Toxinas proteicas del veneno de serpientes del género Dendroaspis que reconocen receptores colinérgicos muscarínicos

Hace diez años se reportó la existencia de dos proteínas, MTx1 y MTx2, del veneno de la mamba verde oriental (Dendroaspis angusticeps) que inhibieron la unión de ligandos muscarínicos en cerebro de rata. Actualmente se han aislado más de diez toxinas muscarínicas (MTxs) de la mamba verde oriental, la mamba negra (D. polylepis) y la mamba verde occidental (D. viridis). Estas toxinas poseen 65-66 aminoácidos, con cuatro puentes disulfirro que les confieren una estructura de "tres dedos", tal como las α-neurotoxinas (bloqueantes de receptores nicotínicos), las dendrotoxinas (bloqueantes de canales de K+) y las fasciculinas (inhibidoras de la acetilcolinesterasa). Existen cinco subtipos de receptores colinérgicos muscarínicos (m1-m5), aunque sólo pueden discriminarse dificilmente cuatro subtipos farmacológicos (M1-M4) por agentes poco selectivos, que no pemiiten una clasificación confiable y, en consecuencia, una identificación clara. Nuestros experimentos de unión especifica en tejidos nativos pemiitieron sugerir que ambas toxinas, MTxl y MTx2, se unen selectivamente al subtipo farmacológico M1 de receptor muscarínico. Luego demostramos que ambas toxinas presentan alta afinidad y selectividad por los receptores muscarínicos humanos clonados m1 y m4, con muy bajas afinidades relativas por los otros. Estos resultados se confirmaron por experimentos de unión específica en diferentes tejidos centrales y periféricos de rata y conejo; se demostró una unión de alta afinidad en el hipocampo, rico en receptores m1 y m4, y en el estriado, rico en m4, pero no se observó interacción en páncreas, rico en m3, ni en auricula, rica en m2. El patrón de selectividad de MTxl fue m1 ≈ m4 >> m5 > m3, m2, siendo MTxl más potente que MTx2, pero con menor capacidad discriminativa entre m1 y m4. Tanto MTxl como MTx2 se comportaron como agonistas muscarínicos, facilitando la consolidación de la memoria cuando se inyectaron en el hipocampo de ratas entrenadas en una tarea de evitación inhibitoria. En el conducto deferente de conejo las toxinas actuaron como McN-A 343 y CPCP, agonistas relativamente selectivos por el receptor M1, reduciendo las contracciones fásicas del músculo liso, aunque los efectos de las toxinas no resultaron reversibles. En la misma preparación, las MTxs parecieron tener un efecto sobre los receptores adrenérgicos, que fue reversible. Además, MTxl y MTx2 resultaron capaces de desplazar la unión de ³H-prazosin, un antagonista α-adrenérgico, a membranas de corteza cerebral y conducto deferente de rata y conejo. La unión de MTxl y MTx2 a los receptores muscarínicos resultó irreversible, mientras que a los adrenérgicos resultó reversible. Recientemente hemos aislado dos fracciones proteicas (7000-8000 Da) del veneno de D. viridis que parecen ser ligandos potentes y específicos para subtipos de receptores muscarínicos. Una de ellas, DvMT4, mostró selectividad por el subtipo m4, mientras que otra, DvMT3-4, exhibió selectividad por los subtipos m3 y m4. Dada la carencia de agentes muscarínicos selectivos, estas MTxs resultan muy útiles para localizar y mapear subtipos muscarínicos en el sistema nervioso central, para caracterizados y estudiar sus funciones en órgano aislado o in vivo. La familia de las Msz ha ido creciendo rápidamente y parecen ser ligandos selectivos extremadamente promisorios para el estudio del rol y la distribución de los subtipos de receptores muscarínicos. La comparación de las secuencias permitió definir importantes residuos y regiones de las toxinas, probablemente responsables de su selectividad y acción agonista/antagonista. Esto podría llevar al desarrollo de nuevos ligandos muscarínicos aún más selectivos, tal vez más apropiados como agentes terapéuticos

Protein toxins from the venom of dendroaspis snakes that recognize cholinergic muscarinic receptors

Hace diez años se reportó la existencia de dos proteínas, MTx1 y MTx2, del veneno de la mamba verde oriental (Dendroaspis angusticeps) que inhibieron la unión de ligandos muscarínicos en cerebro de rata. Actualmente se han aislado más de diez toxinas muscarínicas (MTxs) de la mamba verde oriental, la mamba negra (D. polylepis) y la mamba verde occidental (D. viridis). Estas toxinas poseen 65-66 aminoácidos, con cuatro puentes disulfirro que les confieren una estructura de "tres dedos", tal como las α-neurotoxinas (bloqueantes de receptores nicotínicos), las dendrotoxinas (bloqueantes de canales de K+) y las fasciculinas (inhibidoras de la acetilcolinesterasa). Existen cinco subtipos de receptores colinérgicos muscarínicos (m1-m5), aunque sólo pueden discriminarse dificilmente cuatro subtipos farmacológicos (M1-M4) por agentes poco selectivos, que no pemiiten una clasificación confiable y, en consecuencia, una identificación clara. Nuestros experimentos de unión especifica en tejidos nativos pemiitieron sugerir que ambas toxinas, MTxl y MTx2, se unen selectivamente al subtipo farmacológico M1 de receptor muscarínico. Luego demostramos que ambas toxinas presentan alta afinidad y selectividad por los receptores muscarínicos humanos clonados m1 y m4, con muy bajas afinidades relativas por los otros. Estos resultados se confirmaron por experimentos de unión específica en diferentes tejidos centrales y periféricos de rata y conejo; se demostró una unión de alta afinidad en el hipocampo, rico en receptores m1 y m4, y en el estriado, rico en m4, pero no se observó interacción en páncreas, rico en m3, ni en auricula, rica en m2. El patrón de selectividad de MTxl fue m1 ≈ m4 >> m5 > m3, m2, siendo MTxl más potente que MTx2, pero con menor capacidad discriminativa entre m1 y m4. Tanto MTxl como MTx2 se comportaron como agonistas muscarínicos, facilitando la consolidación de la memoria cuando se inyectaron en el hipocampo de ratas entrenadas en una tarea de evitación inhibitoria. En el conducto deferente de conejo las toxinas actuaron como McN-A 343 y CPCP, agonistas relativamente selectivos por el receptor M1, reduciendo las contracciones fásicas del músculo liso, aunque los efectos de las toxinas no resultaron reversibles. En la misma preparación, las MTxs parecieron tener un efecto sobre los receptores adrenérgicos, que fue reversible. Además, MTxl y MTx2 resultaron capaces de desplazar la unión de ³H-prazosin, un antagonista α-adrenérgico, a membranas de corteza cerebral y conducto deferente de rata y conejo. La unión de MTxl y MTx2 a los receptores muscarínicos resultó irreversible, mientras que a los adrenérgicos resultó reversible. Recientemente hemos aislado dos fracciones proteicas (7000-8000 Da) del veneno de D. viridis que parecen ser ligandos potentes y específicos para subtipos de receptores muscarínicos. Una de ellas, DvMT4, mostró selectividad por el subtipo m4, mientras que otra, DvMT3-4, exhibió selectividad por los subtipos m3 y m4. Dada la carencia de agentes muscarínicos selectivos, estas MTxs resultan muy útiles para localizar y mapear subtipos muscarínicos en el sistema nervioso central, para caracterizados y estudiar sus funciones en órgano aislado o in vivo. La familia de las Msz ha ido creciendo rápidamente y parecen ser ligandos selectivos extremadamente promisorios para el estudio del rol y la distribución de los subtipos de receptores muscarínicos. La comparación de las secuencias permitió definir importantes residuos y regiones de las toxinas, probablemente responsables de su selectividad y acción agonista/antagonista. Esto podría llevar al desarrollo de nuevos ligandos muscarínicos aún más selectivos, tal vez más apropiados como agentes terapéuticos.Ten years ago, two proteins from the venom of the Eastern green mamba snake (Dendroaspis angusticeps), MTxl and MTx2, which inhibited the binding of muscarinic ligands to rat brain, were reported. Actually, more than ten muscarinic toxins (Msz) have been isolated from Eastern green mamba, black mamba (D. polylepis) and Western green mamba (D. viridis). All these toxins have 65-66 aminoacids, with four disulphide bonds that confer a “three fingered” structure, shared by α-neurotoxins (nicotinic receptor blockers), dendrotoxins (K+ channel blockers) and fasciculins (acetylcholinesterase inhibitors). There are five muscarinic acetylcholine receptor subtypes (m1-m5), although only four pharmacological subtypes (M1-M4) are hardly discriminated by poorly selective agents, not enough to enable a reliable classification and a defined identification. From radioligand binding experiments in native tissues we have suggested that both toxins, MTxl and MTx2, bound selectively to M1 pharmacological subtype of muscarinic receptor. Then, we demonstrated that both toxins have high affinity and selectivity for m1 and m4 cloned human muscarinic receptors, with rather low relative affinity for the others. These results were confirmed by binding experiments in different central and peripheral tissues from rat and rabbit. High affinity binding was found in the hippocampus, rich in m1 and m4 receptors, and striatum, rich in m4, but no interaction was found in pancreas, rich in m3, nor in atria, rich in m2.The pattern of selectivity of MTxl was m1 ≈ m4 >> m5 > m3, m2, being MTxl more potent than MTx2, but less discriminative between m1 and m4. Both MTxl and MTx2 behaved as muscarinic agonists when infused into the hippocampus of rats trained in an inhibitory avoidance task, facilitating memory consolidation. On rabbit vas deferens the toxins acted as the relatively M1 selective agonists McN-A 343 and CPCP in reducing the twitch response of the smooth muscle, but the effects of toxins were not reversible. In the same preparation, MTxs seemed to have an effect on adrenergic receptors. Then it was shown that MTxl and MTx2 were able to displace ³H-prazosin binding, an α-adrenergic antagonist, to rat and rabbit cerebral cortex and vas deferens membranes. However, MTxl and MTx2 binding to muscarinic receptors appear irreversible, while it was reversible to adrenergic receptors. Recently, we have isolated two protein fractions (7000-8000 Da) from D. viridis venom that appear to be potent and specific ligands for subtypes of muscarinic receptors. One of them, DvMT4, showed selectivity for m4 subtype, while the other, DvMT3-4, exhibited selectivities for both m3 and m4 subtypes. Due to the lack of selective muscarinic agents, MTxs are useful to localise and to map muscarinic receptor subtypes in the central nervous system, to characterise them and to study their functions either in isolated organs or in vivo. The MTx family has been rapidly growing up and they appear as extremely promising selective ligands to study the role and distribution of muscarinic receptor subtypes. The comparison of sequences allowed to define important residues or regions in the toxins, putatively responsible of their selectivity and agonist/antagonist action. This would lead to the development of new more selective muscarinic ligands, that would likely be more appropriate as therapeutic agents.Fil:Kornisiuk, Edgar E.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina