Transcriptomic profile analysis, validation of reference genes and differential gene expression of Prunus spp. under stress by soil flooding

The State of Rio Grande do Sul is the largest producer of peaches from Brazil. However, it still has low values of productivity when compared to other States. One of the problems associated to it this is the occurrence of drainage soils problems, mainly in Pelotas and its surroundings, which depending on the time of year, it may suffer flooding situations, potentially hampering the development and productivity such culture. In soil flooding situations, oxygen becomes insufficient for roots, damaging the process of cellular respiration and may lead the cells to an energy crisis. In addition, global climate change is affecting the climate, and such changes are expected to increase the frequency and severity of flood events in many of the agricultural regions. For studies to assist in the selection of flood tolerant genotypes, it is essential to understand the physiological and molecular changes of the plants in situations of oxygen deprivation. Thus, in the present work three studies were conducted, which had as aim the characterization of physiological and molecular responses in five Prunus spp. rootstocks under soil flooding. The first study aimed to obtain the transcriptomic profile on leaves of 'Capdeboscq' peach and 'Julior' plum submitted to flooding for 48 hours using the RNA-Seq technique. From this analysis, 3,011 differentially expressed genes (DEGs) were identified for 'Capdeboscq' (sensitive), which 1,566 were up-regulated and 1,445 down-regulated, and 251 DEGs for 'Julior' (stress tolerant), 125 being up-regulated and 126 down-regulated. 'Capdeboscq' activated signaling pathways, but photosynthesis was the most affected process at physiological and molecular level presenting a higher number of down-regulated enriched Gene Ontology (GO) terms. 'Julior' was more efficient in triggering defense responses, which included the activation of flavonoid biosynthesis pathways, according to KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) metabolic pathways and GOs terms. The LSD transcription factors family seems to be a key point in elucidating the defense mechanisms against stress among the families identified in this study. The protein-protein interaction network of 'Capdeboscq' showed high degrees of interaction and indicate the high probability of some identified nodes being hubs. In the second study, eight candidate genes for expression stability were studied for RT-qPCR studies on leaves and roots of four Prunus spp. submitted to soil flooding by 0, 6, 12, 24, 48, 72, 120 and 192h. In general, for the studied peach cultivars (Capdeboscq and NR0170401), CYP2 and RPII were the most stable genes, whereas for plums 'Marianna 2624' and 'Mirabolano 29-C', RPL13 and RPII were the most stable, indicating their use as reference genes. Expression validation was performed on LDH1 and ADH1 genes and these have confirmed the importance of studies for selection of reference genes to achieve the appropriate results. In the third study, physiological parameters and expression of nine genes involved in glycolytic, fermentative, and ethylene synthesis pathways in 'NR0170401', 'Marianna 2624' and 'Mirabolano 29-C' were evaluated in the same experimental conditions of the second study. The three evaluated rootstocks activated the fermentative metabolism in the first six hours of the experiment, and the root tissues were more affected compared to leaves. 'Marianna 2426' appears to have a more efficient gene response system compared to the other cultivars studied under oxygen deprivation conditions.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESO estado do Rio Grande do Sul é o detentor da maior produção de pêssegos do Brasil, entretanto ainda possui valores baixos de produtividade, quando comparado com outros estados. Um dos problemas associados a isto é a ocorrência de solos com problemas de drenagem, principalmente na região de Pelotas, que dependendo do período do ano, podem sofrer situações de alagamento, prejudicando potencialmente o desenvolvimento e a produtividade da cultura. Em situações de alagamento do solo, o oxigênio se torna insuficiente para raízes, prejudicando o processo de respiração e podendo levar as células a uma crise energética. Somado a isso, é sabido que as mudanças climáticas vêm alterando o clima global, sendo esperado que tais alterações aumentem a frequência e a gravidade dos eventos de inundação em muitas regiões agriculturáveis do planeta. Para que estudos possam auxiliar na seleção de genótipos tolerantes ao alagamento, é de fundamental importância entender as alterações fisiológicas e moleculares das plantas em situações de privação de oxigênio. Desta forma, no presente trabalho foram conduzidos três estudos, os quais tiveram como objetivo a caracterização de respostas dos parâmetros de trocas gasosas e moleculares em cinco porta-enxertos de Prunus spp. submetidos ao alagamento do solo. No primeiro estudo objetivou-se obter o perfil transcriptômico em folhas dos porta-enxertos de pessegueiro ‘Capdeboscq’ e da ameixeira ‘Julior’ submetidos ao alagamento por 48 horas, através do uso da técnica de RNA-Seq. Desta análise, foram identificados 3.011 genes diferencialmente expressos (DEGs) para ‘Capdeboscq’ (sensível), onde 1.566 foram up-regulated e 1.445 down-regulated, e 251 DEGs para ‘Julior’ (tolerante ao estresse), sendo 125 up-regulated e 126 downregulated. Embora tenha ativado vias de sinalização, ‘Capdeboscq’ teve a fotossíntese como o processo mais afetado em nível fisiológico e molecular apresentando maior número de termos GOs (Gene Ontology) enriquecidos down-regulated. ‘Julior’ foi mais eficiente ao conseguir acionar respostas de defesa, as quais incluíram a ativação de vias de biossíntese de flavonoides, segundo a análise funcional de vias metabólicas do KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) e termos GOs. A família de fatores de transcrição LSD parece ser um ponto-chave na elucidação dos mecanismos de defesa frente ao estresse, dentre as famílias identificadas neste estudo. A rede de interação proteína-proteína de ‘Capdeboscq’ apresentou altos graus de interação e indicam a grande probabilidade de alguns nós identificados serem hubs. No segundo estudo, foram testados oito genes candidatos à referência quanto a estabilidade de expressão para estudos de RT-qPCR em folhas e raízes de quatro porta-enxertos de Prunus spp. submetidos ao alagamento do solo por 0, 6, 12, 24, 48, 72, 120 e 192h. No geral, para as cultivares de pessegueiro estudadas (Capdeboscq e NR0170401) CYP2 e RPII foram os genes que apresentaram maior estabilidade, enquanto que para as ameixeiras ‘Marianna 2624’ e ‘Mirabolano 29-C), RPL13 e RPII foram os mais estáveis, indicando a sua utilização como genes normalizadores. Realizou-se a validação de expressão em LDH1 e ADH1 e estes confirmaram a importância estudos para seleção de genes de referência para atingir os resultados adequados. No terceiro estudo, foram avaliados parâmetros fisiológicos e expressão de nove genes envolvidos nos metabolismos glicolítico, fermentativo e de síntese de etileno em ‘NR0170401’, ‘Marianna 2624 e ‘Mirabolano 29-C’ nas mesmas condições experimentais do segundo estudo. Os três porta-enxertos avaliados ativaram o metabolismo fermentativo já nas seis horas iniciais de experimento, sendo que os tecidos radiculares são mais afetados em comparação com folhas. ‘Marianna 2426’ aparenta ter um sistema de resposta gênico mais eficiente em comparação com as demais cultivares estudadas em condições de privação de oxigênio

Gas exchange parameters and transcriptomic profile of Prunus spp. rootstock under water stress

The State of Rio Grande do Sul is the largest producer of peaches from Brazil. However, it still has low values of productivity when compared to other States. One of the problems associated to it this is the occurrence of drainage soils problems, mainly in Pelotas and its surroundings, which depending on the time of year, it may suffer water shortage situations or flooding, potentially hampering the development and productivity such culture. Among the harmful effects caused by these stresses, the decrease in liquid assimilatory rate, closing of stomata, reduction of cellular activities, production of reactive oxygen species and destabilization of membranes and proteins are included. Such effects have a delicate adjustment that takes place at the molecular level, where genes and transcription factors (TFs) modulate the differential gene expression under stressful conditions. Thus, the aim of this study was to investigate in which magnitude gas exchange parameters and Prunus spp. rootstock transcriptomic are differentially influenced under stress by drought and flooding. The study was divided into two experiments. In the first one, gas exchange parameters were evaluated in three Prunus spp. rootstock (' Capdeboscq ', ' Julior ' and ' Marianna 2624 ') under control conditions of soil water deficit and flooding for seven days. Overall, the three rootstocks have shown to be more susceptible to flooding than water deficit, only varying in response time, which is intrinsic to each genotype. The second one, aimed to obtain the transcriptomic profile and evaluate the TFs expression in peach rootstock leaves ' Capdeboscq ' subjected to flooding during 48 hours, through RNA sequencing (RNA-Seq) technique. This analysis identified 2,971 (DEGs) differentially expressed genes, among them 1,559 were up-regulated and 1,412 were down-regulated. It was possible to observe a strong effect on photosynthesis, which presented numerous down-regulated genes. TFS bHLH families members, ERF, NAC, WRKY, HD-Zip, NAC and MYB_related were the most affected by stress, showing both setting up and down-regulated.Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPqO estado do Rio Grande do Sul é o detentor da maior produção de pêssegos do Brasil, entretanto ainda possui valores baixos de produtividade, quando comparado com outros estados. Um dos problemas associados a isto é a ocorrência de solos com problemas de drenagem, principalmente na região de Pelotas, que dependendo do período do ano, podem sofrer situações de déficit hídrico ou de alagamento, prejudicando potencialmente o desenvolvimento e a produtividade da cultura. Dentre os efeitos prejudiciais causados por estes estresses, destacam-se a diminuição na taxa assimilatória líquida, fechamento de estômatos, redução das atividades celulares, produção de espécies reativas de oxigênio e desestabilização de membranas e proteínas. Tais efeitos possuem uma delicada regulação que transcorre ao nível molecular, onde genes e fatores de transcrição (TFs) modulam a expressão gênica diferencial sob condições estressantes. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi investigar em que magnitude os parâmetros de trocas gasosas e o perfil transcriptômico de portaenxertos de Prunus spp. são influenciados diferencialmente sob estresse por seca e alagamento. O trabalho foi dividido em dois experimentos. No primeiro experimento foram avaliados parâmetros de trocas gasosas em três portaenxertos de Prunus spp. („Capdeboscq‟, „Julior‟ e „Marianna 2624‟), nas condições controle, de déficit hídrico e alagamento do solo durante sete dias. No geral, os três portaenxertos demonstraram ser mais suscetíveis ao alagamento do que ao déficit hídrico, apenas variando no tempo de resposta, o qual é intrínseco a cada genótipo. No segundo experimento objetivou-se obter o perfil transcriptômico e avaliar a expressão de TFs em folhas do portaenxerto de pessegueiro „Capdeboscq‟ submetido ao alagamento durante 48 horas, através da técnica de sequenciamento massivo de RNA (RNA-Seq). Desta análise foram identificados 2.971 genes diferencialmente expressos (DEGs), sendo 1.559 up-regulated e 1.412 down-regulated. Foi possível observar forte efeito sob a fotossíntese, a qual apresentou inúmeros genes down-regulated. TFs membros das famílias bHLH, ERF, NAC, WRKY, HD-Zip, NAC e MYB_related foram os mais afetados pelo estresse, apresentando regulação tanto up quanto down-regulated

EVALUATION OF GAS EXCHANGES IN DIFFERENT Prunus SPP. ROOTSTOCKS UNDER DROUGHT AND FLOODING STRESS

<div><p>ABSTRACT The state of Rio Grande do Sul is the largest peach productor in Brazil; however, it still possesses poor yield values when compared with other states. One of the problems associated with this is the occurrence of soils with drainage problems, mainly in Pelotas region, which depending on the year period, may undergo water deficit or flooding situations in the great majority of the years, which harm the crop development and yield. Among the harmful effects caused by these stresses stand out, the decrease in the net assimilation rate, closure of stomata, reduction of the cell activities, production of reactive oxygen species, membrane and protein destabilization. Thus, the aim of this study was to investigate in what magnitude of the gaseous exchange parameters of Prunus spp. rootstocks are influenced under drought and flood stress. In the experiment, gas exchange parameters net photosynthetic rate (A) stomata conductance (gs), intercellular carbon (Ci) and transpiration (E)] were evaluated in three Prunus spp. rootstocks (peach tree ‘Capdeboscq’ and plum trees ‘Julior’ and ‘Marianna 2624’) under three water conditions (control, water deficit and soil flooding) for seven days. The three rootstocks proved more susceptible to flooding than to water deficit, only varying in response time, which is intrinsic to each genotype, and that there is a genetic variability for the tolerance to the studied stresses. The variation on physiological response to the water deficit stress was later in both evaluated genotypes. However, in general, ‘Julior’ presented greater tolerance to both stresses when compared to the other rootstocks evaluated. Such information is useful to help in the choice of rootstocks for plant production, in the orchard management and for plant breeding programs, aiming at the selection of new genotypes with increased tolerance to these water stresses.</p></div