Avaliação da atividade antitumoral do extrato bruto e supercrítico de Cordia verbenacea

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010O câncer está entre as causas mais freqüentes de morte no mundo. É considerado um importante problema de saúde pública em países desenvolvidos e em desenvolvimento, sendo a segunda causa de morte no Brasil e no mundo, superado somente pelas doenças do sistema cardiovascular. Apesar disto até o momento não existe uma terapia efetiva para o tratamento de todos os tipos de câncer além de que a maioria dos quimioterápicos em uso apresentam elevada toxicidade. Esforços vêm sendo dirigidos no sentido de desenvolver fármacos antitumorais tão ou mais eficazes do que os quimioterápicos já disponíveis, porém com menor toxicidade e potencial para desenvolver resistência terapêutica. Muitos dos medicamentos utilizados atualmente resultaram da purificação de produtos naturais, principalmente vegetais. Neste contexto, o presente projeto objetivou avaliar o potencial antitumoral de Cordia verbenacea planta medicinal brasileira, vulgarmente conhecida como erva baleeira que é popularmente utilizada em Santa Catarina para tratamento de tumores e inflamações. Para se atingir tal objetivo foram realizados experimentos para avaliar a atividade citotóxica e antiproliferativa in vitro e antitumoral in vivo. Para tanto, realizou-se os ensaios de viabilidade celular (MTT) em células de tumor ascítico de Ehrlich (TAE) e MCF-7, proliferação celular (incorporação de [3H] timidina) e capacidade pró-poptótica (Brometo de etídio/Laranja de acridina (BE/LA)) em células TAE. Além disso, verificou-se o possível efeito dos extratos sobre o DNA plasmidial (atividade nucleásica) assim como a capacidade protetora do extrato sobre o DNA (com a geração de espécies reativas de oxigênio com Fe-EDTA). Foi avaliada a expressão da COX-2 através de Wertern blot em células MCF-7. A determinação da atividade antitumoral in vivo foi realizada em camundongos Balb/c inoculados com o TAE e tratados com extrato bruto (EB) e supercrítico (ESC) nas concentrações de 37,5; 75 e 150 mg/Kg. Nos ensaios do MTT e incorporação de timidina triciada os resultados demonstraram que o EB e ESC reduziram de maneira significativa a viabilidade e proliferação celular. A coloração com BE/LA revelou que o provável tipo de morte celular induzida pelos tratamentos trata-se de apoptose, uma vez que a grande maioria das células adquiriram uma coloração laranja-avermelhada, característica de células apoptóticas. Os extratos mostraram-se ineficazes no teste de ativação nucleásica. O ESC foi capaz de reduzir significativamente a expressão da COX-2 em células MCF-7. Os ensaios in vivo demonstram que tanto EB quanto ESC apresentaram efeitos antitumorais, sendo os melhores resultados observados para a dose de 150 mg/Kg. O tratamento com os extratos também causou importante inibição do crescimento tumoral nos camundongos, principalmente o ESC. EB e ESC elevaram a proporção de células inviáveis/viáveis em mais de duas vezes quando comparado ao controle negativo. EB e ESC aumentaram o tempo médio de sobrevida e a concentração de GSH. De acordo com os resultados podemos concluir que ESC apresentou atividade antitumoral mais potente que o extrato bruto. Os resultados obtidos foram favoráveis à validação da utilidade de C. verbenacea como potencial agente antitumoral. Além disso, foi considerado que o método de extração supercrítica pode aprimorar a atividade antitumoral de C. verbenacea, como demonstrado com os resultados apresentados acima, uma vez que estes efeitos provavelmente se devam à presença de ?-humuleno e ?-cariofileno presente nos extratos, especialmente no extrato supercrítico. Também a partir dos resultados obtidos podemos supor que um possível mecanismo de ação antitumoral dos extratos possa ser a redução da expressão da COX-2, o que poderia levar a um bloqueio da sobrevivência celular e indução da apoptose

Ação da intervenção antioxidante na síndrome de Down

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2015.A Síndrome de Down (SD) é a mais frequente desordem genética humana, e é causada, na sua quase totalidade, pela trissomia do cromossomo 21. A geração excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs) está envolvida na patogenia da SD. O objetivo deste estudo foi (I) avaliar o status antioxidante no sangue de crianças e adolescentes SD, antes e após a suplementação com vitaminas E e C, (II) bem como o efeito da administração de melatonina (MEL) sobre os biomarcadores de estresse oxidativo (EO) e de neurogênese, em um modelo animal de SD (camundongos Ts65Dn). Biomarcadores de EO e níveis de citocinas inflamatórias foram avaliados em pacientes com SD (n=21), antes e após suplementação diária (vitamina E 400 mg, C 500 mg) durante 6 meses, seguida de interrupção da terapia (por 6 meses) e posteriormente submetidos a uma nova intervenção antioxidante de 6 meses. Crianças saudáveis (n=18) sem SD foram recrutadas para constituir o grupo controle. As atividades da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST), gama-glutamiltransferase (GGT), glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e mieloperoxidase (MPO), assim como os conteúdos de glutationa reduzida (GSH), ácido úrico (AU), vitamina E, substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteína carbonilada (PC), transferrina, TNF-a e IL-1ß, foram mensuradas no sangue destes indivíduos. Antes da suplementação, os indivíduos SD, apresentaram aumento da atividade enzimática da SOD, CAT, GR, GGT e MPO, assim como dos níveis séricos de AU, transferrina, TNF-a e IL-1ß enquanto que a atividade da GST e os níveis de GSH e PC mostraram valores diminuídos. No entanto, as atividades da GPx e G6PD, assim como os níveis plasmáticos de vitamina E e TBARS, não apresentaram diferenças significativas em comparação aos controles. Após a suplementação antioxidante, as atividades das enzimas SOD, CAT, GPx, GR, GGT e MPO, bem como o conteúdo de TBARS foram diminuídos, as atividades da G6PD e GST, e os níveis de AU, PC, transferrina, TNF-a e IL-1ß permaneceram inalterados, enquanto que os conteúdos de GSH e vitamina E mostraram significativo aumento. Após a interrupção da suplementação, houve aumento das atividades da GPx e GGT nos indivíduos SD, assim como nos níveis de AU e TBARS. Nenhuma mudança foi observada nas atividades da SOD, CAT, GR, GST, G6PD e MPO, bem como nos níveis de GSH, vitamina E, PC,transferrina, TNF-a e IL-1ß. Após nova suplementação, houve aumento dos níveis plasmáticos de vitamina E e diminuição da atividade da GGT nenhuma alteração nas atividades da SOD, CAT, GPx, GR, G6PD, GST e MPO, assim como nos conteúdos de GSH, AU, transferrina, TBARS, PC, TNF-a e IL-1ß. Para o estudo da MEL foram utilizados animais jovens e adultos. Para ambas as idades, foram utilizados dois grupos de camundongos com genótipos diferentes, Controles (Dissômicos) e Ts65Dn (Trissômicos), os quais foram subdividos e tratados com veículo (água contendo 0,06% etanol) e/ou MEL (100 mg/L), formando 4 grupos experimentais: CO+Veículo, CO+Mel, TS+Veículo e TS+Mel. Para os jovens, o tratamento ocorreu desde a fase pré-natal com as fêmeas prenhas e se estenderam até a idade de experimento (5,5 meses de idade). Já para os adultos o tratamento iniciou com 5,5 e perdurou até 10,5 meses de idade. Tanto para jovens e adultos, foram avaliados biomarcadores de EO no córtex e hipocampo do cérebro desses animais. A neurogênese dos animais jovens (em adultos são dados já publicados) foi avaliada através de imunohistoquímica para Ki-67 (proteína nuclear, expressa em células em mitose) e DAPI (marcador nuclear) no hipocampo desses animais. A administração de MEL diminuiu a atividade da SOD e CAT enquanto não houve mudanças na atividade da GPx e GR e nos níveis de TBARS e PC no córtex e hipocampo. Nos animais adultos, o tratamento com a MEL diminuiu a atividade da SOD apenas no córtex, assim como os níveis de TBARS e PC no hipocampo desses animais, enquanto não houve mudanças na atividade da CAT, GPx e GR no córtex e hipocampo desses animais. Não houve mudanças na densidade de células Ki-67 e DAPI após tratamento com MEL nos animais jovens. Conclusão: (I) A presença da trissomia 21 em crianças e adolescentes resultou em alterações bioquímicas que contribuem para o EO sistêmico e exacerbado nesses pacientes. (II) A terapia antioxidante com vitaminas E e C após 6 meses atenuou o EO. Adicionalmente, (III) o efeito da intervenção antioxidante persistiu significativamente após 6 meses de interrupção da suplementação. (IV). No estudo com camundongos TS também foi observado aumento do EO nos camundongos TS. A MEL foi capaz de diminuir o EO causado pela TS, especialmente nos animais adultos. Além disso, (V) o tratamento com a MEL não modificou a neurogênese nos animais jovens.Abstract : Down syndrome (DS), the most frequent genetic disorder, is almost entirely caused by trisomy of human chromosome 21. The overgeneration of reactive oxygen species (ROS) is involved in DS pathogenesis. The aim of this study was (I) to evaluate biomarkers of oxidative stress (OS) in the blood of DS children and adolescents before and after an antioxidant supplementation with vitamins E and C, as well as (II) the effect of administration of melatonin (MEL) on OS biomarkers and neurogenesis in an SD animal model (Ts65Dn mice). Biomarkers of OS and contents of inflammatory cytokines were evaluated in the blood of DS patients (n=21) before and after a daily antioxidant intervention (vitamin E 400 mg, vitamin C 500 mg) during 6 months followed by an interruption of the supplementation (also 6 months), followed by a new supplementation (6 months). Healthy children (n=18) without DS were recruited to constitute the control group. The activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferase (GST), gamma-glutamyltransferase (GGT), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and myeloperoxidase (MPO), as well as the contents of reduced glutathione (GSH), uric acid (UA), vitamin E, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), protein carbonyls (PC), transferrin, TNF-a and IL-1ß, were measured. Before the antioxidant therapy DS patients showed elevated SOD, CAT, GR, GGT and MPO activity and also elevated UA, transferrin, TNF-a and IL-1ß levels. The GST activity, GSH and PC levels were decreased, while GPx and G6PD activity and also plasma levels of vitamin E and TBARS showed no significant differences compared to controls. After the antioxidant supplementation, the activity of SOD, CAT, GPx, GR, GGT and MPO were downregulated, while TBARS contents were strongly decreased. No changes in G6PD and GST activities as well as in UA, PC, transferrin, TNF-a and IL-1ß levels were detected, while the contents of GSH and vitamin E were significantly increased. After interruption of the antioxidant therapy, DS patients showed elevated GPx and GGT activities as well as elevated UA and TBARS levels, while no changes in SOD, CAT, GR, GST, G6PD and MPO activities as well as in GSH, vitamin E, PC, transferrin, TNF-a and IL-1ß levels were detected. After the new period of supplementation there was an increase in plasma levels of vitamin E and decreased GGT activity, while nochanges in SOD, CAT, GPx, GR, G6PD, GST and MPO activity as well as in the contents of GSH, UA, transferrin, TBARS, PC, TNF-a and IL-1ß. The MEL intervention in young and adult animals used two groups of mice with different genotypes, controls (euploid littermates) and Ts65Dn (with trisomy), which were subdivided and treated with vehicle (water containing 0.06% ethanol) and/or MEL (100 mg/L), forming four groups: CO+Vehicle, CO+MEL, TS+Vehicle and TS+MEL. For young animals treatment occurred from the pre-natal stage with pregnant females and extended until the age of experiment (5.5 months), while for adults the treatment began and lasted 5.5 to 10.5 months of age. Both young and adults were assessed through OS biomarkers in the cortex and hippocampus. Neurogenesis of young animals (in adults data were already published) was assessed by immunohistochemistry for Ki-67 (nuclear protein expressed in cells in mitosis) and DAPI (nuclear marker) in the hippocampus. MEL administration decreased SOD and CAT activity while no changes in the activity of GPx and GR, as well as in levels of TBARS and PC in the cortex and hippocampus were detected. In adults MEL treatment promoted decreased SOD activity only in the cortex, as well as TBARS and PC levels in the hippocampus, whereas no changes in the CAT, GPx and GR activity in the cortex and hippocampus were detected. No changes in the density of Ki-67 and DAPI cells after treatment with MEL in young animals. Conclusions: (I) The presence of trisomy 21 in children and adolescents results in biochemical changes that strongly contributes to a systemic and exacerbated oxidative stress in these patients. (II) The antioxidant intervention with vitamins E and C for 6 months consistently attenuated such oxidative insult. Furthermore, (III) the effect of the antioxidant intervention persisted after 6 months of withdrawal of the antioxidant supplementation. (IV) In the study with TS mice, increased OS in brain was also observed. (V) MEL was able to decrease OS caused by TS, especially in adult animals, while it did not alter neurogenesis in young animals

Antioxidant therapy attenuates oxidative insult caused by benzonidazole in chronic Chagas` heart disease

Chronic chagasic cardiac patients are exposed to oxidative stress that apparently contributes to disease progression. Benznidazole (BZN) is the main drug used for the treatment of chagasic patients and its action involves the generation of reactive species. 41 patients with Chagas` heart disease were selected and biomarkers of oxidative stress were measured before and after 2 months of BZN treatment (5 mg/kg/day) and the subsequent antioxidant supplementation with vitamin E (800 UI/day) and C (500 mg/day) during 6 months. Patients were classified according to the modified Los Andes clinical hemodynamic classification in groups IA, IB, II and III, and the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione S-transferase (GST) and glutathione reductase (GR), as well as the contents of reduced glutathione (GSH), thiobarbituric acid reactive species (TBARS), protein carbonyl (PC), vitamin E and C and nitric oxide (NO), myeloperoxidase (MPO) and adenosine deaminase (ADA) activities were measured in their blood. Excepting in group III, after BZN treatment SOD, CAT, GPx and GST activities as well as PC levels were enhanced while vitamin E levels were decreased in these groups. After antioxidant supplementation the activities of SOD, GPx and GR were decreased whereas PC, TBARS, NO, and GSH levels were decreased. In conclusion, BZN treatment promoted an oxidative insult in such patients while the antioxidant supplementation was able to attenuate this effect by increasing vitamin E levels, decreasing PC and TBARS levels, inhibiting SOD, GPx and GR activities as well as inflammatory markers, mainly in stages with less cardiac involvement. (C) 2009 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico)/MCT/Ministério da Saúde MS-SCTIE-DECITCNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico)/MCT/Ministério da Saúde MS-SCTIE-DECIT[409266/2006-0]CNPq[305018/2006-0]Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)PIBIC-CNP

Selenylated Imidazo [1,2-<i>a</i>]pyridine Induces Apoptosis and Oxidative Stress in 2D and 3D Models of Colon Cancer Cells

Colon cancer incidence rates are increasing annually, a scenario aggravated by genetic and epigenetic alterations that promote drug resistance. Recent studies showed that novel synthetic selenium compounds are more efficient and less toxic than conventional drugs, demonstrating biocompatibility and pro-oxidant effects on tumor cells. This study aimed to investigate the cytotoxic effect of MRK-107, an imidazo [1,2- a]pyridine derivative, in 2D and 3D cell culture models of colon cancer (Caco-2 and HT-29). Sulforhodamine B results revealed a GI50 of 2.4 µM for Caco-2, 1.1 µM for HT-29, and 22.19 µM for NIH/3T3 in 2D cultures after 48 h of treatment. Cell recovery, migration, clonogenic, and Ki-67 results corroborated that MRK-107 inhibits cell proliferation and prevents cell regeneration and metastatic transition by selectively reducing migratory and clonogenic capacity; non-tumor cells (NIH/3T3) re-established proliferation in less than 18 h. The oxidative stress markers DCFH-DA and TBARS revealed increased ROS generation and oxidative damage. Caspases-3/7 are activated and induce apoptosis as the main mode of cell death in both cell models, as assessed by annexin V-FITC and acridine orange/ethidium bromide staining. MRK-107 is a selective, redox-active compound with pro-oxidant and pro-apoptotic properties and the capacity to activate antiproliferative pathways, showing promise in anticancer drug research

Selenylated Imidazo[1,2<i>-a</i>]pyridine Induces Cell Senescence and Oxidative Stress in Chronic Myeloid Leukemia Cells

Imidazo[1,2-a]pyridines (IPs) have been studied regarding drug development. The objective of this work was to evaluate the antileukemic capacity of IP derivatives by screening their ability as a pro-oxidant. IP derivatives were synthesized and oral bioavailability and toxicity were analyzed in silico. Redox screening was performed on human Kasumi, KG-1, K562, and Jurkat leukemia cells. The IP derivative and the most responsive leukemic cell were selected for cytotoxicity, cell proliferation, cell senescence, and oxidative stress assays. The predictive toxicity analysis showed a possible effect on the reproductive system, but without mutagenic, carcinogenic, or irritability effects. MRK-107 against K562 cells was the compound that showed the best redox profile. MRK-107 did not induce cell death in K562 and monocyte cells. However, this compound was able to decrease cell proliferation and increase cell senescence after 48 and 72 h. Furthermore, MRK-107 induced oxidative stress in K562 cells after 72 h, increasing lipid peroxidation and decreasing reduced glutathione (GSH) contents. This study demonstrated that MRK-107-induced senescence with the involvement of oxidative stress is a possible mechanism of action, addressing this compound as a potential antitumor drug against chronic myeloid leukemia