Καθορισμός του βέλτιστου τρόπου χορήγησης τροποποιημένων κρυπτικών πεπτιδίων της τελομεράσης (hTERT) σαν ανοσοθεραπεία σε ασθενείς με νεοπλασματική νόσο

Establishment of the optimal administration schedule for cryptic telomerase peptides (hTERT) as cancer immunotherapyIntroductionIn most human cancers, activation of telomerase appears to be a hallmark, associated with unlimited cell proliferation of tumour cells (Blasco, 2005; Shay & Wright, 2000).By ensuring maintenance of telomeres’ length above a critically short point, telomerase prevents the induction of cellular senescence or apoptosis for the cancer cells, therefore allowing for tumour progression. Telomerase, and more specifically its catalytic subunit hTERT, is found to be overactive in 85–90% of cancers, marking it as a popular target for anticancer therapies.TERT572-based vaccine- RationaleNearly all human tumour-associated antigens, including telomerase, derive from non-altered self-proteins, thereby are subjects of the immune tolerance. The HLA-I molecules can bind both dominant and cryptic peptides. The dominant peptides have a strong affinity for HLA-I alleles, are abundant on the cell surface, and are strongly immunogenic, whereas cryptic peptides are not as abundant on the cell surface, have weak HLA-I affinity, demonstrating weak immunogenicity or complete lack of immunogenicity. In contrast to dominant peptides, cryptic peptides are poorly expressed, thereby do not induce immune tolerance escaping massive clonal deletion. These characteristics of the cryptic peptides make them a favourable target, candidate for the development of a specific, peptide antitumor vaccine therapy. Moreover, the use of tumour non- specific antigens may be a better choice for anticancer vaccines since they are not dependant on adjuvants or the efficacy of delivery (Mavroudis et al., 2006; Menez-Jamet & Kosmatopoulos, 2009; Ruden & Puri, 2013).In our studies with the peptide-based vaccine (hTERT- based), we tried to overcome the tolerance-related blunting of T cell responses, by using cryptic (low affinity for HLA) peptides for the induction of an antitumor immune response. However, binding of wild type cryptic peptide antigens to HLA is usually unstable, with weak immunogenicity, and therefore challenging in regard to immune response possibly hampering T cell priming and activation. More recent research has focused on the development of optimized cryptic peptides with higher affinity binding to HLA.Based on this approach, our peptide-based anticancer vaccine, known as Vx-001 (Vaxon Biotech, Paris, France), consists of a low affinity cryptic peptide hTERT572 (RLFFYRKSV) and its optimized version, the hTERT572Y(1) (YLFFYRKSV), which has the first amino-acid residue replaced with a modified tyrosine (Y1) residue. This sequence aims to enhance the peptide’s affinity for HLA-I molecules and potentially can circumvent the self-tolerance issue. The TERT572Y peptide has been found to induce tumour immunity in HLA-A*0201 transgenic mice but luckily not autoimmunity (Gross et al., 2004). In addition, Vx-001 leads to enhanced immunogenicity of the cryptic peptide when presented by HLA-A*0201 molecules (the most frequently expressed allele, present in 40–45% of population) without altering antigen’s specificity (Mavroudis et al., 2006).In the current study, our primary goal was to establish the optimal vaccination protocol, for administration of the two TERT peptides (the native TERT572 and its optimized variant TERT572Y) regarding its ability to elicit the best immunologic response in respect to ex vivo reactivity of peptide-induced CTLs. Following establishment of the best vaccination schedule, the study aims to 1) assess the safety profile of the TERT vaccine, 2) correlate the immunologic outcome with the clinical outcome of the patients who received the TERT vaccine.Patients and MethodsPatientsIn the first phase of the study for the establishment of the optimal vaccination schedule, 48 patients were enrolled, while overall 142 patients with various types of advanced solid tumours and previous exposure to standard treatment were enrolled in the telomerase peptide (hTERT) vaccination protocol. The inclusion criteria included HLA-A*0201 haplotype, histologically proven malignancy, advanced disease (Stage IV or locally advanced/unresectable), older than 18 years, performance status by WHO of 0-2, at least one chemotherapy regimen prior to vaccination, adequate bone marrow/liver/renal function.PeptidesThe 9-mer cryptic native TERT572 (RLFFYRKSV) peptide and its optimized variant TERT572Y (YLFFYRKSV), were synthesized initially by Epytop (Nimes, France) and later by Pepscan (Lelystad, The Netherlands). Each peptide was prepared as a lyophilized powder (2 mg/vial) for reconstitution with 0.5 ml sterile water.Blood samples for ImmunomonitoringBefore each vaccination, 100ml peripheral blood in EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid) was collected from each patient through a peripheral venous puncture. The time points of blood collection were set at baseline, prior to 3rd and 6th vaccination and before each boost administration of the peptide. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by Ficoll-Hypaque (Sigma, UK) density centrifugation and cryo-preserved in freezing medium at - 80oC until their future use the immune-assessment assays.Vaccination protocol (Schemes A, B)All HLA A*0201 patients (no= 48) received two subcutaneous (s.c) injections with 2mg of the optimized TERT572Y peptide followed by four s.c injections with 2mg of either the native TERT572 peptide (scheme A) or the optimized TERT572Y (scheme B), depending on the randomization schedule, every three weeks until disease progression as indicated in each result section. Patients who completed the 6-vaccination schedule and experienced disease stabilization or objective clinical response, received boost vaccinations (re-vaccinations) with 2mg native TERT572 peptide every three months until disease progression.MethodsThe evaluation of interferon-γ enzyme linked-TERT-specific T cell immunologic response was performed mainly by the Enzyme-linked immunosorbent (ELIspot) assay. To ensure high accuracy, 3 independent experiments were performed for each test.ResultsOur results revealed that vaccination with the optimized TERT572Y followed by the native TERT572 peptides can induce strong T cell responses, with higher avidity and frequencies of T cell responses, after the completion of 6-vaccinations. T cell responses after the sixth vaccination were detected more frequently (44% vs. 17%), and with higher number of peptide-specific reactive T cells (60 T cells/2 × 105 peripheral blood mononuclear cell vs. 10 T cells/ 2 × 105 peripheral blood mononuclear cell, p = 0.04), and higher avidity in the patients who received 4 more vaccinations with the TERT572 peptide compared with patients who received only TERT572Y vaccinations. These results demonstrate that the best vaccination schedule involves first the administration of the optimized TERT572Y followed by the native TERT572 peptide in patients who are candidates for cancer immunotherapy.The association between immunologic response and clinical outcome (PFS and OS) was evaluated. Overall, there was no significant difference in either PFS or OS for patients who developed an immunologic response at any time during vaccination between the 2 schemes. However, in the subgroup analysis of patients who enrolled in scheme A vaccination, those who developed an immune response had a significantly longer PFS compared with those without an immune response (13.5 vs. 3.5mo; log-rank test p=0.01).In the next phase of the study, the best vaccination schedule was used in clinical trials with different tumour types and a cohort of NSCLC patients. Our studies confirmed a favourable toxicity profile of the TERT vaccine, without serious acute or late adverse events and without evidence of autoimmune reactions even after its administration for up to 2 years. Acute adverse events (AAE) were observed in 29 (52%) patients, and they were mild (grade 1). The most common AAE was grade 1 local skin reaction (n = 15; 27%). In our study, those patients who developed an immunologic response at any time during vaccination had a significantly higher PFS (5.2 months; range, 0.9–51.8) compared with those who failed to develop any response following vaccination (2.2 months, range, 1.4–6.5; p = 0.0001. Multivariate analysis demonstrated that the development of immunological response was an independent factor associated with better PFS (HR = 3.35, 95% CI 1.7–6.7; p = 0.001), while there was a trend for worse OS in patients who did not develop immunologic response during the vaccination (HR = 2.0, 95% CI 1.0–4.0; P = 0.057).Εισαγωγή. Η ενεργοποίηση της τελομεράσης συνδέεται με τον απεριόριστο κυτταρικό πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (Blasco, 2005; Shay & Wright, 2000). Διασφαλίζοντας τη διατήρηση του μήκους των τελομερών πάνω από ένα κρίσιμο σημείο, η τελομεράση εμποδίζει την κυτταρική γήρανση ή απόπτωση των καρκινικών κύτταρων, επιτρέποντας έτσι την εξέλιξη του όγκου. Η τελομεράση, και ειδικότερα η καταλυτική υπομονάδα της, hTERT υπερεκφράζεται σε 85-90% των καρκίνων, γεγονός που την καθιστά δημοφιλή στόχο για αντικαρκινικές θεραπείες.Σχεδόν όλα τα καρκινικά αντιγόνα συμπεριλαμβανομένης της τελομεράσης, προέρχονται από αυτό-αντιγόνα, και επομένως είναι υποκείμενα ανοσολογικής ανοχής. Τα μόρια HLA-I μπορούν να δεσμεύσουν τόσο κυρίαρχα όσο και κρυπτικά πεπτίδια. Τα κυρίαρχα πεπτίδια έχουν ισχυρή συγγένεια με τα μόρια HLA-I, βρίσκονται συχνά στην κυτταρική επιφάνεια και είναι ανοσογονικά, ενώ τα κρυπτικά πεπτίδια δεν είναι τόσο συχνά, έχουν ασθενή συγγένεια με τα μόρια HLA-I, επιδεικνύοντας ασθενή ανοσογονικότητα ή πλήρη έλλειψη ανοσογονικότητας. Σε αντίθεση με τα κυρίαρχα πεπτίδια, τα κρυπτικά πεπτίδια εκφράζονται ελάχιστα και δεν προκαλούν ανοσολογική ανοχή. Αυτά τα χαρακτηριστικά των κρυπτικών πεπτιδίων τα καθιστούν ιδανικό στόχο για την ανοσοθεραπεία με πεπτιδικά εμβόλια. Επιπλέον, η χρήση μη- ειδικών αντιγόνων όγκων αποτελεί καλύτερη επιλογή για αντικαρκινικά εμβόλια, αφού η αποτελεσματικότητα τους δεν εξαρτάται από την χρήση ανοσορυθμιστικών μορίων (adjuvants) (Mavroudis et al., 2006; Menez-Jamet & Kosmatopoulos, 2009; Ruden & Puri, 2013).Στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να υπερνικήσουμε την ανοσολογική ανοχή χρησιμοποιώντας κρυπτικά πεπτίδια. Εντούτοις, η σύνδεση των κρυπτικών πεπτιδίων με τα μόρια HLA είναι συνήθως ασταθής, με ασθενή ανοσογονικότητα παρεμποδίζοντας την ανταπόκριση και ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Πιο πρόσφατες έρευνες επικεντρώνονται στην ανάπτυξη βελτιστοποιημένων κρυπτικών πεπτιδίων με υψηλότερη συγγένεια σύνδεσης με τα μόρια HLA.Με βάση αυτή την προσέγγιση, το εμβόλιο μας, γνωστό ως Vx-001 (Vaxon Biotech,), αποτελείται από ένα κρυπτικό πεπτίδιο hTERT572 (RLFFYRKSV) χαμηλής χημικής συγγένειας και τη βελτιστοποιημένη του έκδοση, το hTERT572Y (YLFFYRKSV), στο οποίο έχει γίνει αντικατάσταση ενός αμινοξέος Αυτή η αλληλουχία στοχεύει στην ενίσχυση της συγγένειας του πεπτιδίου με τα μόρια HLA-I και μπορεί να παρακάμψει το ζήτημα της ανοχής. Έτσι αυξάνεται η ανοσογονικότητα του κρυπτικού πεπτιδίου όταν παρουσιάζεται από τα μόρια HLA-A* 0201 (το πιο συχνά εκφραζόμενο αλληλόμορφο, που υπάρχει στο 40-45% του πληθυσμού) χωρίς αλλοίωση της ειδικότητας του αντιγόνου (Mavroudis et al., 2006) .Στόχος της μελέτηςΟ σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο προσδιορισμός του αποτελεσματικότερου τρόπου χορήγησης ενός βελτιστοποιημένου και ενός φυσικού πεπτιδίου που προέρχονται από ένα κρυπτικό επίτοπο της τελομεράσης με βάση την ανοσιακή απάντηση που αυτά επάγουν όταν χορηγηθούν σε ασθενείς με ανθεκτικά νεοπλάσματα.Πρωταρχικός στόχος της μελέτης είναι να διευκρινισθεί ο βέλτιστος συνδυασμός ενεργητικής ανοσοποίησης με το τροποποιημένο πεπτίδιο TERT572Y και το φυσικό πεπτίδιο TERT572 με βάση την ισχύ της χημικής συγγένειας (avidity) και την συχνότητα (frequency) της διέγερσης των ειδικών για το φυσικό πεπτίδιο TERT572 Τ λεμφοκυττάρων ( CTL) που ενεργοποιούνται στους ασθενείς που έχουν εμβολιασθεί. Στη συνέχεια, ο βέλτιστος τρόπος χορήγησης χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό ασθενών με διάφορα νεοπλάσματα. Οι δευτερογενείς στόχοι της παρούσας μελέτης είναι α) η μελέτη της τοξικότητας του εμβολίου της τελομεράσης, β) η συσχέτιση της in vivo ανοσολογικής ανταπόκρισης με την κλινική έκβαση των ασθενών. Ασθενείς. Στην πρώτη φάση της μελέτης, για τον καθορισμό του πρωτοκόλλου εμβολιασμού, εντάχθηκαν 48 ασθενείς, ενώ συνολικά εντάχθηκαν 142 ασθενείς με διάφορα νεοπλάσματα. Όλοι πληρούσαν τα βασικά κριτήρια ένταξης, ήταν μεταξύ 18 και 80 ετών και σε γενική κατάσταση που δηλωνόταν βάσει του ECOG performance status (PS) 0 – 2. Παρουσίαζαν όλοι έκφραση του HLA-A*0201. Είχαν επάρκεια αιμοποιητικού συστήματος ,φυσιολογική ηπατική και νεφρική λειτουργία και είχαν λάβει αποτελεσματικές θεραπείες εκλογής για το νεόπλασμά τους πριν την ένταξη στη μελέτη αυτή.Κατά τη διάρκεια της μελέτης και τέσσερις εβδομάδες πριν και μετά από αυτή δεν έλαβαν καμία άλλη αντινεοπλασματική θεραπεία για τη νόσο τους είτε συστηματική (χημειοθεραπεία) είτε τοπική (ακτινοβολία). Επίσης κατά την ίδια περίοδο δεν ελάμβαναν κορτικοστεροειδή ή άλλη ανοσοκατασταλτική αγωγή. Πεπτίδια. Και τα δύο πεπτίδια, το 9-μερές κρυπτικό φυσικό πεπτίδιο TERT572 (RLFFYRKSV) και το τροποποιημένο TERT572Y (YLFFYRKSV), παράχθηκαν από την εταιρία Epytop ( Nimes, France) και αργότερα από την Pepscan (Lelystad, The Netherlands). Η ποιότητά τους πιστοποιήθηκε με ειδικές μεθόδους και δεν αλλοιώθηκε ακόμα και μετά από δύο έτη βαθιάς κατάψυξης στους -80°C.Δείγματα ασθενών. Η ανάλυση έγινε σε περιφερικό αίμα το οποίο ελήφθη από τους ασθενείς πριν την πρώτη χορήγηση, μετά την δεύτερη και την έκτη χορήγηση του πεπτιδίου, καθώς και πριν από κάθε αναμνηστική χορήγηση. Τα μονοπύρινα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMCs) απομονώθηκαν με φικόλη (Ficoll-Hypaque ,Sigma, UK), φυγοκεντρήθηκαν και διατηρήθηκαν στην κατάψυξη (Gibco/Invitrogen, Paisley, Scotland, UK) στους -80οC μέχρι τη μέτρηση της ανοσολογικής απάντησης.Πρωτόκολλα εμβολιασμών (Σχήμα Α,Β). Ολοι οι ασθενείς (no= 48) έλαβαν αρχικά δύο υποδόριες (s.c) ενέσεις του τροποποιημένου κρυπτικού πεπτιδίου TERT572Y στη δόση των 2mg κάθε τρεις εβδομάδες. Στη συνέχεια τυχαιοποιήθηκαν (1:1 ) σε δύο ομάδες. Η μία ομάδα έλαβε 2mg του φυσικού πεπτιδίου TERT572, (σχήμα Α) ενώ η άλλη ομάδα συνέχισε τον εμβολιασμό με 2mg του τροποποιημένου πεπτιδίου TERT572Y (σχήμα Β). Ολοι οι ασθενείς έλαβαν έξι χορηγήσεις εκτός εάν παρουσίαζαν υποτροπή της νόσου, οπότε αποκλείονταν από τη μελέτη. Οι ασθενείς που δεν παρουσίασαν εξέλιξη της νόσου συνέχισαν με τις αναμνηστικές χορηγήσεις με το φυσικό πεπτίδιο TERT572 και τις αιμοληψίες ανά 3 μήνες. Μέθοδοι. Η μέτρηση της ανοσολογικής ανταπόκρισης στη χορήγηση του φυσικού πεπτιδίου TERT572 έγινε με την μέτρηση της IFN-γ κυρίως με την μέθοδο Enzyme-Linked Immunosorbent Spot (ELISpot). Για την εξασφάλιση της μεγαλύτερης δυνατής αξιοπιστίας των αποτελεσμάτων, η μέθοδος επαναλήφθηκε τρεις φορές για κάθε ομάδα ασθενών σε ανεξάρτητες χρονικές στιγμές. Αποτελέσματα. Ο βέλτιστος τρόπος εμβολιασμού αποδείχτηκε η διαδοχική χορήγηση του τροποποιημένου πεπτιδίου ΤΕΡΤ572Υ ακολουθούμενου από το φυσικό πεπτίδιο ΤΕΡΤ572. Συγκεκριμένα, μετά την έκτη χορήγηση στους ασθενείς που έλαβαν 4 χορηγήσεις με το φυσικό πεπτίδιο TERT572, σε σχέση με τους ασθενείς που έλαβαν μόνο το τροποποιημένο πεπτίδιο TERT572Y, παρατηρήθηκαν τα εξής:Α) συχνότερα ανοσολογική ανταπόκριση (44% vs 17%) και με υψηλότερη χημική συγγένεια , και Β) υψηλότερη συγκέντρωση Τ κυττάρων ειδικών για το αντιγόνο (60 T cells/2x105 PBMC vs 10 T cells/2x105 PBMC, p=0.04). Επιπροσθέτως αναλύθηκαν τα κλινικά δεδομένα των ασθενών που εντάχθηκαν στην πρώτη φάση της μελέτης, ώστε να συσχετισθεί η ανοσολογική ανταπόκριση με την κλινική πορεία των ασθενών. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές τόσο στην συνολική επιβίωση (overall survival) όσο και στο διάστημα ελεύθερο υποτροπής (progression free survival) ανάμεσα στους ασθενείς που ανέπτυξαν ανοσολογική απάντηση στις ομάδες Α και Β. Ωστόσο όσοι ασθενείς από την ομάδα Α εμφάνισαν ανοσολογική απάντηση είχαν σημαντικά μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής σε σχέση με όσους δεν ανέπτυξαν ανοσολογική απάντηση ((13.5 vs. 3.5 mo; log-rank test p=0.01). Στην επόμενη φάση της μελέτης ο βέλτιστος τρόπος εμβολιασμού χρησιμοποιήθηκε σε ασθενείς με διάφορα νεοπλάσματα και σε πληθυσμό με Μη-μικροκυττταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Το εμβόλιο αποδείχτηκε καλά ανεκτό με ήπιο προφίλ τοξικότητας, κυρίως δερματική αντίδραση στο σημείο της χορήγησης. Δεν παρατηρήθηκαν ανεπιθύμητες ενέργειες αυτοάνοσου τύπου κατά την διάρκεια της χορήγησης ή κατά την διάρκεια παρακολούθησης των ασθενών μετά το τέλος της μελέτης και για τουλάχιστον 2 έτη.Οι ασθενείς που ανέπτυξαν ανοσιακή απάντηση είχαν καλύτερη κλινική έκβαση με μεγαλύτερο διάστημα μέχρι την υπότροπή (PFS 5.2 months; range, 0.9–51.8), σε σχέση με όσους δεν ανέπτυξαν ( PFS 2.2 months, range, 1.4–6.5; P = 0.0001). Σε πολύπαραγοντική ανάλυση η ανάπτυξη ανοσιακής απάντησης στους ασθενείς που εμβολιάσθηκαν αποδείχτηκε ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για καλύτερο PFS (HR = 3.35, 95% CI 1.7–6.7; P = 0.001), ενώ όσοι απέτυχαν να αναπτύξουν ανοσιακή απάντηση στον εμβολιασμό παρουσίασαν τάση για χειρότερη επιβίωση (HR = 2.0, 95% CI 1.0–4.0; P = 0.057)

KRAS genotypic changes of circulating tumor cells during treatment of patients with metastatic colorectal cancer.

Circulating tumor cells (CTCs) could represent a non-invasive source of cancer cells used for longitudinal monitoring of the tumoral mutation status throughout the course of the disease. The aims of the present study were to investigate the detection of KRAS mutations in CTCs from patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) and to compare their mutation status during treatment or disease progression with that of the corresponding primary tumors.Identification of the seven most common KRAS mutations on codons 12 and 13 was performed by Peptide Nucleic Acid (PNA)-based qPCR method. The sensitivity of the assay was determined after isolation of KRAS mutant cancer cells spiked into healthy donors' blood, using the CellSearch Epithelial Cell kit. Consistent detection of KRAS mutations was achieved in samples containing at least 10 tumor cells/7.5 ml of blood.The clinical utility of the assay was assessed in 48 blood samples drawn from 31 patients with mCRC. All patients had PIK3CA and BRAF wild type primary tumors and 14 KRAS mutant tumors. CTCs were detected in 65% of specimens obtained from 74% of patients. KRAS mutation analysis in CTC-enriched specimens showed that 45% and 16.7% of patients with mutant and wild type primary tumors, respectively, had detectable mutations in their CTCs. Assessing KRAS mutations in serial blood samples revealed that individual patient's CTCs exhibited different mutational status of KRAS during treatment.The current findings support the rationale for using the CTCs as a dynamic source of tumor cells which, by re-evaluating their KRAS mutation status, could predict, perhaps more accurately, the response of mCRC patients to targeted therapy

Cross reactivity pattern of <i>KRAS</i> mutation detection assay.

<p>Cross reactivity pattern of <i>KRAS</i> mutation detection assay.</p

<i>KRAS</i> mutation status in primary tumor and corresponding CTC-enriched samples in mCRC patients.

a<p>CTC count using CellSearch system depicted as number of cells per 7.5 mL whole blood. Abbreviations: wt; wild type, NVD; no variant detected.</p

Representative plots showing the <i>KRAS</i> mutation status of CTC-enriched specimens.

<p>Graphs showed the ΔCt values (<i>y</i> axis) versus the CTC-enriched specimens (<i>x</i> axis) of mCRC patients (n = 31), healthy individuals (n = 16) and model samples spiked with 100 and 10 cells from cell lines (LS174T, SW403, KYSE410 and HCT116) harboring hotspot <i>KRAS</i> mutations c.35G>A; p.G12D (A), c.35G>T; p.G12V (B), c.38G>A; p.G13D (C) and c.34G>T; p.G12C (D). Cutoff threshold is represented by dot-line; specimens with ΔCt below the threshold are considered mutant; ΔCt = Ct_{mut probe (+PNA)} – Ct_{wt probe (-PNA)}; NVD, no variant detected.</p

Pathological and clinical characteristics of mCRC patients.

<p>Pathological and clinical characteristics of mCRC patients.</p