops with the environment and health of the Costa Rican human population

La ingeniería genética y los alimentos derivados de los cultivos genéticamente modificados (CGMs) han sido objeto de debate a escala mundial, como ocurre históricamente con el surgimiento de tecnologías novedosas. Se cuestiona si los CGMs son seguros al ambiente y si los productos derivados de ellos son inocuos para los consumidores. Sobre la primera de esas inquietudes, la práctica se ha orientado a estudiar caso por caso, según las propias características del CGM, para minimizar su impacto en el ambiente. Estudios científicos en diversas latitudes han demostrado que no ha habido efectos dañinos en este particular. En cuanto a los alimentos derivados de los CGMs se han desarrollado sistemas de evaluación rigurosa para permitir su consumo y comercialización, y hay protocolos aprobados por la FAO y la OMS para garantizar su inocuidad. Hasta el momento, en ningún caso se han detectado contraindicaciones para la salud humana en los productos disponibles hoy en el mercado. Por su parte, Costa Rica estableció desde los años 90 un marco regulatorio en bioseguridad que se encarga de garantizar la seguridad para la salud y el ambiente en el manejo de los CGMs. Asimismo, se ha hecho una gran inversión estatal y privada en esta área, lo que le permitió a Costa Rica posicionarse en la región como uno de los primeros países con fortalezas en materia de bioseguridad y de investigación en ingeniería genética en centros de investigación nacionales. Cualquier intento de restringir o prohibir dicha actividad pondría en riesgo esa inversión, afectaría la generación de nuevo conocimiento para la toma de decisiones y el liderazgo alcanzado en el campo y nos privaría de los beneficios de esta prometedora tecnología.Genetic engineering and the food derived from genetically modified crops (GMCs) have been the center of debate worldwide, as has occurred historically with the advent of new technologies. Questions are derived from the potential impact of GMCs to the environment and the safety of the products to the consumers. In relation to the first inquiry, practice has been oriented to a case-by-case-study, according to the own characteristics of the GMC, in order to minimize its impact in the environment. Scientific studies in diverse latitudes of the world have demonstrated that GMCs in the market showed no adverse effects related to this issue. In relation to food derived from the GMCs, rigorous evaluation protocols have been developed and approved by FAO and WHO to guarantee the innocuousness of these products. Up to the moment, no contraindications for human health have been pointed out for the products that are available today in the market. In the particular case of Costa Rica, the country has established since the 90s a regulatory biosafety framework for the management of the GMCs, safeguarding the biodiversity of the country and the health of consumers. At the same time the country has made significant public and private investments in the field that allowed the country to obtain a leading position in biosafety in the region and genetic engineering research at national research centers. Any attempt to restrict or prohibit these activities in the country, will put in risk the previously described investment, will affect the generation of new knowledge for decision making and the leadership in the field, preventing the benefits derived from this promising technology

La ultraestructura de la superficie foliar de cultivares de maíz infectados con el virus del rayado fino

copyright 1980, Turrialba Revista Interamericana de Ciencias Agrícolas (IICA, Costa Rica). http://orton.catie.ac.cr/bco/rturrialba.html: “Gracias al Acuerdo Cooperativo Específico no. 58-8201-5-153F establecido entre el USDA / Servicio de Investigación Agrícola ,AgNIC y el IICA / Biblioteca Conmemorativa Orton. Turrialba en formato digital está disponible bajo el proyecto "Creando acceso de información a investigaciones agrícolas de alta calidad en Español - Revista Turrialba" Datos y artículo incluido por Lisela Moreira Carmona, con autorización de Dr. Rodrigo Gámez Lobo.The ultrastructural alterations induced by rayado fino in the foliar lamina of infected maize plants vary with plant genotype. The chlorotic spots or short stripes, typical of the macroscopic disease symptom, do not necessarily correlate with number and size of the altered areas visible only under the scanning electron microscope in the maize cultivars examined. The nature and degree of the morphological distortion differs also with the genetic constitution of the plant. These include modifications in size, shape and arrangement of cells, hypertrophy, atrophy or compression of epidermal cells, depression of cells in certain areas of the lamina, loss of definition of cell walls, and structural modifications of the stomata. The degree of stomatal alteration is possibly associated with modifications in hydric balance, gaseous exchange and photosynthesis. The modifications suffered by cells in localized areas of the foliar lamina could be related to the physiology of growth and development, and explain the macroscopic symptoms and gross changes associated with the rayado fino virus infection.Agencia Japonesa de Cooperación Internacional.Universidad de Costa Rica/[742-76-042]/UCR/Costa RicaUCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias Básicas::Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM

Characterization of a Bacillus thuringiensis strain collection isolated from diverse Costa Rican natural ecosystems

Como los ecosistemas naturales de Costa Rica figuran entre los más diversos del mundo, se propuso aislar la bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis (Bt) con el fin de conformar una colección de cepas y caracterizarlas molecularmente. Se obtuvieron 146 cepas a partir de muestras ambientales de diversas áreas protegidas, que incluían 9 de las 12 zonas de vida de Costa Rica. Se recobraron cepas del 71%, 63%, 61% y 54% de las muestras de suelo, hojas frescas, otros sustratos y hojarasca respectivamente. Se aisló Bt del 65% de las muestras del bosque tropical húmedo, un 59% de las muestras del bosque tropical seco. Del bosque tropical muy húmedo se aisló Bt del 75% de las muestras y finalmente del bosque tropical muy húmedo transición perhúmedo se encontró en el 69% de las muestras. Las cepas se caracterizaron según la morfología de los cuerpos paraesporales de inclusión, el peso molecular de las δ-endotoxinas y de genes cry, cyt y vip que contenían. Las cepas exhibieron cristales de diferente morfología, tamaño y número: irregulares, ovales, bipiramidales, cúbicos o mezclas de uno u otro. No se encontró correlación al comparar la forma de los cristales con el sitio de origen de la cepa. El análisis proteico de las mezclas de esporas y cristales mostró que las cepas contenían δ-endotoxinas de 20 a 160 kDa. El 66 por ciento de las cepas amplificaron con los imprimadores específicos para el gen cry2, 54% con vip3, 20% con el cry1, 9% con el cry3-cry7 y 8% con el gen cry8. Los genes cry11 y cyt se encontraron en el 8% y 7% de las cepas respectivamente. Veinticuato cepas no amplificaron con los imprimadores utilizados por lo que podrían contener genes novedosos. Las cepas que contenían el gen cry1 se amplificaron posteriormente con imprimadores específicos para la subfamilia de dicho gen, obteniéndose 13 perfiles diferentes. En síntesis, la diversidad genética de las cepas sugiere que la colección tiene un gran potencial para el control de diferentes especies de insectos de importancia económica en la agricultura y en salud pública. El análisis toxicológico de las cepas mediante bioensayos con insectos plaga proveerá información muy útil acerca del uso potencial de estas cepas para la formulación de bioinsecticida. Asimismo, lo genes cry y vip podrían utilizarse para, mediante ingeniería genética, conferir resistencia a los cultivos.Costa Rican natural ecosystems are among the most diverse in the world. For this reason, we isolated strains of the entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) to determine their diversity, distribution and abundance. A total of 146 Bt strains were obtained from environmental samples collected from diverse natural ecosystems and life zones of Costa Rica. We recovered Bt strains from 71%, 63%, 61% and 54% of soil samples, fresh leaves, other substrates and leaf litter respectively. Bt was isolated in 65% of the samples collected in the humid tropical forest in national parks (Braulio Carrillo, Gandoca Manzanillo, Sierpe, Hitoy Cerere, and Cahuita), and in 59% of the samples collected in the dry tropical forest (Parque Nacional Marino las Baulas, Palo Verde and Santa Rosa). In the very humid tropical forest (Tortuguero) Bt was isolated in 75% of the samples and in the very humid tropical forest transition perhumid (Carara) it was found in 69% of the samples. The strains exhibit a diverse number, size and morphology of parasporal inclusion bodies: irregular (47%), oval (20%), bipyramidal (3%), bipyramidal and cubic (1%), bipyramidal, oval and irregular (5%) and bipyramidal, oval and cubic crystals (2%). Strains isolated from Braulio Carrillo, Tortuguero and Cahuita, presented predominantly irregular crystals. On the other hand, more than 60% of the isolates from Térraba-Sierpe and Hitoy-Cerere had medium oval crystals. Strains from Gandoca-Manzanillo, Palo Verde and Carara presented mainly combinations of oval and irregular crystals. Nevertheless, the greatest diversity in crystal morphology was observed in those from Santa Rosa, Llanos del Río Medio Queso and Parque Marino las Baulas. Protein analyses of the crystalspore preparations showed δ-endotoxin with diverse electrophoretic patterns, with molecular weights in the range of 20 to 160 kDa. Fifty six percent of the strains amplified with the cry2 primer, 54% with vip3, 20% with cry1, 9% with cry3-cry7 and 8% with cry8. The cry11 and cyt genes were found in 8% and 7% of the strains, respectively. When analyzed with specific primers for the cry1 subfamily, 13 different genetic profiles were obtained. In addition, twenty-four strains did not amplify with any of the primers used, suggesting they contain novel cry genes. The diversity of Bt genes found in this collection indicates it could have great potential for the control of different species of insect pests. The toxicological characterization of the strains by bioassays against important insect pests will provide useful information about their potential use for the formulation of biological insecticides and their respective cry and vip genes for the transformation of crops to confer resistance to insects. Rev. Biol. Trop. 54(1): 13-27. Epub 2006 Mar 31.Fundación para la Cooperación Costa Rica-Estados Unidos de América (CR.USA)Programa de Cooperación del Gobierno de MéxicoPrograma Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo//CYTED/EspañaUniversidad de Costa Rica//UCR/Costa RicaUCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias Básicas::Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM

Optimization of coffee (Coffea arabica) transformation parameters using uidA and hpt genes: effect of osmotic pre-treatment, helium pressure and target distance

The aim of this work was to optimize the biolistic delivery parameters that affect the DNA delivery and stable expression of marker genes into coffee tissues (Coffea arabica. L. cvs. Caturra and Catuaí). The effect of osmotic preculture length, osmotic concentration of medium, Helium pressure and target distance on transient expression of the uidA gene in coffee leaves and somatic embryos were tested. The highest transient uidA expression was obtained when Caturra (18.3±2.8) and Catuaí (6.8±2.0) leaves and Catuaí embryos (80.0±7.4) were cultured for 5h on Yasuda medium complemented with 0.5M Mannitol +0.5M Sorbitol. The combination of 1100psi and a target distance of 9cm resulted in the highest number of blue spots per Caturra leaf segment (23.6±3.9), whereas for the Catuaí variety the combination of 1100psi and a target distance of six (10.2±1.9) and nine (8.2±1.9) cm gave the highest number of blue spots per leaf segment. The optimized protocol was tested with pCAMBIA 1 301 (uidA gene and the hpt gene), pCAMBIA 1 305.2 (uidA version GUSPlus ™ and the hpt gene) and pCAMBIA 1 301-BAR (uidA gene and the bar gene). The highest number of blue spots was obtained when Caturra (54.6±5.7) and Catuaí (28.9±4.3) leaves were bombarded with pCAMBIA 1 305.2. Selection of bombarded coffee tissues with 100mg/l hygromicyn caused the oxidation of tissues.La presente investigación tuvo como objetivo optimizar los parámetros que afectan la incorporación y expresión de genes marcadores mediante biobalística en segmentos de hoja y embriones somáticos de café (Coffea arabica. L. cvs. Caturra y Catuaí). La mayor expresión transitoria del gen uidA en segmentos de hoja de Caturra (18.3±2.8) y Catuaí (6.8±2.0) y embriones somáticos de Catuaí (80.0±7.4) se obtuvo al cultivar los explantes por cinco horas previo al bombardeo en el medio Yasuda complementado con 0.5M mannitol+0.5M sorbitol. Asimismo, se obtuvo una mayor expresión transitoria del gen uidA al bombardear los segmentos de hoja de Caturra y Catuaí y embriones somáticos de Catuaí con una presión de helio de 1 100psi y una distancia de bombardeo de 6 o 9 cm

Phylogenetic position of the yeast-like symbiotes of Tagosodes orizicolus (Homoptera: Delphacidae) based on 18S ribosomal DNA partial sequences

Tagosodes orizicolus Muir (Homoptera: Delphacidae), the endemic delphacid species of tropical America carries yeast-like symbiotes (YLS) in the abdominal fat bodies and the ovarial tissues, like other rice planthoppers of Asia. These YLS are obligate symbiotes, which are transmitted transovarially, and maintain a mutualistic relationship with the insect host. This characteristic has made in vitro culture and classification of YLS rather difficult using conventional methods. Nevertheless, microorganisms of similar characteristics have been successfully classified by using molecular taxonomy. In the present work, the YLS of Tagosodes orizicolus (YLSTo) were purified on Percoll® gradients, and specific segments of 18S rDNA were amplified by PCR, cloned and sequenced. Sequences were aligned by means of the CLUSTAL V (DNASTAR) program; phylogenetic trees were constructed with the Phylogeny Inference Package (PHYLIP), showing that YLSTo belong to the fungi class Pyrenomycetes, phylum Ascomycota. Similarities between 98% and 100% were observed among YLS of the rice delphacids Tagosodes orizicolus, Nilaparvata lugens, Laodelphax striatellus and Sogatella furcifera, and between 89.8% and 90.8% when comparing the above to YLS of the aphid Hamiltonaphis styraci. These comparisons revealed that delphacid YLS are a highly conserved monophyletic group within the Pyrenomycetes and are closely related to Hypomyces chrysospermusTagosodes orizicolus Muir (Homoptera: Delphacidae) es una especie endémica de América tropical que al igual que otros saltahojas de Asia, tiene simbiontes levaduriformes (YLS, por sus siglas en Inglés) en los cuerpos grasos del abdomen y en los tejidos de los ovarios. Los YLS son simbiontes obligados que se transmiten transovarialmente y que mantienen relaciones mutualística con el insecto hospedero. Esta característica ha hecho muy difícil su cultivo in vitro y por ende su clasificación utilizando métodos convencionales. Sin embargo, otros microorganismos de características similares se han clasificado con éxito utilizando taxonomía molecular. El presente trabajo tiene como objetivo caracterizar los YLS del delfácido Tagosodes orizicolus (YLSTo). Para ello se purificaron los YLSTo en gradientes de Percoll® y el ADN extraído se amplificó por PCR utilizando iniciadores específicos para secuencias parciales del ADN ribosomal 18S. Dichos fragmentos se clonaron y secuenciaron posteriormente. Las secuencias se alinearon mediante el programa CLUSTAL V DNASTAR) y se construyeron árboles filogenéticos con el programa Phylogeny Inference Package (PHYLIP). Se encontró que los YLSTo pertenecen a la clase de hongos Pyrenomycetes, phylum Ascomycota. Se observaron índices de similaridad entre 98% y 100% entre los YLS de Tagosodes orizicolus, Nilaparvata lugens, Laodelphax striatellus and Sogatella furcifera (todos delfácidos de arroz), e índices de similaridad entre 89.8% y 90.8% al compararse con los YLS del áfido Hamiltonaphis styraci. Estas comparaciones revelaron que los YLS de los delfácidos constituyen un grupo monofilético altamente conservado dentro de los Pyrenomycetes y que se relacionan cercanamente con Hypomyces chrysospermus