Caracterização de uma proteína de união ao RNA da família RRM em Trypanosoma Cruzi e identificação dos MRNAs associados

Orientador : Prof. Dr. Bruno DallagiovannaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 25/03/2013Bibliografia: fls.85-94Resumo: Além da importância médica como causador da doença de Chagas, o protozoário Trypanosoma cruzi é considerado um organismo modelo para o estudo de mecanismos pós-transcricionais na regulação da expressão gênica em eucariotos. Estes mecanismos são mediados por proteínas de união ao RNA (RBPs) e elementos regulatórios presentes nas regiões não traduzidas (UTRs) dos mRNAs, ambos associando-se em complexos ribonucleoproteína (RNPs). Nestes RNPs, mRNAs relacionados funcionalmente e RBPs se associam de modo combinatorial, definindo redes regulatórias conhecidas por "regulons" de RNA. A caracterização das proteínas presentes nos diferentes RNPs e seus respectivos alvos pode contribuir para a compreensão dos mecanismos pós-transcricionais em eucariotos. A ribonômica consiste na purificação de RNPs ou RBPs isoladas com seus transcritos associados, seguindo o isolamento dos mRNAs e hibridização em microarranjo para identificação. Neste trabalho foram selecionadas diversas RBPs com o domínio RRM (RNA Recognition Motif) expressas em formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi e que apresentem algum grau de regulação durante a diferenciação. Uma das proteínas, denominada TcRBP40, foi caracterizada funcionalmente neste trabalho. Esta foi sintetizada fusionada a uma etiqueta de histidinas em sua forma solúvel, para utilizar em ensaios de purificação por afinidade de RNAs das formas epimastigotas. O gene codificante da proteína em estudo também foi clonado em vetor que contém sequências para etiquetas protéicas úteis para o ensaio de purificação sequencial por afinidade. Esta construção foi transfectada em T. cruzi e a proteína purificada para extração dos mRNAs associados. Os mRNAs alvos dos dois ensaios foram hibridados em microarranjo de T. cruzi e analisados. Cerca de 70% constituem proteínas hipotéticas, e metade delas contém uma sequência de inserção em membrana. O elemento de reconhecimento da TcRBP40 foi investigado por EMSA. Uma região rica em As e Gs foi apontada como candidata. O perfil de expressão dos alvos no ciclo de vida mostrou que a grande maioria está aumentada em metacíclicos, enquanto que estudos do perfil de expressão da proteína mostraram diminuição da sua expressão nesta fase. Um ensaio de superexpressão da TcRBP40 em T. cruzi mostrou que a expressão dos alvos foi diminuída. Estes dois resultados sugerem uma função de desestabilização dos mRNAs associados. A proteína mostrou localização celular na região dos reservossomos do parasita. Esta é a primeira evidência experimental de proteínas de regulação de mensageiros presente nesta estrutura. Futuras análises permitirão caracterizar o mecanismo de regulação dos mRNAs e determinar a relevância da proteína no processo de diferenciação celular.Abstract: Beyond the medical interest on Chagas disease, Trypanosoma cruzi can be considered as a model organism for studying the posttranscriptional mechanisms that regulate gene expression in eukaryotes. These mechanisms are mediated and facilitated by RNA binding proteins (RBPs) and regulatory elements present in the untranslated regions (UTR) of the mRNAs. In a combinatorial way, the UTRs associate in functionally related ribonucleoprotein complexes (RNPs) to define regulatory networks known as RNA regulons. Characterizing the proteins present in the different RNPs and their target mRNAs may contribute to the comprehension of posttranscriptional mechanisms in eukaryotes. The ribonomic approach consists in the purification of RNPs or RBPs, followed by isolation of the associated mRNAs and microarray hybridization to define their identity. Our interest was on the RBP protein family containing the RNA Recognition Motif (RRM). We have selected several proteins that are expressed in the epimastigote forms of T. cruzi and show some degree of regulation during differentiation. We characterized the function of one of these proteins, the TcRBP40. His-tagged and TAP-tagged recombinant TcRBP40 was used in pull-down assays with total RNA from epimastigote forms. The recovered RNAs were amplified and analyzed by the T. cruzi oligonucleotide microarray. 70% of the identified mRNAs correspond to hypothetical proteins, and half of these had a signal for trasmembrane localization. The TcRBP40 recognition element was investigated through EMSA and the results point to an A- and G-rich region as the strongest candidate. The expression profile of the TcRBP40 targets indicates that they are all more abundant in the metacyclic life stage of the trypanosome. On other hand, the corresponding protein expression decreases in the same life stage. The TcRBP40 over expression resulted in a decrease of its targets. These results suggest an mRNA destabilization function by the TcRBP40. In addition, we also found the protein localized to the parasite reservosomes. This is the first experimental evidence of a protein that controls transcript abundance localized to this organelle. Further analyses will help fully characterize the mechanism of target regulation by the protein and determine the relevance of the protein on cell differentiation process

Caracterização de uma proteína de união ao RNA da família RRM em Trypanosoma Cruzi e identificação dos MRNAs associados

Orientador : Prof. Dr. Bruno DallagiovannaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 25/03/2013Bibliografia: fls.85-94Resumo: Além da importância médica como causador da doença de Chagas, o protozoário Trypanosoma cruzi é considerado um organismo modelo para o estudo de mecanismos pós-transcricionais na regulação da expressão gênica em eucariotos. Estes mecanismos são mediados por proteínas de união ao RNA (RBPs) e elementos regulatórios presentes nas regiões não traduzidas (UTRs) dos mRNAs, ambos associando-se em complexos ribonucleoproteína (RNPs). Nestes RNPs, mRNAs relacionados funcionalmente e RBPs se associam de modo combinatorial, definindo redes regulatórias conhecidas por "regulons" de RNA. A caracterização das proteínas presentes nos diferentes RNPs e seus respectivos alvos pode contribuir para a compreensão dos mecanismos pós-transcricionais em eucariotos. A ribonômica consiste na purificação de RNPs ou RBPs isoladas com seus transcritos associados, seguindo o isolamento dos mRNAs e hibridização em microarranjo para identificação. Neste trabalho foram selecionadas diversas RBPs com o domínio RRM (RNA Recognition Motif) expressas em formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi e que apresentem algum grau de regulação durante a diferenciação. Uma das proteínas, denominada TcRBP40, foi caracterizada funcionalmente neste trabalho. Esta foi sintetizada fusionada a uma etiqueta de histidinas em sua forma solúvel, para utilizar em ensaios de purificação por afinidade de RNAs das formas epimastigotas. O gene codificante da proteína em estudo também foi clonado em vetor que contém sequências para etiquetas protéicas úteis para o ensaio de purificação sequencial por afinidade. Esta construção foi transfectada em T. cruzi e a proteína purificada para extração dos mRNAs associados. Os mRNAs alvos dos dois ensaios foram hibridados em microarranjo de T. cruzi e analisados. Cerca de 70% constituem proteínas hipotéticas, e metade delas contém uma sequência de inserção em membrana. O elemento de reconhecimento da TcRBP40 foi investigado por EMSA. Uma região rica em As e Gs foi apontada como candidata. O perfil de expressão dos alvos no ciclo de vida mostrou que a grande maioria está aumentada em metacíclicos, enquanto que estudos do perfil de expressão da proteína mostraram diminuição da sua expressão nesta fase. Um ensaio de superexpressão da TcRBP40 em T. cruzi mostrou que a expressão dos alvos foi diminuída. Estes dois resultados sugerem uma função de desestabilização dos mRNAs associados. A proteína mostrou localização celular na região dos reservossomos do parasita. Esta é a primeira evidência experimental de proteínas de regulação de mensageiros presente nesta estrutura. Futuras análises permitirão caracterizar o mecanismo de regulação dos mRNAs e determinar a relevância da proteína no processo de diferenciação celular.Abstract: Beyond the medical interest on Chagas disease, Trypanosoma cruzi can be considered as a model organism for studying the posttranscriptional mechanisms that regulate gene expression in eukaryotes. These mechanisms are mediated and facilitated by RNA binding proteins (RBPs) and regulatory elements present in the untranslated regions (UTR) of the mRNAs. In a combinatorial way, the UTRs associate in functionally related ribonucleoprotein complexes (RNPs) to define regulatory networks known as RNA regulons. Characterizing the proteins present in the different RNPs and their target mRNAs may contribute to the comprehension of posttranscriptional mechanisms in eukaryotes. The ribonomic approach consists in the purification of RNPs or RBPs, followed by isolation of the associated mRNAs and microarray hybridization to define their identity. Our interest was on the RBP protein family containing the RNA Recognition Motif (RRM). We have selected several proteins that are expressed in the epimastigote forms of T. cruzi and show some degree of regulation during differentiation. We characterized the function of one of these proteins, the TcRBP40. His-tagged and TAP-tagged recombinant TcRBP40 was used in pull-down assays with total RNA from epimastigote forms. The recovered RNAs were amplified and analyzed by the T. cruzi oligonucleotide microarray. 70% of the identified mRNAs correspond to hypothetical proteins, and half of these had a signal for trasmembrane localization. The TcRBP40 recognition element was investigated through EMSA and the results point to an A- and G-rich region as the strongest candidate. The expression profile of the TcRBP40 targets indicates that they are all more abundant in the metacyclic life stage of the trypanosome. On other hand, the corresponding protein expression decreases in the same life stage. The TcRBP40 over expression resulted in a decrease of its targets. These results suggest an mRNA destabilization function by the TcRBP40. In addition, we also found the protein localized to the parasite reservosomes. This is the first experimental evidence of a protein that controls transcript abundance localized to this organelle. Further analyses will help fully characterize the mechanism of target regulation by the protein and determine the relevance of the protein on cell differentiation process

Análise filogenética e funcional das proteínas RBP7 e RBP40 em tripanossomatídeos

Orientador : Prof. Dr. Bruno DallagiovannaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/07/2014Inclui referências : f. 105-111Resumo: Os organismos estão constantemente em modificação. Seja em resposta a pressões do ambiente, seja por eventos estocásticos, as modificações podem ser momentâneas ou hereditárias. Modificações momentâneas são desempenhadas pela regulação da expressão gênica, enquanto as hereditárias são os eventos evolutivos. A junção destas duas respostas biológicas, a evolução das redes regulatórias da expressão gênica, ainda é uma questão em aberto na biologia. O parasita unicelular Trypanosoma cruzi, além de sua importância médica, constitui um organismo modelo para o estudo da regulação pós-transcricional da expressão gênica. Devido à sua ramificação precoce na árvore filogenética dos seres vivos, é também um modelo no estudo da biologia evolutiva. Uma de suas RBPs (proteína de união ao RNA), a proteína regulatória TcRBP40, foi caracterizada em um estudo anterior. No atual trabalho foi determinada a sua localização celular: os reservossomos do parasita, estrutura anteriormente conhecida como de armazenamento nutricional. A presença desta proteína regulatória nesta organela, juntamente com outras proposições recentes, indica funções adicionais dos reservossomos para a biologia do parasita. Uma análise filogenética mostrou que o gene codificante da TcRBP40 originou-se junto com o gene da TcRBP7 a partir da duplicação de um gene ancestral, assim como seus homólogos em T. brucei (TbRBP7A e B). De acordo com a filogenia, os eventos de duplicação destes genes nestes organismos ocorreram de modo independente, após a divergência das duas espécies, e que estão acumulando mutações de modo assimétrico. As estruturas das proteínas foram preditas por modelagem por homologia e comparadas, sendo identificados os sítios divergentes. As proteínas TcRBP7 e TbRBP7A conservam maior semelhança, enquanto TcRBP40 é a mais divergente do grupo. Os alvos das proteínas TcRBP7 e TcRBP40 foram determinados por ribonômica in vivo e sequenciamento de nova geração, mostrando que menos de 10% são alvos em comum entre elas. Isso indica que estas RBPs de T. cruzi, apesar de conservarem 72% de identidade, regulam redes distintas de genes e portanto desempenham funções biológicas diferentes. Futuras análises poderão responder como as novas redes regulatórias surgem nos organismos, e como evoluem para desempenhar papéis distintos na biologia dos organismos.Abstract: Organisms are constantly changing. In response to environmental pressures, or for stochastic reasons, those changes might be transient or inheritable. Transient changes are played by gene expression regulation, while inheritable ones consists on evolutionary events. The joining of both biological responses, which accounts for the gene expression regulatory networks evolution, is still an open question in biology. The unicellular parasite Trypanosoma cruzi, beyond its medical importance, is a model organism for posttranscriptional gene expression regulation studies. Due to its early-branching in the tree of life phylogeny, it is also a model for the study of evolution biology. One of its RBPs (RNA binding proteins), the regulatory protein TcRBP40, was characterized on a previous study. In this current work, its cellular location was determined: the parasite's reservosomes, previously known as a nutritional storage compartment. The presence of this regulatory protein inside this organelle, altogether with other recent propositions, indicates additional regulatory functions performed by reservosomes in the parasite's biology. A phylogenetic analysis revealed that TcRBP40 coding gene arose with TcRBP7 from the duplication of an ancestral gene, just as its T. brucei homologs (TbRBP7A and B). According to this phylogeny, the duplication events of these genes on those organisms occurred independently, after species divergency, and they are asymmetrically accumulating mutations. Protein structures were predicted by homology modeling and compared, identifying the divergent sites. The proteins TcRBP7 and TbRBP7A share the higher similarity, and TcRBP40 is the most divergent in this group. TcRBP7 and TcRBP40 targets were determined by in vivo ribonomics and next generation sequencing, showing less than 10% of overlap. This indicates that these T. cruzi RBPs, even though they conserve 72% identity, they regulate distinct gene networks and so play different biological roles. Other analysis may answer how the new regulatory gene networks arise in organisms, and how they evolve to play distinct roles in organisms' biology

In cellulo and in vivo assays for compound testing against Trypanosoma cruzi

Summary: Here, we describe a combined in cellulo and in vivo approach to identify compounds with higher potential for efficient inhibition of Trypanosoma cruzi. Phase I of in cellulo assays is designed to exclude inactive or toxic compounds, while phase II is designed for accurate IC50, CC50, and selective index (SI) determination. Compounds showing high SI are tested using in vivo infection models in parallel with benznidazole to assess their efficacy relative to a reference drug used for Chagas disease treatment.For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Marek et al. (2021).1 : Publisher’s note: Undertaking any experimental protocol requires adherence to local institutional guidelines for laboratory safety and ethics

Trypanosoma brucei RRP44: a versatile enzyme for processing structured and non-structured RNA substrates

International audienceRrp44/Dis3 is a conserved eukaryotic ribonuclease that acts on processing and degradation of nearly all types of RNA. It contains an endo- (PIN) and an exonucleolytic (RNB) domain and, its depletion in model organisms supports its essential function for cell viability. In Trypanosoma brucei, depletion of Rrp44 (TbRRP44) blocks maturation of ribosomal RNA, leading to disruption of ribosome synthesis and inhibition of cell proliferation. We have determined the crystal structure of the exoribonucleolytic module of TbRRP44 in an active conformation, revealing novel details of the catalytic mechanism of the RNB domain. For the first time, the position of the second magnesium involved in the two-metal-ion mechanism was determined for a member of the RNase II family. In vitro, TbRRP44 acts preferentially on non-structured uridine-rich RNA substrates. However, we demonstrated for the first time that both TbRRP44 and its homologue from Saccharomyces cerevisiae can also degrade structured substrates without 3’-end overhang, suggesting that Rrp44/Dis3 ribonucleases may be involved in degradation of a wider panel of RNA than has been assumed. Interestingly, deletion of TbRRP44 PIN domain impairs RNA binding to different extents, depending on the type of substrate