Investigation of the structure and dynamics of RNA systems by molecular dynamics simulations

Das genetische Material der Zellen besteht aus Molekülketten der Desoxyribonukleinsäure (DNA), die ein Träger der Erbinformation ist. In normalen Körperzellen wird die Erbinformation der DNA in eine andere Molekülkette, die sogenannte Ribonukleinsäure (RNA), übersetzt. Die RNA reguliert die Bildung von neuem Protein in der Zelle. Dass die RNA nicht bloß ein „Stempel“ ist, der die Informationen der DNA weitervermittelt, darin sind sich die Experten heute einig. RNA-Moleküle können Informationen speichern, katalytische Aktivitäten entfalten, sich perfekt tarnen, und sie regulieren auch als Produkt ihre eigene Synthese. Manche Viren enthalten ebenfalls RNA (oder DNA) und können so den Produktionsapparat der Zelle täuschen. Erkenntnisse über die Wechselwirkung dieser RNA mit natürlichen und synthetischen Liganden können zur Suche nach potentiellen Wirkstoffen beitragen. Nukleinsäuren sind lineare Biopolymere von grundlegenden Untereinheiten, die Nukleotide genannt werden und aus Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Urazil (U), und Thymin (T) zusammengesetzt sind. Sie sind jedoch in der Lage sich zu falten und so eine Doppel-Helixstruktur auszubilden. Diese besteht größtenteils aus den bekannten "Watson-Crick-Basenpaaren" (G-C und A-U oder A-T), die zur Stabilität der Struktur beitragen, sowie aus den weniger stabilen G-U-Paaren. Durch die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Sekundärstrukturelementen entstehen Tertiärstrukturelemente, deren Struktur und Dynamik oft nur schwer experimentell zu bestimmen sind. Fortschritte in der RNA-Strukturanalyse wurden durch Röntgenkristallographie und Kernresonanzspektroskopie (NMR) möglich. Durch die Röntgenkristallographie wurden viele RNA-Eigenschaften festgestellt. Allerdings besteht keine Kristallstruktur für alle mögliche Einzelnfaser-RNA-Haarnadeln, weil diese immer dazu neigen, in eine linearen doppelte Faserform zu kristallisieren, die geringe biologische Bedeutung hat. Außerdem wurde mit Hilfe der NMR-Spektroskopie das dynamische Verhalten von RNA, z.B. Entfaltungsprozesse bei ansteigender Temperatur, beobachtet. Jedoch erlauben diese experimentellen Daten oft keine direkte mikroskopische Beschreibung der molekularen Prozesse. Molekulardynamik (MD)-Simulationen von biologischen Systemen ermöglichen es hingegen, diese Prozesse in atomischem Detail zu untersuchen. Die MD-Simulation beschreibt ein molekulares System auf atomarer Ebene mit Hilfe der klassischen Mechanik. Kräfte werden von empirischen Potentialen abgeleitet. Sie liefern zeitabhängige Trajektorien, die sich aus den Newton'schen Bewegungsgleichungen ergeben. Durch verbesserte Computerleistung, bessere Kraftfelder, und neu entwickelte genauere Methoden stimmen heutzutage MD-Simulationen von RNA mit experimentellen Daten immer besser überein. In meiner Doktorarbeit wurden MD-Simulationen durchgeführt um die Dynamik, die Struktur und insbesondere die Stabilität von RNA-Hairpins theoretisch zu beschreiben, um so ein erweitertes Verständnis für die dynamischen Vorgänge zu erhalten. Auch der SFB 579 der Universität Frankfurt beschäftigt sich mit RNA-Systemen. Erforscht wird unter anderem der D-Loop des Coxsackievirus B3 (CVB3), der Virenmyocarditis verursacht. Die Interpretation dieser experimentellen Daten wird durch MD-Simulation möglich. In dieser Arbeit wurden das GROMACS Software-Paket und das AMBER Kraftfeld verwendet, um das strukturelle, dynamische und thermische Verhalten der RNA-Hairpins mit Hilfe von MD-Simulationen auf atomarer Ebene zu untersuchen. Betrachtet wurden die 14-mer RNA-Hairpins, uCACGg und cUUCGg. Die verfügbaren NMR-Strukturen zeigen, dass das uCACGg-Tetraloop auffallend ähnlich in der gesamten Geometrie und den Wasserstoffbindungen zu der experimentellen Struktur des cUUCGg-Tetraloop ist, obwohl die schließende Basenpaarsequenz der beiden Tetraloops unterschiedlich sind. Trotz beachtlicher struktureller Ähnlichkeit unterscheiden sich allerdings die uCACGg und cUUCGg Tetraloops in Funktionalität und Thermostabilität. Zunächst orientiert sich unser erstes Bemühen an der Frage nach einem guten Modell für RNA-Hairpins und Simulationsbedingungen, um die zu untersuchenden RNA-Hairpins in Wasser möglichst realitätsnah zu simulieren. Erstens werden drei Versionen des biomolekularen AMBER-Kraftfelds geprüft, indem man die 60 ns Simulationen des 14-mer uCACGg-Hairpins durchführt. Die simulierten strukturellen Eigenschaften und Atomfluktuationen zeigen hohe Ähnlichkeiten in den drei Kraftfeldern. Darüber hinaus stimmen die von MD-Simulationen berechneten Atomkernabstände mit den experimentellen NMR-Daten gut überein. Die gute Übereinstimmung zwischen den Simulationen und den strukturellen NMR Daten belegt die Fähigkeit des AMBER-Kraftfelds zur Beschreibung der strukturellen Eigenschaft von kleinen RNA-Hairpins. Anschließend werden die Einflüsse der Methoden, welche die langreichweitigen, elektrostatischen Wechselwirkungen beschreiben, auf die strukturellen Eigenschaften untersucht. Insbesondere werden die Ergebnisse der Reaktionfeld-Methode mit denen der Particle Mesh Ewald (PME)-Methode verglichen. Es zeigt sich, dass die PME-Methode die elektrostatischen Wechselwirkungen am besten beschreibt, auch wenn die Simulationen der beiden Methoden Ähnlichkeit in der Struktur-Stabilität und der Atomfluktuation bei niedriger Natriumkonzentration aufweisen. Drittens wird der Kationseffekt auf die RNA-Stabilität untersucht. Betrachtet wurden zwei unterschiedliche Kationen (ein- und zweiwertig) und verschiedene Konzentrationen. Die Simulationen weisen darauf hin, dass sich die Metallionen in der Affinität zum RNA-Hairpin unterscheiden, wenn Na+ und/oder Mg2+ als Gegenionen verwendet werden. Weiterhin wird gezeigt, dass sich die bevorzugten Positionen der Na+-Ionen in der großen Furche (major groove) des RNA-Hairpins befinden. Insbesondere die Anlagerungsort der Na+-Ionen liegen in der Nähe des schließenden Basenpaar U5-G10. Im Vergleich zu Na+-Ionen lagern sich Mg2+-Ionen sowohl an die RNA-Basen U3, A4-U11, und die Phosphat-Gruppe, als auch an das schließenden Basenpaar U5-G10 an. Bestätigt werden die Modelle und Simulationsbedingungen durch den Vergleich von Parametern, die sowohl experimentell als auch durch Simulationen ermittelt werden können. Ferner erlauben MD-Simulationen Einblick in das System, indem sie detallierte Konformations- und andere Verteilungen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse der Loopsequenz und des schließenden Basenpaares auf die Verteilung der Konformationen, der internen Bewegungen, und auf die Thermostabilität von zwei RNA-Hairpins mit Hilfe dieser Modelle untersucht. Zunächst wurden die strukturellen Eigenschaften bei Raumtemperatur ausgewertet. Die starken strukturellen Ähnlichkeiten und die gute Übereinstimmung mit NMR-Daten bestätigen die Hypothese, dass die zwei Tetraloops zur gleichen “erweiterten” RNA-Familie gehören. Diese zwei Hairpins haben ähnliche Lösemittelzugängliche Oberflächen (solvent accessible surface), wobei deren Lösemittel zugänglichen funktionellen Gruppen unterschiedlich sind. Weiterhin weist das uCACGg-Hairpin eine stärkere Tendenz auf Wasserstoffe abzugeben als das cUUCGg-Hairpin, was in den unterschiedlichen Bindungsaffinitäten zwischen diesen Hairpins und der viralen Protease begründet liegt. Darüber hinaus wurde der Faltungs- und Entfaltungsprozess mit Hilfe der Replica-Exchange-Molekulardynamik-Simulationen untersucht. Diese Untersuchung zielt auf das bessere Verständnis der unterschiedlichen Thermostabilität der Hairpins, indem sie die möglichen Zwischenprodukte im atomaren Detail liefern. Sowohl experimentell als auch von den MD-Simulationen ergibt sich eine Differenz in den Schmelztemperaturen der beiden Hairpins von ungefähr 20 K. Allerdings sind die von MD beobachteten Schmelztemperaturen 20 % höher als die von Experiment zu ansehende Wert. Die Ergebnisse machen deutlich, dass die Schmelztemperaturdifferenz nicht auf die Unterschiede in der Sequenz, in der Struktur, oder in der Dynamik der Loops zurückführen sind, sondern auf die Unterschiede der Basenpaaren in den Stämmen. Weiterhin wird gezeigt, dass sich das uCACGg-Hairpin einerseits kooperativ entfaltet, und die Entfaltung des cCACGg-Hairpins anderseits weniger kooperativ stattfindet. Um die schnelle interne Dynamik der uCACGg- und cUUCGg-Hairpins zu untersuchen, erlauben die Simulationen von 50 ns eine akurate Beschreibung der schnellen internen Bewegung der RNA-Hairpin, obwohl der den Hairpins zugängliche Konformationsraum nicht vollständig abgedeckt wird. Die NMR-Relaxationsparameter, die mit Hilfe der MD-Simulationen zurückgerechnet wurden, bestätigen das Modell und die Simulationsbedingungen der MD-Simulationen. Im Hinblick auf die Übereinstimmung kann man den besten Ansatz zur Berechnung der NMR-Ordnungsparameter bestimmen. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Ansätze angewandt, nämlich das Fitting von 100 ps auf modellfreiem Ansatz nach Lipari-Szabo, equilibrium average, und das Gaussian Axial Fluctuation (GAF)-Modell. Die zwei letzteren können nur qualitativ mit den experimentellen Daten übereinstimmen. Die NMR-Ordnungsparameter können mit Hilfe des Modells von Lipari-Szabo richtig ermittelt werden, wenn sich die interne Bewegung in kleineren Zeitskalen als zur Gesamtbewegung vollzieht. Vorausetzung für die Berechnung dieses Modells ist aber, dass das Fitting der internen Korrelationsfunktionen nur auf den ersten Teil von 100 ps der Korrelationsfunktionen eingesetzt wird. Die berechneten Ordnungsparameter deuten auf ein unterschiedliches Verhalten der beiden Hairpins besonders im Loop-Bereich hin. Die konformationelle Umordnung, die beim UUCG-Loop beobachtet wurde, tritt beim CACG-Loop nicht ein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es durch den Einsatz von MD Simulationen ermöglicht wird, die strukturellen und dynamischen Eigenschaften der RNA-Systeme auf atomarer Ebene zu untersuchen. Als Schlussfolgerung zeigt diese Doktorarbeit, dass sich die Studie der konformationell Dynamik der RNA-Systeme durch die Kombination aus MD-Simulation und NMR-Spektroskopie sowie der Leistungsfähigkeit der MD-Simulationen, die die interne Bewegungen deutlich beschreiben können, untersuchen lässt

RAPID SOLVENT-FREE MICROWAVE ASSISTED SYNTHESIS OF SOME N’-BENZYLIDENE SALICYLIC ACID HYDRAZIDES

Condensation reaction has been carried out for the synthesis of some N'-benzylidene-2-hydroxybenzohydrazides using microwave assisted solvent-free method. The structures of all the products obtained in the present work are supported by spectral and analytical data (UV, IR, and 1H-NMR spectroscopy). The desired hydrazides are in 62-80% yields under microwave irradiation. The reaction was completed in 8-10 min

Studi Perbandingan Sifat Struktur dan Dinamika Bentuk Apo dan Holo dari FKBP12 dan Mip dengan Menggunakan Simulasi Dinamika Molekul

Interaksi protein danligan pada sisi pengikatan merupakan topik penting dalam desain obat dan proses prediksi fungsi protein. FKBP12 dan Mip(macrophage infectivity potentiator)termasuk dalam keluarga protein FKBP dengan sisi pengikatan yang kemiripannya sangat tinggi. Oleh karena itu untuk mendapatkan ligan yang selektif tidaklah mudah. Tujuan penelitian ini untuk membandingkan sifat struktur dan dinamis dari FKBP12 dan Mip dalam bentuk holo (membentuk kompleks dengan suatu ligan) dan bentuk apo (tidak terikat dengan ligan) dengan menggunakan simulasi dinamika molekul selama 40 ns dengan penambahan energi potensial selama 10 ns. Penggantian ligan rapamycin dengan ligan yang lebih kecil, yaitu turunan asam pipecolat, menyebabkan perubahan strukturpada FKBP12 dibandingkan Mip terutama pada asam amino Q81/E54, V82/F55, I83/I56, W86/W59, Y109/Y82, P117/H87, dan I118/I90.Hal ini memberikan informasi untuk pengembangan ligan yang selektif

NMR and MD studies of the temperature-dependent dynamics of RNA YNMG-tetraloops

In a combined NMR/MD study, the temperature-dependent changes in the conformation of two members of the RNA YNMG-tetraloop motif (cUUCGg and uCACGg) have been investigated at temperatures of 298, 317 and 325 K. The two members have considerable different thermal stability and biological functions. In order to address these differences, the combined NMR/MD study was performed. The large temperature range represents a challenge for both, NMR relaxation analysis (consistent choice of effective bond length and CSA parameter) and all-atom MD simulation with explicit solvent (necessity to rescale the temperature). A convincing agreement of experiment and theory is found. Employing a principle component analysis of the MD trajectories, the conformational distribution of both hairpins at various temperatures is investigated. The ground state conformation and dynamics of the two tetraloops are indeed found to be very similar. Furthermore, both systems are initially destabilized by a loss of the stacking interactions between the first and the third nucleobase in the loop region. While the global fold is still preserved, this initiation of unfolding is already observed at 317 K for the uCACGg hairpin but at a significantly higher temperature for the cUUCGg hairpin

EFFECT OF THE ION TREATMENT ON AN RNA HAIRPIN: MOLECULAR DYNAMICS STUDY

Molecular dynamics has been employed to study the effect of ion treatment on the stability of 14-nucleotide RNA hairpin of Coxsackievirus B3. Three AMBER force fields were used: AMBER94, AMBER98, and AMBER99, which showed no significant structural difference of the hairpin. Thereafter, we applied two different long-range electrostatic treatments that were reaction field and PME methods, and calculated the distribution of ions around the hairpin. Although the structural stabilities of the MD simulations using both methods were similar in 0.14 M Na+, ion environment around the hairpin was notably different. In particular, structural stabilition of the hairpin with increasing ion concentration and with ion Mg2+ cannot be accommodated by simulations using reaction field method. Furthermore, the MD simulations using PME method suggested the strong similarity in structural and dynamical properties of the hairpin with 0.14 M Na+, 0.50 M Na+, 1,03 M Na+, and 0.08 M Mg2+ concentrations. However, the simulations revealed different ion occupations of Na+ and Mg2+

Effect of the ion treatment on an rna hairpin : molecular dynamics study

Molecular dynamics has been employed to study the effect of ion treatment on the stability of 14-nucleotide RNA hairpin of Coxsackievirus B3. Three AMBER force fields were used: AMBER94, AMBER98, and AMBER99, which showed no significant structural difference of the hairpin. Thereafter, we applied two different long-range electrostatic treatments that were reaction field and PME methods, and calculated the distribution of ions around the hairpin. Although the structural stabilities of the MD simulations using both methods were similar in 0.14 M Na+, ion environment around the hairpin was notably different. In particular, structural stabilition of the hairpin with increasing ion concentration and with ion Mg2+ cannot be accommodated by simulations using reaction field method. Furthermore, the MD simulations using PME method suggested the strong similarity in structural and dynamical properties of the hairpin with 0.14 M Na+, 0.50 M Na+, 1,03 M Na+, and 0.08 M Mg2+ concentrations. However, the simulations revealed different ion occupations of Na+ and Mg2+.Dinamika molekul telah digunakan untuk mempelajari pengaruh perlakuan ion pada stabilitas 14-nukleotida RNA jepit rambut dari Coxsackievirus B3. Tiga medan gaya AMBER digunakan: AMBER94, AMBER98, dan AMBER99, yang menunjukkan tidak ada perbedaan struktural yang signifikan dari jepit rambut tersebut. Setelah itu, diterapkan dua perlakuan yang berbeda untuk elektrostatik jarak-panjang menggunakan metode medan reaksi dan PME, dan dihitung distribusi ion di sekitar jepit rambut tersebut. Meskipun stabilitas struktur hasil simulasi MD menggunakan kedua metode adalah serupa pada 0,14 M Na+ , namun lingkungan ion di sekitar jepit rambut tersebut menunjukkan perbedaan. Secara khusus, stabilisasi struktur jepit rambut dengan peningkatan konsentrasi ion dan dengan ion Mg2+, tidak dapat diakomodasi oleh simulasi menggunakan metode medan reaksi. Simulasi MD menggunakan metode PME menunjukkan kesamaan yang kuat untuk sifat struktur dan sifat dinamis dari jepit rambut untuk konsentrasi 0,14 M Na+ , 0,50 M Na+ , 1,03 M Na+ , dan Mg2+ 0,08 M. Namun demikian, hasil simulasi mengungkapkan adanya sifat kerja yang berbeda untuk ion Na+ dan Mg2+

Studi Pendahuluan Penambatan Molekul Senyawa Kandungan Dari Cinnamomi Cortex terhadap Epitop Respiratory Syncytial Virus (RSV)

Motavizumab merupakan imunoglobulin (IgG1) antibodi monoklonal rekombinan. Antibodi monoklonal ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit yang disebabkan oleh respiratory syncytial virus (RSV). Antibodi ini mengikat protein RSV F yang berperan dalam perlekatan virus dan memediasi fusi. Ekstrak dari Cinnamomi Cortex diketahui dapat digunakan sebagai antivirus. Senyawa flavonoid salah satunya katekin memiliki potensi sebagai antivirus COVID-19. Salah satu senyawa dari ekatrak proantosianidin juga dikenal sebagai tanin terkondensasi yang memiliki aktivitas sebagai antivirus dengan menghambat infeksi SARS-CoV dan upregulasi. Dalam penelitian ini dilakukan studi penambatan molekul pada 14 senyawa yang terkandung dari Cinnamomi Cortex terhadap epitop RSV. Hasil penelitian ini menunjukkan senyawa yang afinitas pengikatan paling baik (ΔG), dan konstanta inhibisi (Ki) terdapat pada 4 senyawa yaitu pada senyawa (+)-epikatekin (ΔG -5,77 kkal/mol dan Ki 59,43 μM), β-kariofilen (ΔG -5,45 kkal/mol dan Ki 100,45 μM), (+)-katekin (ΔG -5,17 kkal/mol dan Ki 162,53 μM), dan (-)-katekin (ΔG -5,09 kkal/mol dan Ki 186,98 μM). Interaksi ikatan hidrogen pada residu asam amino THR108 dengan gugus hidroksil pada ketiga senyawa (+)-epikatekin, (+)-katekin, (-)-katekin. Interaksi ikatan hidrofobik pada residu asam amino PRO149 yang memiliki C alkil yang berikatan dengan C rangkap pada keempat senyawa (+)-epikatekin, beta-kariofilen, (+)-katekin, (-)-katekin

Mixture of sambiloto (Andrographis panniculata Nees.) and salam (Syzygium polyanthum (Wight.) Walp.) extract to improve GLUT4 and PPAR-gamma expression in hyperglicemic wistar rats

The increased prevalence of diabetes mellitus stimulates the ongoing study of molecular mechanisms of sambiloto and salam in relieving the disorder. The molecular study was done by treating hyperglicemia Wistar rats with a combination of sambiloto (AP) and salam (SP) extract. AFter 14 days of treatment, the rats were sacrificed and the liver organs were collected. The organs were stored in a solution of 10% buffered formalin to be blocked in paraffin afterwards. Subsequent molecular test was performed to identify GLUT4 and PPAR-gamma gene expression by immunohistochemistry method. This study showed that administration of a combination of sambiloto and salam extracts (6:1) in rats was able to increase the expresion level of GLUT4 which resembles the expression level of GLUT4 after insulin administration. It was also found that the expression level of PPAR-gamma was increased after rats were treated by combintion of AP and SP extracts (6:1). It showed that the increased expression of PPAR-gamma resembled the expression of PPAR-gamma after metformin stimulation. Interestingly, the administration of AP:SP extract (6:1) combination showed a level of GLUT4 expression that was not in line with PPAR-gamma expression

Mixture of sambiloto (Andrographis panniculata Nees.) and salam (Syzygium polyanthum (Wight.) Walp.) extract to improve GLUT4 and PPAR-gamma expression in hyperglicemic wistar rats

The increased prevalence of diabetes mellitus stimulates the ongoing study of molecular mechanisms of sambiloto and salam in relieving the disorder. The molecular study was done by treating hyperglicemia Wistar rats with a combination of sambiloto (AP) and salam (SP) extract. AFter 14 days of treatment, the rats were sacrificed and the liver organs were collected. The organs were stored in a solution of 10% buffered formalin to be blocked in paraffin afterwards. Subsequent molecular test was performed to identify GLUT4 and PPAR-gamma gene expression by immunohistochemistry method. This study showed that administration of a combination of sambiloto and salam extracts (6:1) in rats was able to increase the expresion level of GLUT4 which resembles the expression level of GLUT4 after insulin administration. It was also found that the expression level of PPAR-gamma was increased after rats were treated by combintion of AP and SP extracts (6:1). It showed that the increased expression of PPAR-gamma resembled the expression of PPAR-gamma after metformin stimulation. Interestingly, the administration of AP:SP extract (6:1) combination showed a level of GLUT4 expression that was not in line with PPAR-gamma expression

Antidiabetic Properties Of Andrographis Paniculata Nees And Eugenia Polyantha Wight Leaves In Wistar Rats By Oral Glucose Tolerance Test

Ethanol and water extract of Andrographis paniculata Nees, and ethanol extract of Eugenia polyantha Wight leaves were evaluated for their hypoglycemic effects in healthy albino Wistar rats by oral glucose tolerance test. Both ethanol extract of Euginia polyantha (200 mg/kg bw) and water extract of Andrographis paniculata (200 mg/kg bw) showed significant increase of blood glucose level at T30 and T60 (T30 = 30 minutes after glucose loading or 60 minutes after drugs administration, T60 = 60 minutes after glucose loading or 90 minutes after drugs administration). Meanwhile, ethanol extract of Andrographis paniculata (200 mg/kg bw) showed significant increased in blood glucose level up to T90. Therefore, water extract of Andrographis paniculata (200 mg/kg bb) was considered faster to lower blood glucose level than the ethanol extract at the same dose of administration. Furthermore, water extract of Andrographis paniculata and Euginia polyantha leaves could be selected for further research as they reduce the blood glucose level steadily and does not cause hypoglycemia such as in glibenclamide