Investigation of microbial communities capable of degrading micropollutants

In this PhD thesis, a detailed investigation of microbial communities capable of degrading pharmaceutical and antiseptic compounds, such as the non-steroidal anti-inflammatory drugs ibuprofen and diclofenac, as well as the widely used antimicrobial agent triclosan was performed for the first time. In particular, activated sludge was enriched in an immobilized cell bioreactor through the use of a synthetic wastewater containing high concentration of ibuprofen, diclofenac or triclosan in order to favor the biologically active constituents of the activated sludge that were capable of degrading such substrates.During the treatment of wastewater containing high concentration of ibuprofen, diclofenac or triclosan, the immobilized cell bioreactor was capable of reducing their concentration by 98.4 ± 0.3%, 97.63 ± 0.62% and 99.99 ± 0.01%, respectively. However, the pH of the recirculating wastewater dropped to acidic values, a fact that restricted nitrification. Illumina sequencing revealed an increase in the relative abundance of the clases Alphaproteobacteria and Gammaproteobacteria (from 29.1 to 80.8%) and a significant decrease in the respective abundance of the phyla Bacteroidetes, Planctomycetes and Verrucomicrobia (from 42.7% to 2.1%) when pure ibuprofen served as the sole carbon source of the influent wastewater compared to the one that contained commercial ibuprofen tablets. This alteration in the feeding conditions resulted in the prevalence of the genera Novosphingobium and Rhodanobacter (25.5 ± 10.8% and 25.2 ± 3.0% of the total reads, respectively), denoting the existence of a specialized bacterial community in the activated sludge that effectively catabolized ibuprofen. Moreover, when the immobilized cell bioreactor treated wastewater containing high concentration of pure ibuprofen, the predominant fungal population consisted of members of the genera Cladophialophora, Wickerhamiella, Exophiala and Rhinocladiella, which have been previously reported as effective degraders of recalcitrant compounds. This is actually the first report on a bioreactor system operating under continuous-flow conditions and being able to cope efficiently with the high ibuprofen concentration. Despite the fact that diclofenac has been included in the European list of priority hazardous substances, a limited number of research works has so far focused on diclofenac removal in wastewater treatment plants as well as on the microbial constituents of activated sludge involved in its degradation. The structure of activated sludge microbiota capable of degrading diclofenac was examined through the use of amplicon sequencing techniques. This specialized bacterial community consisted mainly of members of the species Granulicella pectinivorans and Rhodanobacter terrae, followed by strains of the species Castellaniella denitrificans, Parvibaculum lavamentivorans, Bordetella petrii, Bryocella elongata and Rhodopseudomonas palustris. The ability of these microorganisms to utilize a wide range of carbon sources as well as to grow under acidic conditions constituted the main parameters, which favored their dominance in the immobilized cell bioreactor. Moreover, investigation of fungal communities revealed the prevalence of Wickerhamiella strains, indicating their involvement in diclofenac degradation in activated sludge systems. The structure of activated sludge microbiota capable of degrading the antiseptic agent triclosan was also investigated for the first time. Apart from the members of the family Bradyrhizobiaceae, which their relative abundance was estimated to be 16.77 ± 6.44%, the bacterial community in the immobilized cell bioreactor treating triclosan consisted of a significant number of species, about 20 in total, with their relative abundance ranging between 6.99 ± 0.47% for Ferruginibacter spp. and 1.20 ± 0.04% for Rhodopila spp., thus identifying within the activated sludge a wide diversity of triclosan degraders.In addition, using culture-dependent techniques, thirteen bacterial strains able to utilize ibuprofen as the sole carbon and energy source were isolated. Based on phylogenetic analysis, the bacterial strains that were capable of degrading ibuprofen were phylogenetically associated with the genera Cupriavidus, Sphingobium, Sphingomonas, Caulobacter, Xanthobacter and Bosea. Apart from the strains that were placed in the genus Sphingomonas, this is the first report on members of the abovementioned genera possessing the ability to biodegrade ibuprofen. Moreover, strain SF-10 was the most effective ibuprofen degrader, reducing its concentration by 95.55 ± 1.78%. The maximum ibuprofen degradation rate of strain SF-10, which belonged to the genus Sphingobium, was recorded at temperature 28 °C and pH 6. In conclusion, activated sludge encompasses a low, but specialized bacterial and fungal community, capable of degrading various pharmaceuticals and personal care products, denoting thus the multifunctionality and versatility of activated sludge to cope with such micropollutants.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά λεπτομερής διερεύνηση των μικροβιακών κοινοτήτων που ήταν σε θέση να αποδομούν φαρμακευτικές και αντισηπτικές ενώσεις, όπως τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα, ιβουπροφαίνη και δικλοφαινάκη, καθώς και το ευρέως χρησιμοποιούμενο συστατικό προϊόντων ατομικής περιποίησης, την τρικλοσάνη. Ειδικότερα, σε βιοαντιδραστήρες ακινητοποιημένης βιομάζας εφαρμόστηκε διαδικασία εμπλουτισμού με τη χρήση υγρού αποβλήτου, το οποίο περιείχε ιδιαιτέρως υψηλή συγκέντρωση ιβουπροφαίνης, δικλοφαινάκης ή τρικλοσάνης, προκειμένου να ευνοηθούν εκείνοι οι πληθυσμοί μικροοργανισμών της ενεργού ιλύος που έχουν την ικανότητα να τις καταβολίζουν, αποκαλύπτοντας συνεπώς τα βιολογικά συστατικά της ιλύος που επιτελούν τη διάσπαση τέτοιων μικρορύπων. Κατά την επεξεργασία υγρού αποβλήτου υψηλής περιεκτικότητας σε ιβουπροφαίνη, δικλοφαινάκη ή τρικλοσάνη, διαπιστώθηκε η ικανότητα του βιοαντιδραστήρα ακινητοποιημένης βιομάζας να επιτυγχάνει την απομάκρυνση των ενώσεων αυτών σε ποσοστό 98,4 ± 0,3%, 97,63 ± 0,62% και 99,99 ± 0,01%, αντίστοιχα, καθώς και την τάση της εμπλουτισμένης/προσαρμοσμένης βιομάζας να οξυνίζει το ανακυκλοφορούμενο υγρό απόβλητο, γεγονός που προκάλεσε κατά την επεξεργασία τους την αναστολή της διεργασίας της νιτροποίησης. Η εφαρμογή τεχνικών Illumina αλληλούχισης αποκάλυψε την αύξηση στη σχετική αφθονία των βακτηρίων των φύλων Alphaproteobacteria και Gammaproteobacteria (από 29,1 σε 80,8%) και μια σημαντική μείωση της σχετικής αφθονίας των Bacteroidetes, Planctomycetes και Verrucomicrobia (από 42,7% σε 2,1%), όταν καθαρή ιβουπροφαίνη χρησιμοποιήθηκε ως μοναδική πηγή άνθρακα στο υγρό απόβλητο που εισερχόταν στον βιοαντιδραστήρα, σε σχέση με τη χρήση υγρού αποβλήτου που περιείχε εμπορικό σκεύασμα ιβουπροφαίνης. Αυτή η μεταβολή στις συνθήκες τροφοδοσίας είχε ως αποτέλεσμα την επικράτηση βακτηρίων των γενών Novosphingobium και Rhodanobacter (25,5 ± 10,8% και 25,2 ± 3,0% αντίστοιχα), αναδεικνύοντας την παρουσία εντός της ενεργού ιλύος μιας εξειδικευμένης βακτηριακής κοινότητας που μεταβόλιζε αποτελεσματικά την ιβουπροφαίνη. Ο πληθυσμός μυκήτων που επικράτησε κατά την τροφοδοσία του συστήματος ακινητοποιημένης βιομάζας με υγρό απόβλητο υψηλής περιεκτικότητας σε ιβουπροφαίνη αποτελούταν από στελέχη των γενών Cladophialophora, Wickerhamiella, Exophiala και Rhinocladiella, τα οποία παρουσιάζουν την ικανότητα να βιοδιασπούν δυσκόλως αποδομήσιμες αρωματικές ενώσεις. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά σε βιολογικό σύστημα συνεχούς ροής, το οποίο ήταν σε θέση να διασπά αποτελεσματικά την ιδιαιτέρως υψηλή συγκέντρωση ιβουπροφαίνης. Παρά το γεγονός ότι η δικλοφαινάκη έχει συμπεριληφθεί στον ευρωπαϊκό κατάλογο ουσιών προτεραιότητας (priority hazardous substances), οι έρευνες που εστιάζουν στη βιοαποδόμηση της είναι εξαιρετικά περιορισμένες, όπως και η διερεύνηση των μικροοργανισμών εκείνων που την επιτελούν. Μέσω της χρήσης τεχνικών μαζικής αλληλούχισης διερευνήθηκε η δομή των μικροβιακών κοινοτήτων της ενεργού ιλύος που ήταν ικανές να διασπούν τη δικλοφαινάκη. Η εξειδικευμένη αυτή βακτηριακή κοινότητα αποτελούνταν κυρίως από μέλη των ειδών Granulicella pectinivorans και Rhodanobacter terrae, καθώς και από μέλη των ειδών Castellaniella denitrificans, Parvibaculum lavamentivorans, Bordetella petrii, Bryocella elongata και Rhodopseudomonas palustris. Η δυνατότητα των μικροοργανισμών αυτών να χρησιμοποιούν ένα ευρύ φάσμα πηγών άνθρακα, μεταξύ αυτών και η ιβουπροφαίνη, καθώς και η ικανότητα τους να αναπτύσσονται υπό όξινες συνθήκες, αποτέλεσαν τις κύριες παραμέτρους που ευνόησαν την επικράτησή τους στον βιοαντιδραστήρα ακινητοποιημένης βιομάζας. Επιπλέον, κατά τη διερεύνηση των κοινοτήτων μυκήτων, η επικράτηση στελεχών του γένους Wickerhamiella υποδεικνύει την ενεργή συμμετοχή τους στη βιολογική αποδόμηση της δικλοφαινάκης στο εξεταζόμενο βιολογικό σύστημα.Διερευνήθηκε επίσης για πρώτη φορά η σύσταση της μικροβιακής κοινότητας της ενεργού ιλύος που ήταν σε θέση να αποδομεί την αντισηπτική ουσία τρικλοσάνη. Με εξαίρεση στελέχη της οικογένειας Bradyrhizobiaceae, όπου η σχετική αφθονία τους υπερέβαινε το 10%, ήτοι το 16,77 ± 6,44%, η κοινότητα των βακτηρίων στον βιοαντιδραστήρα ακινητοποιημένης βιομάζας αποτελούνταν από ένα σημαντικό αριθμό ειδών, περίπου 20, των οποίων η σχετική αφθονία κυμαινόταν μεταξύ 6,99 ± 0,47% (Ferruginibacter spp.) και 1,20 ± 0,04% (Rhodopila spp.), γεγονός που υποδεικνύει ότι εντός της ενεργού ιλύος ευρίσκεται πληθυσμός βακτηρίων με ευρεία ποικιλότητα που έχει την ικανότητα να βιοδιασπά την τρικλοσάνη.Τέλος, με τη χρήση καλλιεργητικών μεθόδων, απομονώθηκαν δεκατρία στελέχη βακτηρίων που χρησιμοποιούσαν την ιβουπροφαίνη ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας. Βάσει της φυλογενετικής ανάλυσης, τα στελέχη βακτηρίων που ήταν ικανά να την αποδομούν συσχετίζονταν φυλογενετικά με τα γένη Cupriavidus, Sphingobium, Sphingomonas, Caulobacter, Xanthobacter και Bosea. Με εξαίρεση τα στελέχη που τοποθετήθηκαν στο γένος Sphingomonas, είναι η πρώτη φορά που μέλη των παραπάνω γενών παρουσίασαν την ικανότητα να βιοδιασπούν την ιβουπροφαίνη. Επιπροσθέτως, το στέλεχος SF-10 ήταν το πλέον ικανό να βιοδιασπά την ιβουπροφαίνη, αφού μείωνε τη συγκέντρωση της κατά 95,55 ± 1,78%. Ο μέγιστος ρυθμός διάσπασης της ιβουπροφαίνης από το στέλεχος SF-10, που ανήκε στο γένος Sphingobium, καταγράφηκε σε θερμοκρασία 28 οC και pH 6. Συμπερασματικά, η ενεργός ιλύ περικλείει μια εξειδικευμένη ποικιλότητα μικροοργανισμών, τόσο βακτηρίων όσο και μυκήτων, που συμμετέχουν στη βιοδιάσπαση μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων και προϊόντων ατομικής περιποίησης, που ολοένα και περισσότερο συσσωρεύονται στο περιβάλλον

Biodegradation Potential and Diversity of Diclofenac-degrading Microbiota in an Immobilized Cell Biofilter

Despite that diclofenac has been embodied to the European watch list of priority substances of concern, studies on diclofenac biodegradation are limited and the diversity of diclofenac-degrading microbiota remains unknown. In this work, an immobilized cell biofilter was constructed and operated to evaluate its effectiveness to depurate high strength diclofenac wastewater and to identify the diclofenac-degrading community accommodated in activated sludge by employing high-throughput sequencing techniques. After a two-month adaptation period, biofilter removal efficiencies reached values as high as 97.63 ± 0.62%, whereas utilization of diclofenac in the immobilized cell biofilter led to a drastic pH decrease. Based on Illumina sequencing, the major bacterial taxa identified in the immobilized cell biofilter were members of the species Granulicella pectinivorans and Rhodanobacter terrae, followed by members of the species Castellaniella denitrificans, Parvibaculum lavamentivorans, Bordetella petrii, Bryocella elongata and Rhodopseudomonas palustris. The ability of such taxa to utilize a wide range of carbon sources and to effectively adapt under acidic conditions seemed to be the main parameters, which favored their prevalence in the immobilized cell biofilter. In addition, Wickerhamiella was the predominant fungal taxon in the immobilized cell biofilter, which appears to be actively involved in diclofenac degradation in activated sludge systems