Eficacia de la Técnica de Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay con antígenos de Excreción-Secreción de Tripomastigotes de Trypanosoma cruzi para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas

Se estima que aproximadamente 10 millones de personas están infectadas por Trypanosoma cruzi, agente productor de la enfermedad de Chagas en América Latina y más de 15 millones de personas están a riesgo de adquirirla.  El presente trabajo tuvo como finalidad determinar la eficacia de la Técnica de Elisa con la utilización de antígenos de excreción-secreción de tripomastigotes de T. cruzi (TESA) en la detección de anticuerpos específicos. Los tripomastigotas se obtuvieron a partir de epimastigotes de una cepa proveniente Arequipa (Perú), a la cual se le incrementó su biomasa en medio bifásico hasta obtener 1x108  parásitos/mL durante 15 días, luego fueron cultivados en medio Grace y en Medio de Eagle (Minimun Essential Medium) para la obtención de los TESA. Estos fueron enfrentados con sueros controles para determinar la eficacia de un ELISA-indirecto. Se encontró que la sensibilidad fue del 100% y la especificidad del 95%. Se concluye que la Técnica de ELISA puede ser utilizada a gran escala, por la facilidad de evaluar un número elevado de muestras y obtener resultados automatizados que no dependen de la subjetividad del personal para su interpretación.Palabras clave: Enfermedad de Chagas, ELISA, trpomastigotas, Trypanosoma cruz

DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS SOMÁTICOS Y DE EXCRECIÓN-SECRECIÓN DE LEISHMANIA PERUVIANA POR ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA UTILIZANDO IGY PRODUCIDOS EN GALLUS GALLUS INMUNIZADOS EXPERIMENTALMENTE

The purpose of this study was to determine the somatic and excretory-secretory antigens by Leishmania peruviana electroblotted using IgY antibodies produced by immunized experimental Gallus gallus. Antigens were obtained by centrifugation of promastigotes grown at 37 °C for 20 h in Minimun Essential Medium-Eagle (MEM-Sigma), the supernatant containing the excretory secretory antigens and somatic antigens sediment. For the anti-leishmania antibodies IgY, two hens were immunized first with the excretory-secretory antigens and the second with somatic antigens. When faced with L. peruviana antigens with IgY it was noted that somatic antigens produced ten antigenic bands with molecular weights of 10, 12, 17, 20, 31, 38, 69, 87, 93 and 105 kDa; with excretory-secretory antigens nine antigenic bands of molecular weights of 17, 20, 31, 52, 67, 78, 87, 93 and 105 kDa were produced, observing five common antigens 20, 31, 87, 93 and 105. Such somatic and excretory-secretory antigens by promastigotes of L. peruviana that have been detected by electroblotting technique could be used in the future for diagnosis of cutaneous leishmaniasis.La finalidad del presente estudio fue determinar los antígenos somáticos y de excreciónsecreción de Leishmania peruviana por electroinmunotransferencia utilizando anticuerpos IgY producidos en Gallus gallus inmunizados experimentalmente. Los antígenos fueron obtenidos por centrifugación de promastigotas cultivados a 37°C por 20 h en Minimun Essential Medium- Eagle (MEM-Sigma), el sobrenadante contenía a los antígenos de excresión-secresión y el sedimento a los antígenos somáticos. Para obtener los anticuerpos IgY anti-leishmania, se inmunizaron dos gallinas, a la primera con antígenos de excresión-secresión y a la segunda con antígenos somáticos. Al enfrentar los antígenos de L. peruviana con la IgY se observó que los antígenos somáticos produjeron diez bandas antigénicas con pesos moleculares de 10, 12, 17, 20, 31, 38, 69, 87, 93 y 105 kDa; y los antígenos de excreción-secreción nueve bandas antigénicas de pesos moleculares de 17, 20, 31, 52, 67, 78, 87, 93 y 105 kDa, observándose cinco antígenos comunes de 20, 31, 87, 93 y 105. Dichos antígenos somáticos y excreción-secreción de promastigotas de L. peruviana que han sido detectados por la técnica de inmunoelectrotranferencia podrían ser utilizados en un futuro para el diagnóstico de leishmaniosis cutánea

Comparación de antígenos de excreción-secreción de epimastigotes (ESEA) y tripomastigotes (TESA) de Trypanosoma cruzi mediante Western blot para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas

La enfermedad de Chagas es causada por el protozoario Trypanosoma cruzi y se presenta como una enfermedad de naturaleza crónica cuyo diagnóstico serológico depende la calidad del antígeno. En la presente investigación se comparó el número, peso molecular y reactividad antigénica mediante Electroinmunotransferencia “Western Blot”, usando pooles de sueros positivos a la enfermedad de Chagas, de antígenos de excreción-secreción de epimastigotas (ESEA) y tripomastigotes (TESA) de T. cruzi cepa “C4” proveniente del departamento de Arequipa (Perú). Para ello, los epimastigotas fueron incubados en medio Bifásico (agar BHI-sangre/PYLB) por 15 días, a temperatura ambiente, y luego de en Minimum Essential Medium (MEM) para obtener los antígenos ESEA; los TESA, por su parte, se obtuvieron del mismo modo que para los ESEA, incluyendo una fase de transformación denominada Metaciclogénesis. La concentración de las proteínas se determinó mediante el método colorimétrico de Bradford. Mediante “Western Blot”, finalmente, se determinó los perfiles antigénicos de los ESEA y de los TESA de la cepa “C4” registrando 22 bandas y 23 bandas, respectivamente, comprendidas en un rango de 100 a 10 kDa para cada una de ellas. Se concluye que existe mayor reactividad antigénica para los TESA, además de la presencia de una banda de 18 kDa de los TESA en relación a los ESEA, al comparar los antígenos de excreción-secreción de epimastigotas (ESEA)  y tripomastigotes (TESA) de Trypanosoma cruzi  cepa “C4”, evaluadas mediante Electroinmunotransferencia.Palabras clave: antígenos ESEA, antígenos TESA, Trypanosoma cruzi, Western blot

EVALUACIÓN MEDIANTE UN INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO (ELISA) DE ANTÍGENOS DEL FLUIDO SEUDOCELOMATICO DE Toxocara canis PARA DETECTAR ANTICUERPOS ESPECÍFICOS

Toxocara canis es un parásito cuyas larvas L3 causan la toxocariasis humana, zoonosis de distribución mundial con elevadas prevalencias en áreas neotropicales. La toxocariasis se diagnostica mediante la prueba inmunoenzimatica (ELISA) indirecta con antígenos de excreción-secreción (TES), considerada la prueba de referencia; sin embargo, existen otros tipos de antígenos aun no investigados. En la presente investigación se evaluó el rendimiento (la capacidad) de una prueba de ELISA indirecta utilizando como antígeno al sobrenadante del fluido seudocelómico de las formas adultas hembras de Toxocara canis (TFS). Los parásitos fueron recolectados de cachorros de perro (Canis lupus familiaris) naturalmente infectados y el TFS se obtuvo en condiciones de esterilidad cortando el extremo final del parásito y luego centrifugado. La concentración de proteínas se midió con un kit de Bradford (KB) y la antigenicidad mediante la técnica de Western blot (Wb) con suero hiperinmune de conejo experimentalmente inmunizado. Las pruebas de ELISA se hicieron con el TFS y 20 sueros positivos a Toxocara, 10 sueros positivos a otras parasitosis y negativos a Toxocara y 52 sueros de niños de una zona rural de la provincia de Pataz (La Libertad, Perú). El punto de corte fue de 3,0 a densidades ópticas de 450 nm en un lector de ELISA (Perkin-Elmer). Se encontró, mediante el KB una concentración de proteínas de 3500 ug/uL y mediante el Wb, 18 bandas reactivas (entre 9,1 y 87,2 KDa). Todos los sueros positivos de la seroteca resultaron también positivos y los positivos a otras parasitosis resultaron negativos. En el lote de sueros de niños de la zona rural se encontró un porcentaje de 7,8% (4/52). En conclusión, La prueba de ELISA indirecta utilizando como antígeno el sobrenadante del fluido seudocelómico de las formas adultas hembras de Toxocara canis obtenidas de perro, Canis lupus familiaris, infectado naturalmente rinde adecuadamente (es eficaz) en la detección de anticuerpos específicos. Palabras clave: Antigenicidad, Canis lupus familiaris, ELISA, fluido seudocelomico, Toxocara canis Abstract Toxocara canis is a causative agent of human toxocariasis, a zoonosis with a worldwide distribution with high prevalences in Neotropical areas. Toxocariasis is diagnosed by indirect enzyme immunoassay (ELISA) with excretion-secretion antigens (TES), considered the gold standard test; however, there are other types of antigens not yet investigated. In the present investigation, the performance (capacity) of an indirect ELISA test was evaluated using the supernatant of the pseudocoelomic fluid of the adult female forms of Toxocara canis (TFS) as antigen. The parasites were collected from naturally infected dog puppies (Canis lupus familiaris) and the TFS was obtained under sterile conditions by cutting the end of the parasite and then centrifuging. Protein concentration was measured with a Bradford kit (KB) and antigenicity by Western blot technique (Wb) with experimentally immunized rabbit hyperimmune serum. The ELISA tests were made with the TFS and 20 sera positive for Toxocara, 10 sera positive for other parasites and negative for Toxocara, and 52 sera from children from a rural area of the Pataz province (La Libertad, Peru). The cut-off point was 3.0 at optical densities of 450 nm in an ELISA reader (Perkin-Elmer). A protein concentration of 3500 ug/uL was found by KB and 18 reactive bands (between 9.1 and 87.2 KDa) were found by Wb. All the positive sera from the seroteca were also positive and those positive for other parasites were negative. A percentage of 7.8% (4/52) was found in the lot of sera from children in rural areas. In conclusion, the indirect ELISA test using as antigen the supernatant of the pseudocoelomic fluid of the adult female forms of Toxocara canis obtained from the naturally infected dog, Canis lupus familiaris, performs adequately (is effective) in the detection of specific antibodies. Keywords: Antigenicity, Canis lupus familiaris, ELISA, pseudocoelomic fluid, Toxocara canis *Autor para correspondencia: E mail: [email protected] DOI: http://dx.doi.org/10.17268/rebiol.2021.41.01.0

Antígenos de excreción-secreción de tripomastigotas de Trypanosoma cruzi detectados por Western Blot usando sueros de pacientes con parasitosis confirmada

La enfermedad de Chagas, enfermedad parasitaria causada por el protozoario Trypanosoma cruzi, se caracteriza por su endemicidad y silencioso proceso sin manifestaciones clínicas por tiempo prolongado, a veces décadas, de cuya cronicidad resultan episodios fatales. El parásito posee varias formas evolutivas y dos huéspedes: un vertebrado (hombre y otros mamíferos) y otro invertebrado, el vector (triatominos). Debido a que no se cuenta con un diagnóstico serológico estandarizado que permita el análisis confiable de poblaciones en riesgo de modo tal que pueda proponerse la implementación de tratamientos oportunos, se planteó una investigación dirigida a identificar a los antígenos de excreción-secreción de los tripomastigotas de Trypanosoma cruzi obtenidos por metaciclogénesis de epimastigotas cultivados a partir de tripomastigotas metacíclicos aislados de  Panstrongylus chinai   naturalmente infectado en el valle Chamán (La Libertad) mediante la técnica de Western blot utilizando sueros de pacientes con enfermedad de Chagas confirmada. Para ello, los cultivos de epimastigotas se hicieron en medio BHI/PYLB, la metaciclogénesis en Grace´s Insect Medium (Sigma) suplementado con suero bovino fetal y la obtención de productos excretados-secretados en Eagle´s Minimun Essential Medium (Sigma). Se obtuvo 60% de metaciclogénesis a tripomastigotas con patogenicidad comprobada en ratones BALB/c, asimismo, 24 bandas reactivas mediante el Western blot, con pesos moleculares variables entre 13.8 y 97.4 KDa y dos grupos de bandas de mayor reactividad: de 21 a 31 y de 45 a 100 KDa. De ellas, la banda de 43.7 KDa también apareció cuando se cruzaron con sueros de pacientes con toxoplasmosis y leishmaniasis.Palabras clave: Enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzi, Panstrongylus chinai, Western blo

Prevalence of fascoliasis in sheep and cattle in the province of Pataz, La Libertad, Peru through coproparasitological tests and Western Blot

El estudio tuvo como objetivo determinar la prevalencia de fascioliasis en ovinos y bovinos en cinco distritos de la Provincia de Pataz, La Libertad, Perú, mediante examen coprológico y western blot. El estudio fue de tipo transversal prospectivo. Se evaluaron muestras de heces y de sangre de 388 ovinos y 365 bovinos de los distritos de Buldibuyo, Chillia, Huaylillas, Taurija y Urpay, entre abril y octubre de 2015 por los métodos de formol-éter y Kato Katz y de Western Blot. El 61.8% de ovinos y el 86.8% de bovinos presentaron anticuerpos anti-Fasciola hepatica (serología positiva) y el 42.3% de los ovinos y el 62.4% de los bovinos presentaron huevos de F. hepatica en heces (coprología positiva). Los distritos de Buldibuyo, Chillia y Huaylillas presentaron las mayores prevalencias de fascioliasis, tanto en ovinos como en bovinos. Se concluye que la provincia de Pataz puede ser considerada zona hiperendémica a fasciolosis por Fasciola hepatica.The aim of this study was to determine the prevalence of fascioliasis in sheep and cattle in five districts of the Province of Pataz, La Libertad, Peru, through coprological tests and Western blot. The study was a prospective cross-sectional type. Faecal and blood samples from 388 sheep and 365 cattle were evaluated from the districts of Buldibuyo, Chillia, Huaylillas, Taurija and Urpay, between April and October 2015 by the methods of formalin-ether and Kato Katz and Western Blot. Results showed than 61.8% of sheep and 86.8% of cattle presented anti-Fasciola hepatica antibodies (positive serology) and 42.3% of sheep and 62.4% of bovines presented eggs of F. hepatica in faeces (positive coprology). The districts of Buldibuyo, Chillia and Huaylillas presented the highest prevalence of fascioliasis in both ovine and bovine. It is concluded that the province of Pataz can be considered hyperendemic zone to fasciolosis by Fasciola hepatica

INFECCIÓN DE LYMNAEA POR FASCIOLA HEPATICA (LINNAEUS, 1758) EN LA PROVINCIA DE PATAZ, PERÚ E IDENTIFICACIÓN DE PLANTAS ASOCIADAS A SUS BIOTOPOS

Los caracoles pulmonados de agua dulce del género Lymnaea Lamarck, 1799 (Mollusca: Basommatophora) actúan como hospederos intermediarios en el ciclo biológico de Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) agente etiológico de la fascioliasis, enfermedad zoonótica emergente de gran importancia por el impacto negativo en la producción pecuaria y en la salud de la población humana; sin embargo, algunos aspectos epidemiológicos importantes han sido parcialmente abordados, entre ellos, la distribución y magnitud de la infección del caracol huésped intermediario y el registro de las especies de vegetales asociadas a los hábitats de estos gasterópodos. En la presente investigación se propuso (i) determinar el porcentaje de parasitismo por F. hepatica en Lymnaea Lanmarck, 1799 (hospedero intermediario) en un Anexo de seis distritos (Buldibuyo, Chillia, Huaylillas, Taurija, Tayabamba y Urpay) de la Provincia de Pataz, Región La Libertad-Perú, en las estaciones de invierno y primavera del 2016, y (ii) identificar a las especies de vegetales de tallo corto presentes en los ambientes de captura de Lymnaea positivo a la infección por F. hepatica. Tanto los caracoles como los vegetales fueron identificados en base a sus características morfológicas y la búsqueda de redias y cercarias del parásito se hizo utilizando la técnica de aplastamiento y posterior disección de los caracoles. Se identificó a Lymnaea viatrix d´Orbigni, 1835 como única especie presente, con mayores frecuencias de infección en la estación de invierno en el distrito de Buldibuyo (39,6%) y en la estación de primavera en el distrito de Huaylillas (49,1%). También se encontró que las frecuencias de infección, en general, fueron más altas en primavera que en invierno. Se identificó a nueve especies de plantas en las zonas donde se detectaron al caracol infectado naturalmente con F. hepatica. Estas son: Adiantum sp. (culantrillo), Lactuca sativa Linnaeus (lechuga), Lemna minor (L.) Griff. 1851 (lenteja de agua), Medicago sativa Linnaeus (alfalfa), Pennisetum clandestinum Hochst. ex Chiov. (pasto kikuyu), Polygonum punctatum (Elliott) Small (catay dulce), Nasturtium officinale W.T. Aiton (berro), Thelypteris sp. (helecho) y Verbena litoralis Kunth (verbena)

Detección de antígenos sanguíneos humanos del grupo ABO en larvas de Necator americanus incubadas en presencia de eritrocitos tipificados

El mimetismo molecular se ha asociado con la cronicidad de las infecciones parasitarias, este mecanismo puede deberse a la absorción de moléculas del hospedador o a la síntesis de moléculas similares. Los objetivos de este trabajo son estudiar la adsorción de determinantes antigénicas ABO por cultivo in vitro de larvas filariformes de Necator americanus. Se trabajó con larvas filariformes obtenidas de la eclosión de huevos de este helminto mediante el método de Harada-Mori, y fueron recolectadas por el método de Baermann-Moraes en cuatro tubos con medio RPMI 1640 suplementado con antibióticos. En los tubos 1, 2 y 3 se adicionó eritrocitos de tipo A, B y O, respectivamente. El tubo 4 se usó como control negativo. Luego de 10 días de incubación de los 4 tubos se aplicó la técnica de Inhibición de la Aglutinación usando anticuerpos monoclonales comerciales. Los resultados mostraron que las larvas presentan antígenos A y B de los eritrocitos agregados al medio de cultivo. Se concluyó que estas larvas captan estos determinantes antigénicos presentes en los eritrocitos del huésped, ya que su ciclo de vida incluye una migración por el torrente sanguíneo. Palabras clave: Necator americanus, Grupo ABO, eritrocitos tipificado

Infección por Fasciola hepatica en escolares de la provincia de Pataz (La Libertad, Perú): prevalencia y perfil hepático

Introducción: La fascioliasis en una zoonosis emergente, desatendida y prevalente en zonas rurales de la sierra del Perú; sin embargo, la prevalencia en cada zona y la repercusión en la salud de la población infantil se desconoce. El objetivo de la presente investigación es determinar la prevalencia de infección por Fasciola hepatica en niños de edad escolar de siete distritos de la Provincia de Pataz (Parcoy, Chillia, Buldibuyo, Huyalillas, Tayabamba, Urpay y Taurija), Región La Libertad (Perú), así como, las deficiencias funcionales hepáticas en los niños seropositivos. Material y métodos: Entre mayo y noviembre del 2016 se realizó un estudio observacional transversal de 685 muestras fecales y 685 muestras sanguíneas de niños entre 4 a 14 años; la seroprevalencia se determinó mediante la técnica de Western blot, la prevalencia (infección) mediante técnicas coprológicas (Ritchie y Kato-Katz-Baerman), y el perfil hepático utilizando un analizador automatizado (BT3000 plus, Labin). Resultados: Se encontró una seroprevalencia global de 7.4 % por Western Blot y una prevalencia de 2.3% por examen coproparasitoscópico; Buldibuyo (14%) y el grupo etario de 6-8 años presentaron las mayores seroprevalencias, asimismo, en Buldibuyo se presentaron la mayoría (7 casos, 1.9%) de positividad a huevos de F. hepatica. El 68,1% de niños presentaron alteración en los valores de proteínas o enzimas hepáticas y el 46,8% de Fosfatasa Alcalina. Conclusiones: La zona central-sur de la provincia de Pataz en una zona mesoendémica (menos del 10%) según la clasificación de Mas-Coma (1999) y los niños positivos a la infección por F. hepática presentan perfil hepático alterado.Palabras clave: Fascioliosis; Prevalencia; seroprevalencia; hepatico; Western blottingDOI: http://dx.doi.org/10.17268/rmt.2019.v14i02.0

Efecto de antígenos de epimastigota de Trypanosoma cruzi obtenidos a diferentes tiempos de incubación sobre anticuerpos producidos en Oryctolagus cuniculus.

La técnica de Western blot es usada para confirmar el diagnóstico de diversas enfermedades parasitarias y está siendo estandarizada para la Enfermedad de Chagas, por ello es necesario resolver algunas interrogantes que permitan su mejor aplicación. Una de ellas es, cuál es el efecto de antígenos de excreción-secreción de epimastigotas de Trypanosoma cruzi cepa C1 aislada de Triatoma infestans de Arequipa (Perú) obtenidos a seis y 18 horas de incubación, sobre anticuerpos producidos en conejo, Oryctolagus cuniculus, mediante la técnica de Western blot. Para ello, se emplearon sueros de conejos inmunizados con preparaciones antigénicas obtenidas a las seis y 18 horas de incubación en medio mínimo esencial (MEM-Eagle Difco), analizándose su reactividad mediante la técnica de Western blot. Se evidenció la presencia de seis bandas reactivas cuando se usaron los antígenos obtenidos a las seis horas de incubación y 15, cuando se usaron los antígenos obtenidos a las 18 horas, estas últimas, además, muestran mejor reactividad. En conclusión, a menor tiempo de incubación se producen menor número de antígenos de excreción-secreción detectados por la técnica de Western blot.Palabras clave: Western blot, epimastigotes de Trypanosoma cruzi, Oryctolagus cuniculu