Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies and its reactivation rescues myofiber degeneration

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Ruolo della regolazione post-traduzionale del fattore di trascrizione FoxO3 nel muscolo scheletrico durante l'atrofia muscolare

FoxO proteins are transcription factors that control cell cycle progression, DNA repair, muscle atrophy, stress resistance and apoptosis. These divergent functions are carefully regulated by post-translational modifications including phosphorylation, acetylation and ubiquitination, these mechanisms seem to coordinate the localization, activity and longevity of FoxO protein in a time-dependent manner to ensure a fine regulation. During muscle atrophy FoxO3 is negatively regulated by AKT phosphorylation, which determines its nuclear localization and activation. We studied the role of acetylation on FoxO3 in adult skeletal muscle, a post translational modification that modulates FoxO activity. To fulfill this purpose, we have generated different FoxO3 mutants which prevent acetylation (KR) or mimic acetylation (KQ). By a Luciferase assay, we discovered that mutants show the opposite behavior in activating the promoter, notably acetylation-mimicking mutants displayed a lower transcriptional activity. Moreover hyperacetylation reduces FoxO-dependent muscle atrophy by causing re-localization of FoxO proteins into the cytoplasm. Finally we found out that along with the quantity of the acetylated residues their position is important as well. In particular K262 seems to be a key residue for the nuclear export. In conclusion, we can assert that our findings shed light on the complex regulation of FoxO transcription factors, explaining how acetylation negatively modulates FoxO activity.La perdita di massa muscolare è una condizione debilitante che aggrava il quadro clinico di diverse patologie sistemiche e per la quale al momento non esiste alcuna terapia efficace che ne blocchi l’insorgenza dei sintomi. L’identificazione della famiglia dei fattori di trascrizione FoxO come responsabile dell’espressione delle ubiquitina-ligasi, Atrogin-1 e MuRF1, e della perdita di massa muscolare potrebbe far supporre di aver trovato un buon bersaglio per lo sviluppo di farmaci atti a bloccare la perdita di massa del muscolo scheletrico agendo proprio su FoxO, inibendone l'attività. Tuttavia questa idea potrebbe portare ad alcuni problemi, infatti lo sviluppo di un inibitore di FoxO potrebbe, da una parte, frenare la perdita di proteine muscolari, ma dall’altra potrebbe favorire l’insorgenza di tumori, di malattie autoimmuni e di altre patologie. Questo dualismo è dovuto al controllo che FoxO3 ha su molti aspetti della biologia cellulare come l’apoptosi, il ciclo cellulare, la gluconeogenesi, la sensibilità all’insulina e controlla questi processi biologici in maniera sia cellulo-specifica che tessuto-specifica. Il nostro approccio, per essere efficace, dovrebbe quindi essere basato sull’inibizione specifica dell’interazione di FoxO3 con i promotori dei geni dell’atrofia nel muscolo scheletrico. Tuttavia questo modello implica una conoscenza dettagliata della regolazione di FoxO3 all’interno del nucleo della fibra muscolare e della sua interazione con i promotori dei geni dell’atrofia. Per raggiungere questo scopo ci siamo addentrati nello studio dei meccanismi di modificazione post-traduzionale che modulano negativamente l’attività del fattore trascrizionale FoxO3: fosforilazione, acetilazione e ubiquitinazione. Quando è accesa la via di segnale PI3K/AKT, FoxO3 è normalmente fosforilato e inattivo, venendo trattenuto nel citoplasma. Quando, durante l'atrofia, questa via è repressa, FoxO3 può traslocare nel nucleo dove attiva la trascrizione dei geni bersaglio (Sandri et al., 2004; Stitt et al., 2004). La prima parte del mio dottorato si è incentrata sullo studio di un meccanismo in grado di regolare negativamente l'attività di FoxO3 quando questo si trova all'interno del nucleo, dove è normalmente attivo: l'acetilazione. Dati in letteratura hanno dimostrato mediante analisi di spettrometria di massa che in seguito a stress ossidativo si ha acetilazione di particolari lisine di FoxO3, condizione presente durante le atrofie (Brunet 2004, Greer and Brunet 2005). Per capire il ruolo dell’acetilazione abbiamo deciso di mutare le lisine acetilabili in arginine, residui non acetilabili che mantengono la carica positiva permettendo il legame al DNA, o in glutamine, residui privi di carica che permettono di mimare un’acetilazione costitutiva. Abbiamo testato l'attività trascrizionale dei vari mutanti mediante saggi di luciferasi, utilizzando come "reporter" un costrutto in cui il gene delle luciferasi è fuso ad un promotore composto da sei ripetizioni seriali della sequenza nucleotidica riconosciuta da FoxO. I risultati ottenuti con i mutanti hanno confermato che l’acetilazione modula la capacità di FoxO3 di legarsi ad un promotore. La diminuzione dei residui acetilabili induce un aumento dell’attività trascrizionale in maniera pressoché lineare, si è infatti osservato un aumento dell’attività trascrizionale di una volta e mezza quando si mutavano tre siti ed un incremento di tre volte quando si mutavano sei lisine. In contrapposizione i mutanti che mimavano l’acetilazione causavano una netta diminuzione delle capacità trascrizionali di FoxO3. Il dato conferma che la regione che regola il legame al DNA e l’import nucleare è sensibile a cambiamenti della carica elettrostatica causata dall’acetilazione. Tuttavia questi dati sulle capacità trascrizionali di FoxO3 e dei mutanti di coordinare un programma complesso come quello dell’atrofia muscolare sono stati solo parzialmente confermati dagli esperimenti in vivo. Infatti, mentre i mutanti che mimano l’acetilazione hanno causato una riduzione dell’attività atrofizzante di FoxO, i costrutti che bloccavano l’acetilazione non hanno esacerbato l’atrofia indotta da FoxO. Una possibile spiegazione per cui il blocco dell’acetilazione non causa una maggiore perdita di proteine sta nel fatto che la cinetica di degradazione delle proteine è, probabilmente, già al massimo delle sue potenzialità. FoxO3 è capace di indurre una elevata espressione delle ubiquitina-ligasi E3 Atrogin-1 e MuRF-1, la cui attività è regolata dalla presenza di molecole quali l’ubiquitina, i substrati e l’ATP. Di conseguenza un aumento della trascrizione di questi geni potrebbe non corrispondere ad un incremento della cinetica di reazione se non aumentano anche i fattori necessari per l’attività dell’enzima E3. Viceversa, una riduzione dell’espressione delle ubiquitina-ligasi comporta una diminuzione della degradazione proteica che si manifesta con un minor grado di atrofia. Un altro fattore che dobbiamo tener presente e che potrebbe avere un peso nell’interpretazione dei risultati è che acetilazione ed ubiquitinazione convergono, potenzialmente, sugli stessi residui di lisina. Quindi la mutazione dei residui acetilabili di lisina in forme non più acetilabili potrebbe avere influenze sul processo di ubiquitinazione. Nello specifico è possibile che la mono-ubiquitinazione partecipi in quei residui come meccanismo di controllo dell’attività di FoxO in senso positivo, ad esempio stabilizzando la proteina. La mutazione delle lisine che potrebbero venir modificate con la mono-ubiquitinazione priverebbe questi mutanti di un controllo positivo, spiegando i risultati visti per i mutanti lisina-arginina. Effettuando questi esperimenti ci siamo accorti che i mutanti in cui tutti e sei i siti erano mutati in glutamina, che mimavano quindi lo stato di iperacetilazione, tendevano a localizzarsi nel citoplasma delle fibre trasfettate, facendoci supporre che questa modificazione andasse ad influire anche sulla traslocazione della proteina oltre che sull’attività trascrizionale. Inoltre abbiamo notato che la quantità di fibre trasfettate con questo mutante era notevolmente inferiore rispetto a quanto visto per gli altri mutanti. Questa osservazione ci ha fatto supporre che la localizzazione citoplasmatica di FoxO3 fosse un prerequisito per una successiva degradazione. Effettuando esperimenti a tempi inferiori e con l’utilizzo di inibitori del proteasoma abbiamo verificato la veridicità di questa ipotesi. Infine abbiamo analizzato se questi fenomeni si verificassero anche nella forma endogena di FoxO3, utilizzando la denervazione come modello di atrofia muscolare. Abbiamo eseguito degli esperimenti di immunoprecipitazione per analizzare come questi eventi di modificazione si evolvessero nel tempo e quello che abbiamo potuto vedere è che l’aumento dei livelli di acetilazione e di ubiquitinazione di FoxO3 correlava con la diminuzione della quantità di proteina, spiegando in maniera esaustiva i meccanismi che portano alla fine dell’attività di questa proteina. In conclusione questo lavoro di tesi fornisce un quadro completo sulle modificazioni post-traduzionali che regolano il fattore di trascrizione FoxO3 durante tutto il processo di atrofia muscolare. Questi dati forniscono una solida base per lo studio di nuovi farmaci capaci di agire in maniera mirata sulla funzione di FoxO3, limitandone i possibili effett

Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI deficient muscles.

Autophagy is a catabolic process that provides the degradation of altered/damaged organelles through the fusion between autophagosomes and lysosomes. Proper regulation of the autophagic flux is fundamental for the homeostasis of skeletal muscles in physiological conditions and in response to stress. Defective as well as excessive autophagy is detrimental for muscle health and has a pathogenic role in several forms of muscle diseases. Recently, we found that defective activation of the autophagic machinery plays a key role in the pathogenesis of muscular dystrophies linked to collagen VI. Impairment of the autophagic flux in collagen VI null (Col6a1\u2013/\u2013) mice causes accumulation of dysfunctional mitochondria and altered sarcoplasmic reticulum, leading to apoptosis and degeneration of muscle fibers. Here we show that physical exercise activates autophagy in skeletal muscles. Notably, physical training exacerbated the dystrophic phenotype of Col6a1\u2013/\u2013 mice, where autophagy flux is compromised. Autophagy was not induced in Col6a1\u2013/\u2013 muscles after either acute or prolonged exercise, and this led to a marked increase of muscle wasting and apoptosis. These findings indicate that proper activation of autophagy is important for muscle homeostasis during physical activity

Haptoglobin is required to prevent oxidative stress and muscle atrophy.

BACKGROUND: Oxidative stress (OS) plays a major role on tissue function. Several catabolic or stress conditions exacerbate OS, inducing organ deterioration. Haptoglobin (Hp) is a circulating acute phase protein, produced by liver and adipose tissue, and has an important anti-oxidant function. Hp is induced in pro-oxidative conditions such as systemic inflammation or obesity. The role of systemic factors that modulate oxidative stress inside muscle cells is still poorly investigated. RESULTS: We used Hp knockout mice (Hp-/-) to determine the role of this protein and therefore, of systemic OS in maintenance of muscle mass and function. Absence of Hp caused muscle atrophy and weakness due to activation of an atrophy program. When animals were stressed by acute exercise or by high fat diet (HFD), OS, muscle atrophy and force drop were exacerbated in Hp-/-. Depending from the stress condition, autophagy-lysosome and ubiquitin-proteasome systems were differently induced. CONCLUSIONS: Hp is required to prevent OS and the activation of pathways leading to muscle atrophy and weakness in normal condition and upon metabolic challenges

Ruxolitinib Rapidly Reduces Acute Respiratory Distress Syndrome in COVID-19 Disease. Analysis of Data Collection From RESPIRE Protocol

Background: The Coronavirus disease (COVID-19) pandemic is causing millions of infections and hundreds of thousands of deaths worldwide. Cumulative clinical and laboratory evidence suggest that a subset of patients with severe COVID-19 may develop a cytokine storm syndrome during the course of the disease, with severe respiratory impairment requiring ventilatory support. One field of research nowadays is to identify and treat viral-induced hyperinflammation with drugs used in other clinical conditions characterized by an hyperinflammation status. These drugs might help to reduce COVID19 mortality. Methods: Ruxolitinib, a JAK1 and JAK2 inhibitor, has been successfully used to treat severe immune-mediated diseases, such as graft vs. host disease and Hemophagocytic lymphohistiocytosis. We used ruxolitinib in 18 patients with clinically progressive COVID-19 related acute respiratory distress syndrome, with a primary endpoint to rapidly reduce the degree of respiratory impairment and as a secondary endpoint to rapidly restore the PaO2/FiO2 ratio, as an evaluation of clinical status, and monitoring of drug related Adverse Events. Parameters of inflammation responses and organ functions were assessed and monitored. The treatment plan was ruxolitinib 20 mg bid for the first 48 h and subsequent two-step de-escalation at 10 mg bid and 5 mg bid for a maximum of 14 days of treatment. Results: Our data collection shows a rapid clinical response with no evolution from non-invasive ventilation to mechanical ventilation in 16/18 patients and no response in two patients (overall response rate-ORR 89%). Already after 48 h of ruxolitinib treatment 16/18 patients showed evident clinical improvement, and after 7 days of treatment 11/18 patients showed fully recovered respiratory function (pO2 > 98% in spontaneous breathing), 4/18 patients had minimal oxygen requirement (2-4 L/m), 1/18 patient showed stable disease, and 2/18 patient showed progressive disease. After 14 days, 16/18 patients showed complete recovery of respiratory function (ORR 89%). Compliance to ruxolitinib planned treatment was 100% and no serious adverse event was recorded. In our case series of 18 critically ill patients with COVID-19 and ARDS, administration of ruxolitinib resulted in a clinical improvement that concurred to modify the standard course of disease. Ruxolitinib can be a therapeutic option for patients with respiratory insufficiency in COVID-19 related ARDS. RESPIRE Study (Ruxolitinib for the treatment of acute rESPIratory distREss syndrome, ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04361903)

Differential expression of perilipin 2 and 5 in human skeletal muscle during aging and their association with atrophy-related genes.

Sarcopenia, the progressive loss of muscle mass and strength, is a phenomenon characterizing human aging whose etiology is still not clear. While there is increasing evidence for the influence of inter-muscular adipose tissue infiltration in the development of sarcopenia, much less is known about a possible role for intra-muscular triglycerides (IMTG). IMTG accumulate in form of lipid droplets decorated by proteins such as Perilipins (Plins). In skeletal muscle the most abundant are Plin2 and Plin5. In this study we compared the expression of these two Plins in Vastus lateralis muscle samples of subjects of different age, both healthy donors (HD) and patients with limited lower limb mobility (LLMI). These latter are characterized by a condition of chronic physical inactivity. Plin2 expression resulted higher in old age for both HD and LLMI patients, while Plin5 slightly decreased only in LLMI patients. Moreover, in these patients, only Plin2 was associated with the decrease of muscle strength and the expression of factors related to muscle atrophy (MuRF1, Atrogin and p53). An increase in Plin2 and a concomitant decrease of Plin5 was also observed when we considered animal model of disuse-induced muscle atrophy. As a whole, these data indicate that Plin2 and Plin5 have a different expression pattern during muscle aging and inactivity, and only Plin2 appears to be associated with functional alterations of the muscle

The effect of obesity on protein carbonylation, antioxidant response and mitochondrial function in the absence of Haptoglobin.

<p>Each panel shows WT (white bars) and Hp^-/- (black bars) skeletal muscle under regular Chow Food Diet Feeding (the same as <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0100745#pone-0100745-g001" target="_blank">figures 1</a>, <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0100745#pone-0100745-g002" target="_blank">2</a> and <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0100745#pone-0100745-g003" target="_blank">3</a>, referred to as “CFD”, n = 6–8) and in the obesity condition following 12 weeks of High Fat Diet (referred to as “HFD”, n = 6). A) Oxyblot reveals an obesity dependent increase in carbonylated proteins in the <i>EDL</i> and <i>Soleus</i> muscle of Hp^-/- mice. B) mRNA analysis for anti-oxidant response (names of genes as indicated) in <i>Tibialis anterior</i> muscle. C) mRNA analysis for mitochondrial biogenesis (names of genes as indicated) in the skeletal muscle: obesity dependent down regulation of <i>PGC1α</i> in HFD Hp^-/- mice, and <i>Tfam</i> upregulation in HFD WT animals. D) Mitochondrial response to oligomycin in single myofibers isolated from <i>flexor digitorum brevis</i> (FDB) skeletal muscles of WT and Hp^-/- mice. Where indicated, 6 µM oligomycin (arrow) or 4 µM of the protonophore carbonylcyanide-<i>p</i>-trifluoromethoxyphenyl hydrazone (FCCP) (arrowhead) were added. Traces represent tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) fluorescence as the mean of all the fibers of a group (n≥12). Fibers are considered as depolarized when they lose more than 10% of initial value of TMRM fluorescence after oligomycin addition. mRNA analysis and histological assessment are performed on <i>Tibialis anterior</i> skeletal muscle. Data are expressed as mean ± SEM. *P<0.05; **P<0.01; §P<0.05; §§P<0.01; §§§P<0.001.</p